יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות

הערה: טכניקת תרבית תאים סטרילית צריכה להישמר בעת טיפול בתאי ההיברידימה ובמדיה באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית) עד לצעדי טיהור הנוגדנים.

1. הפשרת תאי היברידיה קפואים

1. לדגור על הוויאל המכיל את תאי ההיברידיומה הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה (כ-2 דקות).
2. הוסף את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של RPMI מלא (RPMI בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 100 פניצילין U /mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1mM נתרן pyruvate, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1200 סל"ד כדי לשטוף את כל אמצעי ההקפאה המזהמים.
4. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant נוזלי, ו resuspend גלולה התא 5 מ"ל טרי להשלים RPMI. לאחר מכן, הוסף את התאים לבקבוק תרבית רקמות T75 המכיל RPMI מלא של 15 מ"ל (נפח סופי של RPMI הוא 20 מ"ל).
5. לגדל את התאים באינקובטור סטנדרטי ב 37 °C עם 5% CO₂. תאים אינם דבקים בזמן שהם נמצאים בתרבית.

2. הרחבת הכלאה

1. אפשר לתאים להתרחב במשך כ -3 ימים עד הבקבוקון הוא ~ 80% confluent.
   הערה: כמות זו של זמן יכולה להשתנות בהתאם למספר ההתחלתי של תאים, כמו גם הבדלים מובנים בשיעורי הצמיחה של תאים שונים. חשוב שתאים יהיו בשלב הצמיחה המעריכי.
2. ברגע הבקבוקון הראשוני מגיע ~ 80% השפעה, להסיר את התאים מבקבוק T75 הראשוני הזה, למקם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט ספין (1200 סל"ד במשך 5 דקות) כדי כדורי התאים.
3. resuspend התאים ב 6 מ"ל של RPMI מלא, ולאחר מכן להפיץ את ההשעיה התא לשלושה צלוחיות T75 חדשות (2 מ"ל / בקבוקון המכיל RPMI 18 מ"ל). לדגור אלה שלושה צלוחיות T75 ב 37 °C עם 5% CO₂ עד שהם ~ 80% confluent (זה צריך לקחת כ 3 ימים).

3. ייצור נוגדנים במדיום ללא סרום

הערה: בשלב זה, התאים מוכנים להמשיך את צמיחתם במדיום נטול סרום המיועד לצמיחה של קווי תאים היברידיים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במדיום הנוזלי HB Basal המוכנים לשימוש וזמינים מסחרית המכילים את מוצר תוספת HB101.

1. התאים מכל אחד משלושת צלוחיות T75 (ב-80% זיהום) נאספים וצנטריפוגות (1200 סל"ד למשך 5 דקות).
2. כדור התא מכל בקבוקון T75 הוא resuspended 10 מ"ל בתוספת HB101 סרום בינוני ולאחר מכן הוסיף שני T225 צלוחיות בתוספת HB101 בינוני ללא סרום (כלומר 5 מ"ל השעיית תא לתוך כל אחד 6 צלוחיות המכיל ~ 220-240 מ"ל HB101 בכל בקבוק).
3. המשך לגדל את התאים בבקבוקי T225 ו- HB101 ב- 37°C עם 5% CO₂ במשך שלושה שבועות, או עד שתאים מתחילים למות. התאים מייצרים mAb במהלך 3 השבועות האלה ומפרשים אותו למדיום התרבותי. ברגע שהתאים מתחילים למות, הם כבר לא מייצרים mAb.

4. טיהור נוגדנים - יום 1

הערה: בשלב זה, אין צורך לשמור על סטריליות ולכן אין צורך בטיפול בתקשורת באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית). יתר על כן, הכלאות אינן נחשבות לסוכן "רמת BSL2".

1. יוצקים מדיה מהבקבוקונים לצינורות לרוטור בזווית קבועה. לסובב את הצינורות בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 10,000 סל"ד במשך 8 דקות. שלב זה נועד להסיר את הפסולת התאית מן לתרבות-על.
   הערה: גדלי הצינור יכולים להשתנות בהתאם לרוטור המשמש. הדבר החשוב לזכור הוא לקבל את אותו נפח בצינורות כדי להבטיח את הרוטור מאוזן כראוי לפני צנטריפוגה. סביר להניח שכל נפח המדיה לא יתאים לצנטריפוגה בבת אחת. שאר אמצעי התקשורת יצופו מאוחר יותר (שלב 4.5) באמצעות אותם צינורות.
2. הכן פלסטיק 2L עם בר ערבוב בדלי מוקף קרח. מניחים על צלחת ערבוב.
3. צרף חלק עליון מסנן 500 מ"ל על בקבוק 1L. חברו את יחידת המסנן העליונה של הבקבוק לוואקום הביתי באמצעות צינורות מתאימים.
4. יוצקים את supernatant מ שלב 4.1 (אשר עדיין מכיל את mAb המיוצר על ידי תאי hybridoma) לתוך החלק העליון של המסנן.
5. המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי גלולה פסולת תא מהמדיה (הכדור ימשיך לבנות). המתן להפעלת הוואקום עד שראש המסנן יהיה מלא וקבוצה נוספת של סופר-נט-נט מוכנה לשפוך פנימה. אל תתנו למסנן להתייבש או שהסינון יהפוך לאיטי מאוד.
6. כאשר בקבוק 1L קרוב למלא, להסיר את החלק העליון מסנן ולשפוך supernatant לתוך 2L כף מוכנה בשלב 4.2. א'א',ח'י את החלק העליון של המסנן. עקוב אחר אמצעי האחסון.
7. חזור על שלבי המרכז והסינון עד שכל המדיה מעובדת.
8. למדוד 295 גרם של אמוניום גופרתי לכל 1L של סופרנאט מסונן שנאסף. תוך כדי ערבוב, לאט להוסיף את אמוניום גופרתי על-טבעי במהלך השעות הקרובות (~ 25 גרם כל 15 דקות) כדי למנוע ריכוז גבוה מקומי של מלח אמוניום גופרתי שעלול לגרום חלבונים לא רצויים לזרז.
9. לאחר הוספת כל האמוניום גופרתי, מכסים את הכיס בנייר כסף ומעבירים עם צלחת הערבוב ל-4 מעלות צלזיוס (למשל, מקרר או חדר קר). מערבבים לילה. ערבוב מתמיד של הפתרון נדרש כדי solubilize המלח, אבל ערבוב ממושך יכול להוביל denaturation של חלבונים בתמיסה על פני השטח / ממשק האוויר.
10. לשטוף את הצינורות באמצעות רוטור זווית קבועה.

5. טיהור נוגדנים - יום 2

1. יוצקים את האמוניום-סולפט המכיל סופר-טבעי מהכוס 2L לתוך צינורות עבור רוטור זווית קבועה. ספין בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 6500 סל"ד במשך 20 דקות ללא בלם.
2. ואקום לשאוף supernatant, דואג לא למצוץ את הכדור כפי שהוא יהיה רך. המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי לאסוף גלולה מהאמוניום-גופרתי המכיל סופרנטנט.
3. לאחר השאיפה האחרונה, resuspend כל גלולה (המכיל נוגדנים) ב ~ 1 מיליליטר PBS.
4. הסר את אמוניום גופרתי מן פתרון mAb מזורז על ידי דיאליזה נגד כמויות גדולות של PBS. כדי לעשות זאת, לחתוך תחילה כ 1 אינץ 'של צינורות דיאליזה (למשל, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 דלתון מנותק צינורות דיאליזה תאית) עבור כל mL של פתרון mAb. הרטיבו את הצינורות עם dH₂O. לקשור קשר בקצה אחד של הצינורות ולמלא עם dH₂O כדי לבדוק את הקשר הזה לא דולף. ריק dH₂O מהצינורות.
5. פיפטה PBS / פתרון נוגדן לתוך הצינורות. לשטוף את הצינורות עם PBS נוסף 0.25 מ"ל, ולהעביר צינורות.
6. אבטחו את החלק העליון של הצינורות קרוב ככל האפשר לפתרון עם קליפ דיאליזה כתום.
7. הדבק את החלק העליון של הצינורות לחלק החיצוני של 4L. אפשר לחלק המלא של הצינורות להיתלות לתוך הכיס. ממלאים את הכיס ב-PBS ומוסיפים מוט ערבוב.
8. מערבבים למשך הלילה כ-8 שעות ב-4°C.
9. החליפו את ה-PBS בכורסה ב-PBS טרי וערבובו כ-8 שעות פעמיים נוספות.
10. מעבירים את הנוגדן מהצינורות לצינורות חרוטים של 15 או 50 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד כדי להסיר כל משקעים שאולי נוצרו. מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי.
11. לדלל aliquot של נוגדן 1:20 עם PBS (5 מיקרול נוגדן + 95 μl PBS). כמות ריכוז הנוגדנים עם ספקטרופוטומטר (ריק עם PBS) ב 280 ננומטר. השתמש במקדם הכחדה (ε) של 1.43. הריכוז מחושב כ
    
    
12. Aliquot את הנוגדן לתוך בקבוקוני בורג cap ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.