העברת תאים מאמצת: הצגת טחול עכבר תורם לעכבר מארח והערכה של הצלחה באמצעות FACS
מקור: מונירסילבן 1,2,3, פרצ'טתיבו 1,2,3, סופינובולט 4, רחל גולוב1,2,3
יחידה אחת ללימפופוליס, המחלקה לאימונולוגיה, מכון פסטר, פריז, צרפת
2 INSERM U1223,…
1. הכנה
- לפני שתתחילו, לבשו כפפות מעבדה וביגוד מגן מתאים.
- לחטא את כל כלי הניתוח, תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן יבש ביסודיות.
- הכן 50 מ"ל מתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה סרום עגל עוברי 2% (FCS).
2. ניתוח
- באמצעות מערכת אספקת פחמן דו חמצני, להרדים את העכבר על ידי היפוקסיה. אבטחו את העכבר המתת חסד על צלחת ניתוח בתנוחת העפרוניזציה ובצעו לפרוסטומיה אורך באמצעות מספריים ומלקחיים.
- באמצעות מלקחיים להזיז את המעיים ואת הבטן בצד ימין של הבטן כדי לחשוף את הבטן ואת הטחול. הטחול מחובר לקיבה.
- באמצעות מלקחיים בזהירות לנתק את הטחול מן הבטן ומניחים אותו על צלחת פטרי המכיל 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.
3. בידוד תאי מערכת החיסון
- מניחים את הטחול על מסננת תא 40 מיקרומטר מעל צלחת פטרי. למחוץ את הטחול עם בוכנה כדי לנתק אותו.
- לשחזר את התאים דבק על ידי שטיפה הבוכנה ואת מסננת עם 1 מ"ל של HBSS 2% FCS.
- מעבירים את הטחול והמנותק לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מיליליטר של HBSS 2% FCS ולהעביר את הנוזל לצינור 15 מ"ל.
- צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
- resuspend הכדור ב 2 מ"ל של אשלגן אמוניום כלוריד צינור מעלה ומטה כדי resuspend הכדור ולזר את אריתרוציטים.
- המתן 2 דקות והוסף HBSS 2% FCS לכדור resuspended כדי להשיג את הנפח עד 14 מ"ל.
- צנטריפוגות הצינור שוב ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של HBSS 2% FCS על ידי צנרת למעלה ולמטה.
- ספירת התאים באמצעות בדיקות כתמים כחולות טריפן והתאמת ריכוז התא הסופי ל- 107 תאים/מ"ל באמצעות נפח מתאים של HBSS 2% FCS.
4. העברה מאמצת
- העברה 2 מ"ל של השעיית תא המתקבלת בצינור איסוף 5 מ"ל.
- צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatant.
- resuspend הכדור ב 2 מ"ל של PBS וצנטריפוגה הצינור ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס.
- להשליך כדורי supernatant ו resuspend ב 200 μL של PBS.
- באמצעות מזרק 0.5 מ"ל עם מחט 29G להזריק 200 μL של השעיית תא לתוך העכבר הניסיוני תוך ורידי לתוך סינוס הדם רטרו-מסלולית.
- כמו שליטה, להזריק עכבר שני באותו סינוס דם עם 200 μL של תמיסת מלח חוצץ פוספט.
5. תאים קציר וכתמים
- ארבעה ימים לאחר ההעברה המאמצת, להרדים עכברים ולהסיר את הטחול.
- קוצר את הטחול כמתואר בסעיף 3.
- העבר 100 μL של השעיות תא מכל עכבר לשני צינורות FACS, שכותרתו "שליטה" ו "הועבר".
- צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatants.
- הכן תערובת המכילה את ארבעת הנוגדנים בדילול המפורט בטבלה 1.
| נוגדנים | פלואורוכרום | דילול |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | נגמ"ש7 | 1/400 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
טבלה 1: קומפוזיציה לערבב נוגדנים. ארבעה קוקטיילים נוגדנים הכנה באמצעות מצומדים נוגדנים-פלואורסצנטיים מרוכזים ו- HBSS.
- מוסיפים 100 μL של התערובת לכל צינור, ולאחר מכן לדגור במשך 20 דקות על קרח בחושך.
- הוסף 1 מ"ל של HBSS 2%FCS ולאחר מכן צנטריפוגות הצינורות ב 370 x גרם במשך 3 דקות ב 10 °C.
- להשליך את supernatants ו resuspend הכדורים ב 200 μL של HBSS 2% FCS.
- העבר את התאים המותפנים מחדש לצינורות FACS חדשים ומסומנים בתווית.
- באמצעות ציטומטריית זרימה, כפי שמוצג בפרוטוקול FACS, להעריך את נוכחותם של לימפוציטים חיוביים CD45.2.
6. ניתוח נתונים
- פתח את תוכנת "FlowJo" וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון "כל הדוגמה".
- לחץ פעמיים על הקובץ "הועבר" כדי להציג את התאים שנרשמו מאותה דגימה על חלקת נקודות המציגה פיזור קדימה "SSC-A" על ציר Y ופיזור צדדי "FSC-A" על ציר X.
- לחץ על "מצולע" וצור אסטרטגיית הגינג לבחירת לימפוציטים, לאחר מכן הבחין בין תאים תורמים ומארחים באמצעות סמני פני השטח של התא (CD45.1, CD45.2) ולאחר מכן מאפיין את CD45.2+ אוכלוסיית התאים (CD3, CD4).
- חזור על שלבי הניתוח עם קובץ "עכבר הבקרה".
- כדי להציג באופן חזותי אוכלוסיית תאים, לחץ על "עורך הפריסה".
- גרור את "התאים שהועברו" ואת " האוכלוסייה "תאים שהועברו CD4" מ "הועבר" ו "פקד" קבצים אל " הכרטיסיהעורך פריסה".
- תיימת נקודות המייצגת CD45.2+ תאים ולימפוציטים CD4 תופיע.
- תאים שהועברו על - CD45.2 אמורים להופיע רק ב" עכברהמועבר" בתכנון הנקודות .
העברת תאים מאמצת היא שיטה להחדרת תאים מעניינים לאורגניזם. זוהי טכניקה רבת עוצמה לחקר מנגנונים ביולוגיים שונים, כולל פעולתם של סוגים ספציפיים של תאי חיסון. בנוסף, העברה מאמצת היא טיפול חדשני ומבטיח למצבים רבים, כגון אלה הדורשים השתלת מח עצם או טיפולי סרטן שבהם ניתן להוציא תאי T של המטופל עצמו, לשנות אותם כדי לזהות ולהשמיד את התאים הסרטניים, ולאחר מכן להחזירם לגוף כדי להילחם בגידולים.
במעבדה, מודלים של בעלי חיים משמשים לעתים קרובות לחקר העברה מאמצת. לדוגמה, לעכברי נוקאאוט CD45.1 Rag gamma-c חסרים קולטנים בסיסיים לציטוקינים רבים, החיוניים להתמיינות תקינה של תאי גזע המטופויאטיים ללימפוציטים. כתוצאה מכך, לעכברי הנוקאאוט יש התפתחות לימפוציטים פגומה ואין להם תאי הרג טבעיים, או NK, תאי T או תאי B.
ניתן להשתמש בהעברה מאמצת כדי להחדיר את תאי החיסון החסרים לעכברים שנפגעו, על ידי קצירת רקמת עכבר תורם המכילה ריכוזים גבוהים של תאים חיסוניים, כגון הטחול. לאחר מכן מפרקים את הרקמה ומבודדים מגוון תאי טחול, כולל תאי החיסון. לאחר מכן, אריתרוציטים לא רצויים, או תאי דם אדומים, יכולים לעבור ליזה באמצעות תוספת של מאגר אשלגן אמוניום כלוריד ולאחר מכן מופרדים תאי הדם הלבנים הנותרים, או הטחול, מפסולת התאים באמצעות צנטריפוגה.
לבסוף, הטחול המטוהר מוזרק לעכברים מדוכאי חיסון, מה שמקל על מחקרים מפורטים על תפקודי התאים הללו. מספר ימים לאחר מכן, ניתן לאשר את הצלחת העברת תאי החיסון המאמצים על ידי בידוד והכנת הטחול המארח באותו אופן כמו רקמת התורם. לאחר מכן, תאים אלה מוכתמים באמצעות נוגדנים מסומנים כנגד סמני התאים החיסוניים של התורם, כך שניתן יהיה לאמת ולמיין אותם באמצעות FACS.
כדי להתחיל, לבש כפפות מעבדה וציוד המגן המתאים. לאחר מכן, שטפו זוג מלקחיים ומספריים מנתחים תחילה עם חומר ניקוי ואז עם 70% אתנול ואז יבשו אותם במגבת נייר נקייה. הכן 50 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק, או HBSS, עם סרום עגל עוברי 2%, או FCS, על ידי שילוב של מיליליטר אחד של FCS עם 49 מיליליטר של HBSS בשפופרת של 50 מיליליטר. מערבבים על ידי פיפטינג עדין של התמיסה למעלה ולמטה כ-10 פעמים.
נתח את העכבר שעבר המתת חסד והסר את הטחול שלו כפי שמודגם בטכנולוגיית FACS של פרוטוקול הווידאו JoVE להפרדת לימפוציטים מסוג B הטחול. כדי לבודד תאי חיסון, הניחו תחילה את הטחול על מסננת תאים של 40 מיקרומטר בצלחת פטרי. מרסקים את הטחול בעזרת בוכנה כדי לנתק אותו למנה. שחזר את התאים הדבוקים על ידי שטיפת הבוכנה והמסננת עם 1 מיליליטר של HBSS 2% FCS. לאחר מכן, פיפטה את הטחול והנוזל המנותק מצלחת הפטרי לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. שוטפים את צלחת הפטרי עם 5 מיליליטר HBSS 2% FCS ומעבירים את הנוזל לצינור 15 מיליליטר.
צנטריפוגה את הצינור ב-370 פעמים גרם למשך שבע דקות ב-10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן שלף את הצינור בזהירות כדי לא להפריע לכדור. כעת, הסירו את הנוזל מבלי להפריע לגלולה והשליכו את הנוזל למיכל פסולת מתאים. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של מאגר ליזינג אשלגן אמוניום כלוריד לצינור הצנטריפוגה ופיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את הגלולה וליז את האריתרוציטים. המתן שתי דקות ולאחר מכן הוסף HBSS 2% FCS לגלולה המושעה כדי לקבל ערך כולל של 14 מיליליטר. חזור על הצנטריפוגה. הוציאו את הצינור בזהירות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-5 מיליליטר HBSS 2% FCS על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, ספרו את התאים בתרחיף. הוסף חמישה מיקרוליטר טריפן כחול לחמישה מיקרוליטר של תרחיף תאים וערבב היטב על ידי פיפטינג. לאחר מכן, הניחו בעדינות טיפה של חמישה מיקרוליטר של מתלה תאים מדולל בין זכוכית הכיסוי למגלשת Malassez. כאשר המיקרוסקופ מוגדר להגדלה של פי 40, ספור את מספר התאים. התאם את ריכוז התאים ל-10 לשבעת התאים למיליליטר על ידי הוספת הנפח המתאים של HBSS 2% FCS.
כדי להתחיל בהעברה לאימוץ, העבירו שני מיליליטר של תרחיף התאים לצינור איסוף של חמישה מיליליטר. צנטריפוגה של הצינור ב-370 פעמים גרם למשך שבע דקות ב-10 מעלות צלזיוס ואז השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט וצנטריפוגה את הצינור ב-370 פעמים גרם למשך שבע דקות ב-10 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מי מלח חוצצים פוספט. באמצעות מזרק של 0.5 מיליליטר עם מחט בגודל 29, הזרקו 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים לעכבר הניסוי דרך הווריד לתוך סינוס הדם הרטרו-אורביטלי.
ארבעה ימים לאחר ההעברה לאימוץ, המתת חסד של העכברים והוציאו את הטחול. לאחר מכן, קצרו את תאי החיסון כמתואר בסעיף 3. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים מכל עכבר לשני צינורות FACS המסומנים בבקרה והועברו. צנטריפוגה של הצינורות ב-370 פעמים גרם למשך שבע דקות ב-10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן השליכו את הסופרנטנטים. כעת, הכינו תערובת המכילה את ארבעת הנוגדנים בדילול המפורט בטבלה הראשונה. מוסיפים 100 מיקרוליטר מהתערובת לכל צינור ואז מדגרים במשך 20 דקות על קרח בחושך. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של HBSS 2% FCS לכל צינור ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות ב-370 פעמים גרם למשך שלוש דקות ב-10 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנטים ואז השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של HBSS 2% FCS. העבר את התאים המרחפים לצינורות FACS חדשים עם תווית. כעת, השתמש בזרימה ציטומטרית כפי שמוצג בפרוטוקול FACS כדי להעריך את הנוכחות של CD45. 2 לימפוציטים חיוביים.
כעת, נקבע את נוכחותם של לימפוציטים CD45.2 שבודדו מה-CD45. 1 טחול מארח. כדי להתחיל, לחץ פעמיים על סמל FlowJo וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון כל הדגימה. לאחר מכן, לחץ פעמיים על הקובץ שהועבר כדי להציג את התאים שהוקלטו מאותה דגימה בתרשים נקודות המציג FSCA פיזור קדימה על ציר ה-x ופיזור צד SSCA על ציר ה-y. לחץ על מצולע כדי להקיף את אוכלוסיות הלימפוציטים. מופיע חלון זיהוי תת-אוכלוסייה חדש. לחץ על אישור. כעת, הגדר את ציר ה-y ל-FSC-W ואת ציר ה-x ל-FSC-A. בחר את אוכלוסיית התאים הבודדים עם כלי המצולע כפי שהודגם קודם לכן.
לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המוקפת בעיגול כדי ליצור חלון חדש עבור התאים שנבחרו. בחלון החדש, בחר CD45.2 ב-Y ו-CD45.1 ב-X. לחץ על סמל T והתאם אישית את הציר כדי להגדיל את העלילה. לאחר מכן, לחץ על מצולע כדי להקיף את התאים החיוביים CD45.2. בחלון זיהוי תת-אוכלוסייה, תן שם לתאים שהועברו מאוכלוסיית התאים ולחץ על אישור. באותו חלון, לחץ על מלבן כדי לבחור את התאים השליליים CD45.2. בחלון זיהוי תת-אוכלוסייה, תן שם לתאים המארחים של אוכלוסיית התאים ולחץ על אישור. לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המוקפת בעיגול CD45.2, אוכלוסייה שהועברה, כדי ליצור חלון חדש לתאים שנבחרו. בחלון החדש, בחר CD3 ב-Y ו-CD4 ב-X.
לאחר מכן, לחץ על מצולע כדי להקיף את התאים החיוביים CD4 CD3. בחלון זיהוי תת-אוכלוסייה זה, תן שם לתאי CD4 שהועברו לאוכלוסיית התאים שלך. לאחר מכן, חזור על שלבי הניתוח הקודמים עם קובץ עכבר הבקרה. לבסוף, כדי לדמיין את אוכלוסיות התאים שלך, לחץ על עורך הפריסה. גרור את התאים המועברים ואת אוכלוסיית תאי CD4 המועברים מקבצים שהועברו ובקרה לתוך הכרטיסייה עורך פריסה. תופיע תרשים נקודות המייצג תאים חיוביים CD45.2 ולימפוציטים CD4. CD45. 2 תאים שהועברו צריכים להופיע רק בתרשים נקודות העכבר שהועבר.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.