יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות
הערה: טכניקת תרבית תאים סטרילית צריכה להישמר בעת טיפול בתאי ההיברידימה ובמדיה באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית) עד לצעדי טיהור הנוגדנים.
1. הפשרת תאי היברידיה קפואים
- לדגור על הוויאל המכיל את תאי ההיברידיומה הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה (כ-2 דקות).
- הוסף את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של RPMI מלא (RPMI בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 100 פניצילין U /mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1mM נתרן pyruvate, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1200 סל"ד כדי לשטוף את כל אמצעי ההקפאה המזהמים.
- לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant נוזלי, ו resuspend גלולה התא 5 מ"ל טרי להשלים RPMI. לאחר מכן, הוסף את התאים לבקבוק תרבית רקמות T75 המכיל RPMI מלא של 15 מ"ל (נפח סופי של RPMI הוא 20 מ"ל).
- לגדל את התאים באינקובטור סטנדרטי ב 37 °C עם 5% CO2. תאים אינם דבקים בזמן שהם נמצאים בתרבית.
2. הרחבת הכלאה
- אפשר לתאים להתרחב במשך כ -3 ימים עד הבקבוקון הוא ~ 80% confluent.
הערה: כמות זו של זמן יכולה להשתנות בהתאם למספר ההתחלתי של תאים, כמו גם הבדלים מובנים בשיעורי הצמיחה של תאים שונים. חשוב שתאים יהיו בשלב הצמיחה המעריכי. - ברגע הבקבוקון הראשוני מגיע ~ 80% השפעה, להסיר את התאים מבקבוק T75 הראשוני הזה, למקם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט ספין (1200 סל"ד במשך 5 דקות) כדי כדורי התאים.
- resuspend התאים ב 6 מ"ל של RPMI מלא, ולאחר מכן להפיץ את ההשעיה התא לשלושה צלוחיות T75 חדשות (2 מ"ל / בקבוקון המכיל RPMI 18 מ"ל). לדגור אלה שלושה צלוחיות T75 ב 37 °C עם 5% CO2 עד שהם ~ 80% confluent (זה צריך לקחת כ 3 ימים).
3. ייצור נוגדנים במדיום ללא סרום
הערה: בשלב זה, התאים מוכנים להמשיך את צמיחתם במדיום נטול סרום המיועד לצמיחה של קווי תאים היברידיים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במדיום הנוזלי HB Basal המוכנים לשימוש וזמינים מסחרית המכילים את מוצר תוספת HB101.
- התאים מכל אחד משלושת צלוחיות T75 (ב-80% זיהום) נאספים וצנטריפוגות (1200 סל"ד למשך 5 דקות).
- כדור התא מכל בקבוקון T75 הוא resuspended 10 מ"ל בתוספת HB101 סרום בינוני ולאחר מכן הוסיף שני T225 צלוחיות בתוספת HB101 בינוני ללא סרום (כלומר 5 מ"ל השעיית תא לתוך כל אחד 6 צלוחיות המכיל ~ 220-240 מ"ל HB101 בכל בקבוק).
- המשך לגדל את התאים בבקבוקי T225 ו- HB101 ב- 37°C עם 5% CO2 במשך שלושה שבועות, או עד שתאים מתחילים למות. התאים מייצרים mAb במהלך 3 השבועות האלה ומפרשים אותו למדיום התרבותי. ברגע שהתאים מתחילים למות, הם כבר לא מייצרים mAb.
4. טיהור נוגדנים - יום 1
הערה: בשלב זה, אין צורך לשמור על סטריליות ולכן אין צורך בטיפול בתקשורת באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית). יתר על כן, הכלאות אינן נחשבות לסוכן "רמת BSL2".
- יוצקים מדיה מהבקבוקונים לצינורות לרוטור בזווית קבועה. לסובב את הצינורות בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 10,000 סל"ד במשך 8 דקות. שלב זה נועד להסיר את הפסולת התאית מן לתרבות-על.
הערה: גדלי הצינור יכולים להשתנות בהתאם לרוטור המשמש. הדבר החשוב לזכור הוא לקבל את אותו נפח בצינורות כדי להבטיח את הרוטור מאוזן כראוי לפני צנטריפוגה. סביר להניח שכל נפח המדיה לא יתאים לצנטריפוגה בבת אחת. שאר אמצעי התקשורת יצופו מאוחר יותר (שלב 4.5) באמצעות אותם צינורות. - הכן פלסטיק 2L עם בר ערבוב בדלי מוקף קרח. מניחים על צלחת ערבוב.
- צרף חלק עליון מסנן 500 מ"ל על בקבוק 1L. חברו את יחידת המסנן העליונה של הבקבוק לוואקום הביתי באמצעות צינורות מתאימים.
- יוצקים את supernatant מ שלב 4.1 (אשר עדיין מכיל את mAb המיוצר על ידי תאי hybridoma) לתוך החלק העליון של המסנן.
- המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי גלולה פסולת תא מהמדיה (הכדור ימשיך לבנות). המתן להפעלת הוואקום עד שראש המסנן יהיה מלא וקבוצה נוספת של סופר-נט-נט מוכנה לשפוך פנימה. אל תתנו למסנן להתייבש או שהסינון יהפוך לאיטי מאוד.
- כאשר בקבוק 1L קרוב למלא, להסיר את החלק העליון מסנן ולשפוך supernatant לתוך 2L כף מוכנה בשלב 4.2. א'א',ח'י את החלק העליון של המסנן. עקוב אחר אמצעי האחסון.
- חזור על שלבי המרכז והסינון עד שכל המדיה מעובדת.
- למדוד 295 גרם של אמוניום גופרתי לכל 1L של סופרנאט מסונן שנאסף. תוך כדי ערבוב, לאט להוסיף את אמוניום גופרתי על-טבעי במהלך השעות הקרובות (~ 25 גרם כל 15 דקות) כדי למנוע ריכוז גבוה מקומי של מלח אמוניום גופרתי שעלול לגרום חלבונים לא רצויים לזרז.
- לאחר הוספת כל האמוניום גופרתי, מכסים את הכיס בנייר כסף ומעבירים עם צלחת הערבוב ל-4 מעלות צלזיוס (למשל, מקרר או חדר קר). מערבבים לילה. ערבוב מתמיד של הפתרון נדרש כדי solubilize המלח, אבל ערבוב ממושך יכול להוביל denaturation של חלבונים בתמיסה על פני השטח / ממשק האוויר.
- לשטוף את הצינורות באמצעות רוטור זווית קבועה.
5. טיהור נוגדנים - יום 2
- יוצקים את האמוניום-סולפט המכיל סופר-טבעי מהכוס 2L לתוך צינורות עבור רוטור זווית קבועה. ספין בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 6500 סל"ד במשך 20 דקות ללא בלם.
- ואקום לשאוף supernatant, דואג לא למצוץ את הכדור כפי שהוא יהיה רך. המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי לאסוף גלולה מהאמוניום-גופרתי המכיל סופרנטנט.
- לאחר השאיפה האחרונה, resuspend כל גלולה (המכיל נוגדנים) ב ~ 1 מיליליטר PBS.
- הסר את אמוניום גופרתי מן פתרון mAb מזורז על ידי דיאליזה נגד כמויות גדולות של PBS. כדי לעשות זאת, לחתוך תחילה כ 1 אינץ 'של צינורות דיאליזה (למשל, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 דלתון מנותק צינורות דיאליזה תאית) עבור כל mL של פתרון mAb. הרטיבו את הצינורות עם dH2O. לקשור קשר בקצה אחד של הצינורות ולמלא עם dH2O כדי לבדוק את הקשר הזה לא דולף. ריק dH2O מהצינורות.
- פיפטה PBS / פתרון נוגדן לתוך הצינורות. לשטוף את הצינורות עם PBS נוסף 0.25 מ"ל, ולהעביר צינורות.
- אבטחו את החלק העליון של הצינורות קרוב ככל האפשר לפתרון עם קליפ דיאליזה כתום.
- הדבק את החלק העליון של הצינורות לחלק החיצוני של 4L. אפשר לחלק המלא של הצינורות להיתלות לתוך הכיס. ממלאים את הכיס ב-PBS ומוסיפים מוט ערבוב.
- מערבבים למשך הלילה כ-8 שעות ב-4°C.
- החליפו את ה-PBS בכורסה ב-PBS טרי וערבובו כ-8 שעות פעמיים נוספות.
- מעבירים את הנוגדן מהצינורות לצינורות חרוטים של 15 או 50 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד כדי להסיר כל משקעים שאולי נוצרו. מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי.
- לדלל aliquot של נוגדן 1:20 עם PBS (5 מיקרול נוגדן + 95 μl PBS). כמות ריכוז הנוגדנים עם ספקטרופוטומטר (ריק עם PBS) ב 280 ננומטר. השתמש במקדם הכחדה (ε) של 1.43. הריכוז מחושב כ
- Aliquot את הנוגדן לתוך בקבוקוני בורג cap ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד1,2,ויטני סוונסון2,3ותומאס ס. גריפית'1,2,3,4
1 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינ…
הערה: טכניקת תרבית תאים סטרילית צריכה להישמר בעת טיפול בתאי ההיברידימה ובמדיה באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית) עד לצעדי טיהור הנוגדנים.
1. הפשרת תאי היברידיה קפואים
- לדגור על הוויאל המכיל את תאי ההיברידיומה הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה (כ-2 דקות).
- הוסף את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של RPMI מלא (RPMI בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 100 פניצילין U /mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1mM נתרן pyruvate, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1200 סל"ד כדי לשטוף את כל אמצעי ההקפאה המזהמים.
- לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant נוזלי, ו resuspend גלולה התא 5 מ"ל טרי להשלים RPMI. לאחר מכן, הוסף את התאים לבקבוק תרבית רקמות T75 המכיל RPMI מלא של 15 מ"ל (נפח סופי של RPMI הוא 20 מ"ל).
- לגדל את התאים באינקובטור סטנדרטי ב 37 °C עם 5% CO2. תאים אינם דבקים בזמן שהם נמצאים בתרבית.
2. הרחבת הכלאה
- אפשר לתאים להתרחב במשך כ -3 ימים עד הבקבוקון הוא ~ 80% confluent.
הערה: כמות זו של זמן יכולה להשתנות בהתאם למספר ההתחלתי של תאים, כמו גם הבדלים מובנים בשיעורי הצמיחה של תאים שונים. חשוב שתאים יהיו בשלב הצמיחה המעריכי. - ברגע הבקבוקון הראשוני מגיע ~ 80% השפעה, להסיר את התאים מבקבוק T75 הראשוני הזה, למקם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט ספין (1200 סל"ד במשך 5 דקות) כדי כדורי התאים.
- resuspend התאים ב 6 מ"ל של RPMI מלא, ולאחר מכן להפיץ את ההשעיה התא לשלושה צלוחיות T75 חדשות (2 מ"ל / בקבוקון המכיל RPMI 18 מ"ל). לדגור אלה שלושה צלוחיות T75 ב 37 °C עם 5% CO2 עד שהם ~ 80% confluent (זה צריך לקחת כ 3 ימים).
3. ייצור נוגדנים במדיום ללא סרום
הערה: בשלב זה, התאים מוכנים להמשיך את צמיחתם במדיום נטול סרום המיועד לצמיחה של קווי תאים היברידיים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במדיום הנוזלי HB Basal המוכנים לשימוש וזמינים מסחרית המכילים את מוצר תוספת HB101.
- התאים מכל אחד משלושת צלוחיות T75 (ב-80% זיהום) נאספים וצנטריפוגות (1200 סל"ד למשך 5 דקות).
- כדור התא מכל בקבוקון T75 הוא resuspended 10 מ"ל בתוספת HB101 סרום בינוני ולאחר מכן הוסיף שני T225 צלוחיות בתוספת HB101 בינוני ללא סרום (כלומר 5 מ"ל השעיית תא לתוך כל אחד 6 צלוחיות המכיל ~ 220-240 מ"ל HB101 בכל בקבוק).
- המשך לגדל את התאים בבקבוקי T225 ו- HB101 ב- 37°C עם 5% CO2 במשך שלושה שבועות, או עד שתאים מתחילים למות. התאים מייצרים mAb במהלך 3 השבועות האלה ומפרשים אותו למדיום התרבותי. ברגע שהתאים מתחילים למות, הם כבר לא מייצרים mAb.
4. טיהור נוגדנים - יום 1
הערה: בשלב זה, אין צורך לשמור על סטריליות ולכן אין צורך בטיפול בתקשורת באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית). יתר על כן, הכלאות אינן נחשבות לסוכן "רמת BSL2".
- יוצקים מדיה מהבקבוקונים לצינורות לרוטור בזווית קבועה. לסובב את הצינורות בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 10,000 סל"ד במשך 8 דקות. שלב זה נועד להסיר את הפסולת התאית מן לתרבות-על.
הערה: גדלי הצינור יכולים להשתנות בהתאם לרוטור המשמש. הדבר החשוב לזכור הוא לקבל את אותו נפח בצינורות כדי להבטיח את הרוטור מאוזן כראוי לפני צנטריפוגה. סביר להניח שכל נפח המדיה לא יתאים לצנטריפוגה בבת אחת. שאר אמצעי התקשורת יצופו מאוחר יותר (שלב 4.5) באמצעות אותם צינורות. - הכן פלסטיק 2L עם בר ערבוב בדלי מוקף קרח. מניחים על צלחת ערבוב.
- צרף חלק עליון מסנן 500 מ"ל על בקבוק 1L. חברו את יחידת המסנן העליונה של הבקבוק לוואקום הביתי באמצעות צינורות מתאימים.
- יוצקים את supernatant מ שלב 4.1 (אשר עדיין מכיל את mAb המיוצר על ידי תאי hybridoma) לתוך החלק העליון של המסנן.
- המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי גלולה פסולת תא מהמדיה (הכדור ימשיך לבנות). המתן להפעלת הוואקום עד שראש המסנן יהיה מלא וקבוצה נוספת של סופר-נט-נט מוכנה לשפוך פנימה. אל תתנו למסנן להתייבש או שהסינון יהפוך לאיטי מאוד.
- כאשר בקבוק 1L קרוב למלא, להסיר את החלק העליון מסנן ולשפוך supernatant לתוך 2L כף מוכנה בשלב 4.2. א'א',ח'י את החלק העליון של המסנן. עקוב אחר אמצעי האחסון.
- חזור על שלבי המרכז והסינון עד שכל המדיה מעובדת.
- למדוד 295 גרם של אמוניום גופרתי לכל 1L של סופרנאט מסונן שנאסף. תוך כדי ערבוב, לאט להוסיף את אמוניום גופרתי על-טבעי במהלך השעות הקרובות (~ 25 גרם כל 15 דקות) כדי למנוע ריכוז גבוה מקומי של מלח אמוניום גופרתי שעלול לגרום חלבונים לא רצויים לזרז.
- לאחר הוספת כל האמוניום גופרתי, מכסים את הכיס בנייר כסף ומעבירים עם צלחת הערבוב ל-4 מעלות צלזיוס (למשל, מקרר או חדר קר). מערבבים לילה. ערבוב מתמיד של הפתרון נדרש כדי solubilize המלח, אבל ערבוב ממושך יכול להוביל denaturation של חלבונים בתמיסה על פני השטח / ממשק האוויר.
- לשטוף את הצינורות באמצעות רוטור זווית קבועה.
5. טיהור נוגדנים - יום 2
- יוצקים את האמוניום-סולפט המכיל סופר-טבעי מהכוס 2L לתוך צינורות עבור רוטור זווית קבועה. ספין בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 6500 סל"ד במשך 20 דקות ללא בלם.
- ואקום לשאוף supernatant, דואג לא למצוץ את הכדור כפי שהוא יהיה רך. המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי לאסוף גלולה מהאמוניום-גופרתי המכיל סופרנטנט.
- לאחר השאיפה האחרונה, resuspend כל גלולה (המכיל נוגדנים) ב ~ 1 מיליליטר PBS.
- הסר את אמוניום גופרתי מן פתרון mAb מזורז על ידי דיאליזה נגד כמויות גדולות של PBS. כדי לעשות זאת, לחתוך תחילה כ 1 אינץ 'של צינורות דיאליזה (למשל, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 דלתון מנותק צינורות דיאליזה תאית) עבור כל mL של פתרון mAb. הרטיבו את הצינורות עם dH2O. לקשור קשר בקצה אחד של הצינורות ולמלא עם dH2O כדי לבדוק את הקשר הזה לא דולף. ריק dH2O מהצינורות.
- פיפטה PBS / פתרון נוגדן לתוך הצינורות. לשטוף את הצינורות עם PBS נוסף 0.25 מ"ל, ולהעביר צינורות.
- אבטחו את החלק העליון של הצינורות קרוב ככל האפשר לפתרון עם קליפ דיאליזה כתום.
- הדבק את החלק העליון של הצינורות לחלק החיצוני של 4L. אפשר לחלק המלא של הצינורות להיתלות לתוך הכיס. ממלאים את הכיס ב-PBS ומוסיפים מוט ערבוב.
- מערבבים למשך הלילה כ-8 שעות ב-4°C.
- החליפו את ה-PBS בכורסה ב-PBS טרי וערבובו כ-8 שעות פעמיים נוספות.
- מעבירים את הנוגדן מהצינורות לצינורות חרוטים של 15 או 50 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד כדי להסיר כל משקעים שאולי נוצרו. מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי.
- לדלל aliquot של נוגדן 1:20 עם PBS (5 מיקרול נוגדן + 95 μl PBS). כמות ריכוז הנוגדנים עם ספקטרופוטומטר (ריק עם PBS) ב 280 ננומטר. השתמש במקדם הכחדה (ε) של 1.43. הריכוז מחושב כ
- Aliquot את הנוגדן לתוך בקבוקוני בורג cap ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
נוגדנים הם כלי רב עוצמה למחקר ואבחון, מה שאומר שלעתים קרובות יש צורך בייצור שלהם בכמויות גדולות.
הצעד הראשון ליצירת נוגדנים הוא הזרקת האנטיגן המעניין לחיה מארחת. האנטיגן מפעיל את תאי B של המארח, אשר לאחר מכן מייצרים ומשחררים נוגדנים ספציפיים לאנטיגן זה. לאחר מכן, מתבצעת סריקה קבועה של האנטיסרה של החיה המארחת לנוכחות נוגדן המטרה, באמצעות ELISA או שיטת זיהוי אחרת. ברגע שהוא מזוהה, הטחול של החיה המארחת, המכיל את תאי B, מוסר. אם כל תאי B מהטחול מבודדים כעת, זה אמור לכלול אוכלוסייה המפרישה נוגדנים לאנטיגן המבוקש. אנו מתייחסים לאוכלוסייה זו כפוליקלונלית, מכיוון שכל תא נקשר ככל הנראה לאפיטופ אחר של האנטיגן, ולכן יצר נוגדן אינדיבידואלי וייחודי משלו.
כדי ליצור נוגדנים חד-שבטיים, נוגדנים הגדלים כדי לזהות אפיטופ ספציפי אחד, תחילה יש לבודד ולתרבית את תא ה-B הבודד המייצר את הנוגדן הרצוי. למרבה הצער, תאי B אינם שורדים היטב בתרבית. אז כדי להתגבר על המכשול הזה, מדענים ממזגים תאי B עם תאי מיאלומה בני אלמוות, וכתוצאה מכך נוצרות הכלאות. תאים אלה גדלים לאחר מכן במדיום סלקטיבי המאפשר רק להכלאות לגדול ולשחרר נוגדנים. שוב, המדיום נבדק בשיטה כמו ELISA עבור הנוגדן הרצוי. ברגע שהוא מתגלה, ההיברידומות משובטות בתהליך הנקרא דילול מגביל, דילול סדרתי של תרבית האב, מה שאמור לגרום לתאים בודדים להיזרע לבארות של צלחת סינון. זה מאפשר צמיחה של הכלאות מתא הורה יחיד, ומניב קו תאים חד שבטי שמשחרר רק את הנוגדן הרצוי. ניתן להרחיב את הקווים החד-שבטיים הללו בצלוחיות תרבית רקמה כדי לייצר כמויות גדולות של נוגדנים חד-שבטיים. לאחר מכן, כאשר התאים מתחילים למות, ניתן לזרז את הנוגדנים מהמדיום עם אמוניום גופרתי. בדרך כלל, בתמיסה, נוגדנים מקיימים אינטראקציה עם מים באמצעות אינטראקציות הידרופיליות. עם זאת, אמוניום וסולפט הם יונים טעונים מאוד המפרידים בין מולקולות המים לנוגדנים, מפחיתים את מסיסות הנוגדנים וגורמים להם לשקע.
כדי להתחיל, בדוק תחילה את רשימת החומרים והכן את כל המדיה, האספקה ומשטחי העבודה לפרוטוקול.
לאחר מכן, הפעל אמבט מים והגדר אותו ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של RPMI שלם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ו-15 מיליליטר של RPMI שלם לבקבוק תרבית תאים T75 והניח אותם בצד. בזהירות ולבישת ציוד המגן האישי המתאים, הסר את הבקבוקון הקפוא המכיל תאי היברידומה מאחסון החנקן הנוזלי. כדי לשחרר את הלחץ בתוך הבקבוקון, שחרר מעט את המכסה. כעת, דגרו בזהירות את הבקבוקון באמבט המים, וודאו שהמכסה נשאר מעל פני המים כדי למזער את הסיכוי לזיהום. כאשר התאים כמעט מופשרים, מה שבדרך כלל לוקח כשתי דקות, העבירו את הבקבוקון למכסה המנוע של תרבית הרקמה.
לאחר מכן, נגב את החלק החיצוני של הבקבוקון עם 70% אתנול לפני הסרת המכסה. בעזרת פיפטה סטרילית, העבירו את התאים לצינור החרוטי המכיל 10 מיליליטר של מדיום RPMI שלם. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור למשך חמש דקות ב-1200 סל"ד. לאחר צנטריפוגה, הזיזו את הצינור בחזרה למכסה המנוע ונגבו את החלק החיצוני של הצינור באתנול. מבלי להפריע לגלולה, השליכו את הסופרנטנט ולאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום RPMI שלם טרי ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש. לאחר מכן, העבירו את התאים לבקבוק תרבית התאים T75 והניחו את הבקבוק בתוך אינקובטור של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אפשר לתאים להגיע לכ-80% מפגש, מה שבדרך כלל לוקח כשלושה ימים. שימו לב שתאי היברידומה אינם נצמדים ויגדלו תלויים במדיום. הזמן להגיע למפגש מספיק עשוי להשתנות בהתאם למספר ההתחלתי של תאים חיים וסוג תא ההיברידומה בו נעשה שימוש.
לאחר שהתאים מתכנסים מספיק, השתמש בפיפטה סטרילית של 25 מיליליטר כדי להעביר אותם מבקבוק התרבית לצינור צנטריפוגה חרוטי. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1200 סל"ד למשך חמש דקות. בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה, הוסיפו 18 מיליליטר של RPMI מלא לכל אחת משלוש צלוחיות תרבית תאי T75 חדשות והניחו אותן בצד. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה בעדינות את כדור התא בשישה מיליליטר של RPMI מלא. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של תרחיף התאים לכל אחת משלושת צלוחיות תרבית התאים החדשות. לבסוף, הכניסו את הצלוחיות לאינקובטור המוגדר ל-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס ודגרו עד שהצלוחיות יהיו בסביבות 80% מתלכדות, כשלושה ימים.
בשלב זה, התאים מוכנים להמשיך את צמיחתם במדיום נטול הסרום המיועד לקווי תאי היברידומה, כגון מדיום נוזלי בסיסי HB הזמין מסחרית המכיל את תוסף HB101. העבירו את התאים מכל בקבוק תרבית תאים לצינורות צנטריפוגה חרוטיים ולאחר מכן גלולו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות. כעת, הוסיפו 230 מיליליטר של מדיום נטול סרום HB101 לכל אחת משש צלוחיות תרבית תאים בגודל 225 סנטימטר בריבוע והניחו אותן בצד. לאחר השלמת הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש כל כדור ב-10 מיליליטר של מדיום HB101 בתוספת לאחר מכן, לכל בקבוק תרבית תאים, הוסף חמישה מיליליטר של תרחיף התאים. מניחים את הצלוחיות באינקובטור 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וממשיכים לגדל את התאים כשלושה שבועות. במהלך תקופה זו, התאים ייצרו וישחררו את הנוגדן החד-שבטי המעניין למדיום התרבית, והנוגדן יהיה מוכן לטיהור כאשר התאים יתחילו למות.
כדי להסיר את הפסולת הסלולרית מאמצעי התרבות המכיל נוגדנים, שפכו את תכולת צלוחיות התרבות לצינורות לרוטור זווית קבועה. הנח את הצינורות ברוטור וודא שהוא מאוזן כראוי לפני הצנטריפוגה. סובב את הצינורות ב-10,000 סל"ד למשך שמונה דקות. בזמן שהדגימות צנטריפוגות, הניחו כוס פלסטיק של שני ליטר עם מוט ערבוב לתוך דלי קרח ולאחר מכן הניחו את דלי הקרח על צלחת ערבוב.
לאחר מכן, חבר חלק עליון של פילטר 500 מיליליטר לבקבוק של ליטר. חבר את יחידת המסנן העליונה של הבקבוק לשואב בית באמצעות הצינור המתאים. לאחר מכן, שפכו את הסופרנטנט המכיל את הנוגדן לחלק העליון של המסנן. צנטריפוגה את המדיה הנותרת כדי להפריד את פסולת התא מהסופרנטנט המכיל נוגדנים. כאשר החלק העליון של המסנן מלא ב-supernatant, הפעל את הוואקום. לאחר מכן, כאשר בקבוק האיסוף של ליטר אחד קרוב למלא, הסר את החלק העליון של המסנן ושפך את הסופרנטנט המסונן לכוס של שני ליטר על קרח. חזור על שלבי הסינון עד שכל הסופרנטנט מעובד.
לאחר עיבוד כל הדגימה, שקלו 295 גרם אמוניום גופרתי לליטר אחד של סופרנטנט מסונן. התחילו את צלחת הערבוב והוסיפו לאט לאט את האמוניום גופרתי לסופרנטנט במהלך השעות הבאות. זה מונע ריכוז גבוה מקומי של מלח אמוניום גופרתי שעלול לגרום לחלבונים לא רצויים לשקע. לאחר הוספת כל האמוניום גופרתי, מכסים את הכוס בנייר כסף ומעבירים אותה, יחד עם צלחת הערבוב, לחדר קר בארבע מעלות צלזיוס ומניחים אותה לערבב את תמיסת הנוגדנים למשך הלילה.
למחרת בבוקר, שפכו את תמיסת הנוגדנים המכילה אמוניום סולפט מכוס שני ליטר לצינורות נקיים לרוטור הזווית הקבועה. צנטריפוגה של הצינורות ב-6500 סל"ד למשך 20 דקות ללא הפסקה כדי לגלול את הנוגדן בתחתית הצינורות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט בוואקום, היזהרו לא לשאוב את הגלולה הרכה. המשך להשתמש באותה קבוצת צינורות כדי לאסוף את הנוגדן הגלולי משארית הסופרנטנט המכיל אמוניום גופרתי. לאחר השאיפה האחרונה, השעו מחדש כל כדור נוגדן בכמיליליטר אחד של PBS.
כדי להסיר את האמוניום גופרתי מתמיסת הנוגדנים, חתוך תחילה כסנטימטר אחד של צינורות דיאליזה עבור כל מיליליטר של תמיסת נוגדנים. לאחר מכן, נגב את הצינור במים מזוקקים וקשר קשר בקצה אחד של הצינור. מלאו את הצינור במים מזוקקים כדי לבדוק אם יש נזילה מהקשר. אם אין דליפה לאחר מספר דקות, רוקן את המים מהצינור.
לאחר מכן, פיפטה את תמיסת הנוגדנים לתוך הצינור. כדי לשחזר כמה שיותר נוגדנים, שטפו את הצינורות עם 0.25 מיליליטר נוסף של PBS והעבירו גם את זה לצינור. אבטח את החלק העליון של הצינור קרוב ככל האפשר לתמיסה בעזרת קליפ דיאליזה. לאחר מכן, הדביקו את החלק העליון של הצינור לחלק העליון החיצוני של כוס של ארבעה ליטר כשהחלק המלא של הצינור תלוי בכוס. כעת, קחו את הכוס לחדר הקירור של ארבע מעלות צלזיוס והניחו אותה על צלחת ערבוב. ממלאים את הכוס למעלה ב- PBS ומוסיפים מוט ערבוב. הניחו לשפופרת ולתמיסה לערבב למשך הלילה במשך כשמונה שעות. למחרת בבוקר, החליפו את ה-PBS בכוס ב-PBS טרי ולאחר מכן השאירו את הכוס לערבב שוב למשך כשמונה שעות. מאוחר יותר באותו ערב, חזור על התהליך בפעם האחרונה. בבוקר, פתחו את צינור הדיאליזה ולאחר מכן העבירו את תמיסת הנוגדנים מהצינור לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. כדי להסיר כל משקע שעלול להיווצר במהלך הדיאליזה, צנטריפוגה את הצינורות למשך חמש דקות ב-1200 סל"ד. לבסוף, העבירו את הסופרנטנט לצינורות טריים.
כדי לכמת את ריכוז הנוגדנים, בצע תחילה דילול של פי 20 על ידי הוספת חמישה מיקרוליטר מאליקוט נוגדנים ל-95 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, פיפטה את הנוגדן המדולל לקובט והשתמש בספקטרופוטומטר כדי לרשום את הריכוז ב-280 ננומטר. לאחר מכן, חשב את ריכוז הנוגדנים באמצעות הנוסחה המוצגת. לבסוף, סמן את בקבוקוני מכסה הבורג עם שם הנוגדן, הריכוז, תאריך ההכנה, ואם רלוונטי, מספר אצווה ושם הנסיין, ולאחר מכן הכניס את הנוגדן לבקבוקוני מכסה הבורג המסומן. ניתן לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך.
תפוקות לדוגמה באמצעות קו ההיברידומה CD317 או PDCA-1 120G8 נגד עכבר נעו בין 44 ל-99.6 מיליגרם, מה שמניב בדרך כלל, בממוצע, כמות של 67.3 מיליגרם. חשוב לציין שכל ריצת ייצור עם אותו קו תאי היברידומה יכולה להיות שונה במקצת בכמות הנוגדנים החד-שבטיים הזמינים בסוף.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why can't B-cells be cultured directly to produce monoclonal antibodies?
B-cells do not survive well in long-term culture, making it impossible to maintain them indefinitely for antibody production. To overcome this limitation, scientists fuse B-cells with immortal myeloma cells to create hybridomas, which combine the antibody-producing properties of B-cells with the indefinite growth capacity of myeloma cells.
Q2: What is the difference between polyclonal and monoclonal antibodies?
Polyclonal antibodies are a mixture of antibodies, each recognizing different epitopes on an antigen, produced by multiple B-cell clones. Monoclonal antibodies are identical antibodies produced by a single hybridoma cell line, recognizing only one specific epitope. This makes monoclonal antibodies more specific and useful for distinguishing between similar antigens.
Q3: How does limiting dilution ensure monoclonal antibody production?
Limiting dilution is a serial dilution process that statistically ensures single cells are seeded into screening plate wells. Wells containing one cell grow into monoclonal populations producing identical antibodies. This cloning method guarantees that the resulting hybridoma line releases only the desired antibody of known specificity.
Q4: What role does ammonium sulfate play in antibody purification?
Ammonium sulfate precipitation removes antibodies from culture medium by competing with proteins for water molecules through hydrophilic interactions. The highly charged ammonium and sulfate ions decrease antibody solubility, causing them to precipitate out of solution. This salting-out method is a standard technique for protein purification from culture supernatants.
Q5: Why is dialysis tubing used after ammonium sulfate precipitation?
Dialysis tubing removes residual ammonium sulfate from the antibody solution through osmotic exchange. The antibody solution is placed in dialysis tubing and immersed in PBS buffer overnight. Water and small salt ions pass through the tubing membrane while antibodies remain inside, resulting in purified antibody free of ammonium sulfate.
Q6: How is antibody concentration determined after purification?
Antibody concentration is measured using a spectrophotometer at 280 nanometers, which detects protein absorbance. A 20-fold dilution of the antibody sample is prepared in PBS, then analyzed using the spectrophotometer. The concentration is calculated using a standard formula and recorded for documentation and storage of the purified monoclonal antibody.
Q7: What screening method is used to identify hybridomas producing the desired antibody?
ELISA assays indirect sandwich and competitive methods are used to screen hybridoma culture media for the presence of the target antibody. After hybridoma fusion and limiting dilution cloning, ELISA detects which wells contain cells producing the desired monoclonal antibody. This screening step ensures only hybridomas with the correct antibody specificity are selected for expansion and antibody production.
פרקים בסרטון זה
0:01
Concepts
2:51
Hybridoma Expansion
6:04
Antibody Production in Serum-Free Medium
7:28
Antibody Purification - Day 1
9:25
Antibody Purification - Days 2-4
12:00
Analysis and Results