דילול סדרתי ו ציפוי: ספירה מיקרוביאלית

1. הגדרת

1. תרשים זרימה המפרט את כל החומרים, פרוטוקול ניסיוני צעד ושיטה למחיקת חומרים מתכלים צריכים להיכתב במחברת מעבדה ושמר ליד סביבת העבודה הניסיונית.
2. יש לעקר סביבות עבודה עם חומר חיטוי מתאים (70% אתנול) ועל הנסיין למתן את סכנת הזיהום על ידי לבישת בגדי מעבדה נקיים המגינים עליהם גם מפני אנומליות חשיפה. בגדים מתאימים כוללים אך אינם מוגבלים לחלוק מעבדה, כפפות לטקס או ניטריל, גוגל, מכונות הנשמה ונעליים סגורות. זה קריטי כדי לשמור על טכניקה אספטית בכל עת.
3. הכן 90 מ"ל של 0.45% מלוחים. באמצעות גליל בוגר נקי, למדוד 90 מ"ל של מים סטריליים ולהעביר אותו בקבוקון Erlenmeyer נקי שכותרתו 0.45% מלוחים. שקלו 0.405 גרם נתרן כלורי (סיגמא-אולדריץ' NaCl S9888) והוסיפו אותו לבקבוקון שכותרתו 0.45% מלוחים. מערבבים שוב ושוב עד שאף מבול לא נשאר גלוי.
4. עם השלמת, הנסיין צריך לעקר מחדש את כל המשטחים ולהשליך כל אורגניזמים לא רצויים, מלאי דילול, צלחות פטרי, או לולאות חנק חד פעמיות על פי הנחיות OSHA. ניתן להסיר בגדי מעבדה לפני שטיפת ידיים.

2. הכנה לתקשורת

1. בחר מדיה המתאימה לטיפוח אורגניזם רצוי. ברוב התרחישים, מרק יאפשר צמיחה חיידקית מספקת. מאז אורגניזמים מפרוטוקול וינוגרדסקי רצויים כאן, טור המורכב סידן פחמתי, גופרית, תאית ובוץ הורכב ונשאר ללא הפרעה במשך 7 ימים. הטור המופרד לחלקים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים.
2. בחר מדיום המתאים ל ציפוי האורגניזם של עניין. תוספי של מדיה נוזלית עם אגר כיתה מיקרוביולוגיה מועסק בדרך כלל כסוכן מתגבש. LB בינוני / אגר מספיק בעת קצירת דגימות מאזורים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים של הטור forenamed. הערה: דגימות מהאזור המיקרואורופילי לא נקצרים עבור הליך זה. עם זאת, אורגניזמים אלה צריכים להיות מעובדים בצנצנות נרות. החדרת נר לתא הטיפוח הזה לפני האיטום יוצרת סביבת חמצן נמוכה המתאימה להתפשטות מיקרואורופילית.
3. מאז אנחנו רוצים להכין 250 מ"ל, להשתמש 500 מ"ל (או גדול יותר) צלוחיות Erlenmeyer כדי למנוע boil-over בעת autoclaving. תייג אחד "מרק" והשני "אגר".
4. קבע את כמות המדיה הדרושה ליצירת כל פתרון על-ידי ביצוע המלצות הריכוז של היצרן. LB אגר, המשמש כאן, מוכן על ידי שילוב 25 גרם / L עם מים אולטרה pure. נפח של 250 מ"ל שלנו דורש פתרון של 6.25 LB אגר / 250 מ"ל מים. באופן דומה, מרק LB מוכן על ידי שילוב אותו יחס של מרק LB ומים. מאז זה לא בתוספת עם סוכן מתגבש, זה לא להקשיח כאשר מקורר.
5. שקול את המדיה ומערבב אותה עם מים בפרופורציות העולות בקנה אחד עם המלצות היצרן. הוסף 6.25 גרם של LB אגר לבקבוקון שכותרתו "אגר", ו 6.25 גרם של מרק LB לבקבוקון שכותרתו "מרק". מוסיפים 250 מ"ל מים אולטרה-תפותיים לכל בקבוקון.
6. עטפו רדיד אלומיניום על כל בקבוקון והשתמשו ב-autoclave כדי לעקר את המדיה למשך 15 דקות לפחות ב-121 מעלות צלזיוס, 15 פסאיי.
7. באמצעות כפפה או כרית עמידים בחום, להסיר את הבקבוקונים מן autoclave עם השלמת המחזור ומניחים אותם באמבט מים 40-50 מעלות צלזיוס.
8. לאחר הטמפרטורה המתאימה כבר הגיע, לשפוך את התוכן של הבקבוקון שכותרתו "מרק" לתוך 250 מ"ל Erlenmeyer, או בקבוקון עגול התחתון. תייג את הבקבוקון 250 מ"ל "פתרון_0".
9. להשיג 10, 100mm x 15 מ"מ צלחות פטרי סטריליות ולתייג אותם עם התאריך, שם, סוג המדיה בשימוש ואת אזור העמודה Winogradsky כי אורגניזמים ייקצרו.
10. מוציאים את הבקבוקון שכותרתו "אגר" מאמבט המים ומתחילים לשפוך לתוך כל אחת מעשר מנות הפטרי. לא יותר מ 15 מ"ל יש להוסיף לכל מנה. זה יכול להתבצע גם עם pipettor ו 25 מ"ל סרולוגי pipette כדי לשפר את הדיוק. השתמש קצה pipette סטרילי כדי להסיר את כל הבועות הקיימות, ולאחר מכן לכסות עם מכסי הצלחת ולהשאיר להתמצק לילה.

3. הכנה מדוללת

1. הכן עשר מבחנה המסוגלות לאחסן 20 מ"ל או יותר בארון תקשורת ולתייג אותן T1-T10. כל מספר צינור עולה בקנה אחד עם גורם הדילול אליו הוא מתאים (כלומר, T4 = 1x10^-4 או 0.0001 או 1/10,000th של ריכוז מלאי).
2. צינור 9 מ"ל של 0.45% מלוחים לתוך כל אחת מ -10 המבחנות.
3. כדורי סרק מלוחים מוכנים כעת לעוקר על ידי autoclave. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות כל אחת מ -10 המבחנות ולאחר מכן העבר אותן למתלה מבחנה תואם אוטומטית. לחטא במשך מינימום של 15 דקות ב 121°C, 15 פסאיי.
4. הסר ריק באמצעות כפפות עמידות בחום ולאפשר להתקרר. לכסות ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך כאשר הצינורות הגיעו לטמפרטורת החדר, או כאשר קריר למגע.

4. טיפוח אורגניזם היעד

1. לחסן " פתרון₀" עם מושבה אחת מצלחת מפוספסת בעבר או 50 μL של מלאי קפוא. אפשר זמן האורגניזם היעד לשכפל על ידי הצבת " פתרון₀" מחוסן לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד (במידת הצורך). (הערה: הבקבוקון צריך להיות מכוסה כדי למנוע זיהום. אם האורגניזם היעד הוא אירובי, השתמש גזה סטרילית ותקעים כותנה כדי למנוע זיהום. אם בוחנים אזורים בעמודה של וינוגרדסקי, פשוט הסירו גרם אחד מכל אזור רצוי (אירובי ואנאירובי למטרות מחקר זה) והיתכנו מחדש ב- T1 לפני שתמשיכו לשלב 5.3.

5. דילול סדרתי

1. להשיג את הבקבוקון שכותרתו "מרק מיזים" מן האינקובטור ולנער במרץ.
2. Pipet 1 מ"ל של " פתרון₀" לתוך המבחנה שכותרתו T1. מערבולת T1. אם בוחנים את Explants ווינגרדסקי, שקול 1 גרם של האזור הרצוי ולהוסיף אותו T1 לפני מערבולת. (הערה: 1 מ"ל משמש כאן לפשטות - ניתן להשתמש גם בנפחים קטנים יותר או גדולים יותר של דילול).
3. הסר 1 מ"ל מבחנה T1 ולהוסיף אותו מבחנה T2. מערבולת T2.
4. הסר 1 מ"ל מבחנה T2 ולהוסיף אותו במבחנה T3. מערבולת T3.
5. הסר 1 מ"ל מבחנה T3 ולהוסיף אותו במבחנה T4. מערבולת טי-4.
6. הסר 1 מ"ל מבחנה T4 ולהוסיף אותו במבחנה T5. מערבולת T5.
7. הסר 1 מ"ל מבחנה T5 ולהוסיף אותו מבחנה T6. מערבולת T6.
8. הסר 1 מ"ל מבחנה T6 ולהוסיף אותו במבחנה T7. מערבולת T7.
9. הסר 1 מ"ל מבחנה T7 ולהוסיף אותו מבחנה T8. מערבולת T8.
10. הסר 1 מ"ל מבחנה T8 ולהוסיף אותו במבחנה T9. מערבולת טי-9.
11. הסר 1 מ"ל מבחנה T9 ולהוסיף אותו במבחנה T10.

6. ציפוי התפשטות

1. Pipet 100 μL של מדגם מדולל מ T1 ישירות על צלחת פטרי. שלב זה יכול להיות, אבל לא צריך להיות, חוזר על עצמו עבור כל צינור.
2. יש להשיג מוט מתפשט סטרילי וחד פעמי או להבה לחטא מוט התפשטות זכוכית. בתנועה בכיוון השעון/נגד כיוון השעון, החלק האופקי של מוט ההתפשטות כדי לחלק את המדגם באותה מידה בתוך צלחת הפטרי.
3. חזור על הפעולה עבור כל אזור בעמודה Winogradsky שיש להעריך.
4. לוחות דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אנאירובי.

7. פסים

1. בחר דילול מתאים של אורגניזם היעד שלך. לדוגמה, פתרון₄ יניב דילול של 1/10,000 של הריכוז הראשוני שלך. בדרך כלל, דילול של 1/1,000^th (T3/Solution), 1/1,000,000^th (T6/Solution₆₎ו-1/1,000,000,000^th (T9/Solution₉) מוערכים כדי למנות חיידקים.
2. באמצעות לולאת חנק חד פעמית סטרילית מפלסטיק או לולאת חנק מתכת לשימוש חוזר שהייתה תחת אש במשך לא פחות מ -10 שניות, לטבול את הפתרון הרצוי מהשלב 5. לולאות חקינה מכוילות אמורות להעביר 0.01 מ"ל. (אזהרה: אין לאפשר לולאה להבה ליצור קשר עם חיידקים מיד לאחר הסרת מהחום)
3. להעלות מעט את כיסוי צלחת פטרי בצד אחד, כך רק לולאה מכחיק יכול לגשת אגר. גלה את הלולאה המחוסנת על פני החלק העליון של התקשורת בצורה זיג-זג נזהר לא להתפשר על אגר. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.
4. השתמש בלולאת פיקוח חד פעמית חדשה או עיקור מחדש של הלולאה הניתן לשימוש חוזר.
5. סובב את הלוח בערך פי^1/3 (~ 118°) והפחית את תדירות תנועת זיג-זג.
6. שוב, השתמש בלולאה חד פעמית חדשה או עקר מחדש לולאת מתכת לפני סיבוב בפעם האחרונה והפחית את תדר הזיג-זג פעם נוספת. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.
7. חזור על שלבים 7.2 - 7.6 עד שלפחות שלוש מנות פטרי פוספסו במשך שלושה דילולים שונים, באמצעות לולאה חד פעמית חדשה או על ידי הלולאה לשימוש חוזר(איור 2).
8. הניחו בין לילה מנות פטרי מפוספסות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אירובי.

8. ניתוח נתונים ותוצאות

1. תרבויות נקצרו מהאזורים האוקסיים והאנוקסיים של טור וינוגרדסקי בן 7 ימים. אזורים אלה מתאימים לאנרובים הטרוטרופיים ומחמצן ברזל, בהתאמה.
2. מסלקי העמודים היו מדוללים באופן סדרתי לפני פסים או התפשטות על לוחות אגר LB.
3. פסים חשפו אוכלוסייה מעורבת מכל אחד מאזורי וינוגרדסקי שהוערכו. לוחות התפשטות הניבו תוצאות דומות.
4. כדי לחשב CFU/mL או CFU/g, ממוצע מספר המושבות שנספרו משלוש לוחות. הכפל את המספר הממוצע של מושבות על ידי גורם הדילול ולחלק בסכום aliquoted. לדוגמה, אם נספרו בממוצע 65 מושבות על לוחות שחוסנו עם 0.1 מ"ל של פתרון₆ (T6) הנוסחה שתוארה בעבר תהיה שווה ל- 650,000,000 יחידות רה-תכליתיות /mL.
5. כעת ניתן לבחור מושבות מבודדות מכל צלחת לשימוש בבדיקות העשרה כדי לקבוע את זהות המינים.