ת לבדיקת מוות בתא: כרום שחרר את ההסתה של היכולת הציטוטוקסית

מבט כולל על שגרה

ההסתה האופיינית של ⁵¹Cr-release למדידת מוות תאי כוללת את השלבים הבאים:

1. ראשית, תאי היעד מסומנים עם Na₂[⁵¹Cr]O₄. זה מבדיל אותם מתאי האפקטים שבבחינה.
2. בעוד שתאי היעד מתייגים, התאים האפקטור נאספות, ובאמצעות טכניקת הדילול הסדרתי, ירידה בטיטורציה של תאי האפקטור נוצרת בלוח בדיקת תחתון עגול של 96 באר.
3. בסוף תיוג תא היעד, התאים נשטפים תחילה ולאחר מכן מספר קבוע של תאים מתווספים ללוח בדיקת ה- assay שכבר מכיל סדרה של דילול תאים משפיעים.
4. לאחר מכן, תערובת התאים של אפקט היעד מודגרת לפרק זמן מוגדר כדי לאפשר אינטראקציה מספקת בתאים עם תאי היעד, כדי לתווך תמה של תאים.
5. לבסוף, תרבות-העל נקצרים ונאספים לצינורות. כמות ⁵¹Cr היא כמות באמצעות מונה גמא.
6. בסוף, הנתונים נאספים ומשמשים לחישוב "תמוגת התא הספציפית באחוזים" של תאי היעד.

1. תיוג תאי יעד עם ⁵¹Cr

1. כדי להתחיל, להכין את תאי היעד, (כאן - קו תא מלנומה אנושי WM793), לתוך השעיית תא יחיד.
2. כדי לעשות זאת, ראשית להסיר את המדיה מן בקבוקון תרבית הרקמות.
3. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של 1X PBS.
4. Trypsinize התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין לצלחת במשך ~ 2 דקות.
5. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים מפני השטח הבקבוקון.
6. הוסף 5 מ"ל של מדיית RPMI לבקבוקון והעבר את המדיה למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים.
7. לאסוף את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד. דקאנט סופר-טבעי.
8. הוסף 10 מ"ל של מדיה לכדור וצינור בעדינות את המדיה למעלה ולמטה כדי להביא את התאים להשעיה.
9. לקבוע את ריכוז התא באמצעות hemocytometer.
10. העבר 1x10⁶ תאים לתוך צינור חרוט חדש 15 מ"ל.
11. צנטריפוגות מתלה התא במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד decant supernatant.
12. מערבולת בקצרה את הצינור כדי resuspend גלולה התא בנפח הקטן של בינוני נשאר מאחור.
13. הוסף 100 μCi של ⁵¹Cr ישירות להשעיית תא היעד WM793.
    הערה: צריך להיות שטח מעבדה ייעודי שהוקם לרדיואקטיביות המסוימת. בנוסף, צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון בטוח ושימוש ^{ב- 51}Cr במהלך כל השלבים, כמו גם שילוט מתאים כדי לציין היכן נשמרות דגימות עם ⁵¹Cr. מונה גייגר המצויד בגשושית פנקייק הוא גם הכרחי, לסקר את המרחב לזיהום אפשרי.
14. הוסף חתיכה קטנה של סרט רדיואקטיבי לצינור כדי לציין כי הצינור הוא עכשיו רדיואקטיבי.
15. מניחים את הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם מגן עופרת ודגרה למשך שעה אחת. תעיף את הצינור כל 15-20 דקות כדי להגדיל את ספיגת תאי המטרה של הכרום.
16. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף את תאי היעד עם 5 מ"ל של FBS כדי להסיר כל עודף ⁵¹Cr.
17. צנטריפוגות התאים ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות. דקאנט רדיואקטיבי FBS לשטוף לתוך מיכל פסולת מתאים.
18. respend הכדור ולשטוף בפעם השנייה עם FBS. בדוק את הכדור עבור רדיואקטיביות משולבת באמצעות מונה גייגר.
19. Resuspend הכדור במדיום מלא 10 מ"ל, השגת ריכוז תא של 10⁵ תאים / מ"ל.
    הערה: שלב ספירת התאים לאחר ^{תיוג 51}Cr מושמט כאן בעיקר מטעמי בטיחות. ניתן להניח כי ריכוז התא WM793 זהה כפי שהיה לפני ^{תיוג 51}Cr.

2. הכנת תאים משפיעים

1. ניתן להשתמש במגוון תאים משפיעים, כגון תאי T אנושיים או עכבר ותאי NK. בדוגמה זו, PBMCs, מבודדים מדם שלם על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות סטנדרטית (לריכוז של 5x10⁶), שימשו.
2. כדי להתחיל, להוסיף 100 μL של תרבית רקמות בינוני לכל באר של אחת השורות (כאן שורה A, ראה טבלה 1) של צלחת עגולה 96-היטב. כאן, לא מתווספים תאים משפיעים, והם ישמשו "ריק" לקביעת "שחרור מינימום / ספונטני ⁵¹Cr" מתאי היעד.

טבלה 1: ⁵¹Cr לשחרר פריסת assay: שורה A- תאים היעד (10⁴ תאים / 100 μL) דגירה עם מדיה בלבד (יוצר 'ריק' לקביעת "שחרור מינימום / ספונטני ⁵¹Cr"). שורות B עד C - בארות המכילות אפקט שונה: יחסי תא יעד (E:T), הנעים בין 50:1 ל- 1.5:1. שורה H - תאי יעד (10⁴ תאים /100 μL) דגירה עם 1% NP-40 (NP-40 lyses את תאי היעד, יצירת "מקסימום או סך של ⁵¹שחרור Cr"). כל יחס E:T נבדק משולש עבור כל מצב ניסיוני. מחשבי PBMCs ומחשבי PBM בעלי גירוי של עמודה 1-3 ומחשבי PBMC מגורה CPG.

3. לאחר מכן, ליצור דילול תאים סדרתיים פי 2 של מחשבי ה- PBMCs (במשולש עבור כל מצב ניסיוני), כדי להשיג ריכוז תא אפקט הנע בין 5x10⁵ ל 15,625 תאים / 100 μL של מדיה (כאן שורות B עד G).
   הערה: בדוגמה זו, המחולל ההתחלתי: יחס תא היעד (E: T) הוא 50:1. עם זאת, ניתן להתאים יחס זה בהתאם לפרטים הניסיוניים.
4. השאר את השורה האחרונה ריקה (כאן שורה H) על-ידי אי הוספת תאים משפיעים לבארות אלה. (שורה זו תשמש ליצירת "ספירות כוללות/דקות, או (ג. p.m)" או "מהדורת ⁵¹Cr המרבית").
5. מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס עד שתאי היעד מוכנים להוספתם.

3. הוספת ⁵¹Cr שכותרתו WM793 תאי יעד לאסאי

1. לאחר תקופת הדגירה, להסיר את תאי היעד מן האינקובטור לשטוף עם 5 מ"ל של FBS כדי להסיר כל עודף ⁵¹Cr.
2. צנטריפוגה התאים ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגה ייעודית.
3. הסר את שטיפת FBS (supernatant רדיואקטיבי) לתוך מיכל פסולת מתאים.
4. חזור על שלב הכביסה על ידי שימוש חוזר את הכדור ב 5 מ"ל טרי של FBS.
5. צנטריפוגות התאים שוב ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות.
6. לבסוף, respend הכדור ב 10 מ"ל של מדיום מלא.
7. יוצקים את ההשעיה של תא WM793 עם תווית ⁵¹Cr (10⁵ תאים/מ"ל) למאגר ריאגנט חד פעמי.
8. לאחר מכן, הוסף 100 μL של תאי יעד אלה שכותרתו, לכל באר של לוח התאים אפקט 96-well, באמצעות pipette רב ערוצי.
9. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של 1% NP-40 (במים) לשורת הבארות כי הם נטולי כל תאים אפקט (כאן שורה H). 1% NP-40 יהיה ליזה את תאי היעד, ולכן בארות אלה ישמשו פקדים כדי לקבוע את "ספירה כוללת / דקה, או (c. p.m)" או את המהדורה המרבית ⁵¹Cr.
10. אבטחו את המכסה לצלחת על ידי הוספת פיסת סרט קטנה חדירת גז לכל צד של הצלחת ומניחים פיסת סרט רדיואקטיבי על המכסה כדי לציין שהיא מכילה ⁵¹Cr.
11. בקצרה, צנטריפוגה הצלחת ב 1200 סל"ד. אם נעשה שימוש בלוח ניסוי אחד בלבד, הוסיפו צלחת איזון לצנטריפוגה.
    הערה: חשוב להשתמש בצנטריפוגה המסומנת לטיפול בדגימות רדיואקטיביות.
12. מוציאים את הצלחת מהצנטריפוגה.
13. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם חתיכת עופרת קטנה שמגנה על הצלחת לבטיחות נוספת. דגירה במשך 16 שעות כדי לאפשר תמה של תאי היעד.
    הערה: תקופת הדגירה יכולה להשתנות בין 4 ל 18 שעות בהתאם לתאי האפקטים המשמשים ומנגנון פוטנציאלי של הרג מועסק.

4. קצירת סופרנטנטים

1. בסוף תקופת הדגירה, להסיר בזהירות את הסרט סביב קצה הצלחת ולהסיר את המכסה.
2. לאחר מכן, מניחים את מסגרת הקציר על הצלחת, ומוודאים לאשר כי דיסקי המסנן הקטנים נמצאים במקום עבור כל אחד מצעי הכותנה. זה יבטיח את האוסף של סופרנט ללא תאים.
3. עכשיו, לאט ובעדינות לחץ על תקעי הכותנה לתוך בארות.
4. לאחר כ -10 שניות, לשחרר את הלחץ על תקעים כותנה ולאחר מכן להעביר את תקעים כותנה לרצועות צינור.
5. מניחים כל אחד מהצינורות האלה לתוך צינור FACS משני.
6. לבסוף, לטעון צינורות FACS על מונה גמא ולהפעיל את הדגימות כדי כמות של ⁵¹Cr שוחרר בכל תנאי. דגימות נמדדות בדרך כלל במשך דקה אחת, ומאפשרות קביעה קלה של "ספירות / דקה".
7. בזהירות, להקליט את הסדר שבו הצינורות היו טעונים לתוך הדלפק.

5. ניתוח נתונים

1. כאן, מחשבי PBMCs לא מנוסים נוספו לשלוש העמודות הראשונות, ומחשבי PBMCs מגורה CpG (CpG ODN, (1 מיקרוגרם/מ"ל) עבור 24 שעות) נוספו לעמודות 4-6. ראה טבלה 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
אני	ממוצע של A1,A2,A3 ->		1164.67	סי.פי ספונטני.m		1058.33
J	ממוצע של B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	ממוצע של C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	ממוצע של D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	ממוצע של E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	ממוצע של F1,F2,F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	ממוצע של G1,G2,G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	ממוצע H1,H2,H3 ->		8884.67	מקסימום C.p.m		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	יחס E:T

טבלה 2: ⁵¹Cr לשחרר נתוני צ'ק: ערכי נתונים 'ספירה לדקה' / 'c. p.m', ערכי c. p.m ממוצעים וערכי תמותה ספציפיים באחוזים מחושבים.

2. הנתונים שנאספו (ספירות לדקה, כלומר.c.p.m) הוזנו לתאי גיליון אלקטרוני באותו אופן שבו הדגימות הונחו בלוח המקורי.
3. ראשית, הממוצעים של הטריפליקאטים חושבו. טבלה 2 - תאים I3 עד P3, עבור מחשבי PBMCs ותאים לא מנוסים I6 עד P6, עבור מחשבי PBMC מגורה CpG.
4. לאחר קביעת הממוצעים, אחוז תמיסת הספציפית עבור כל תנאי חושב באמצעות הנוסחה הבאה-
   
   
5. אחוז תמוגה ספציפית חושב עבור כל תנאי (טבלה 2 - תאים J4 עד O4, עבור מחשבי PBMCs unstimulated ו- J7 ל- O7, עבור מחשבי PBMCs לא מנוסים).