דילול סדרתי ו ציפוי: ספירה מיקרוביאלית
1. הגדרת
- תרשים זרימה המפרט את כל החומרים, פרוטוקול ניסיוני צעד ושיטה למחיקת חומרים מתכלים צריכים להיכתב במחברת מעבדה ושמר ליד סביבת העבודה הניסיונית.
- יש לעקר סביבות עבודה עם חומר חיטוי מתאים (70% אתנול) ועל הנסיין למתן את סכנת הזיהום על ידי לבישת בגדי מעבדה נקיים המגינים עליהם גם מפני אנומליות חשיפה. בגדים מתאימים כוללים אך אינם מוגבלים לחלוק מעבדה, כפפות לטקס או ניטריל, גוגל, מכונות הנשמה ונעליים סגורות. זה קריטי כדי לשמור על טכניקה אספטית בכל עת.
- הכן 90 מ"ל של 0.45% מלוחים. באמצעות גליל בוגר נקי, למדוד 90 מ"ל של מים סטריליים ולהעביר אותו בקבוקון Erlenmeyer נקי שכותרתו 0.45% מלוחים. שקלו 0.405 גרם נתרן כלורי (סיגמא-אולדריץ' NaCl S9888) והוסיפו אותו לבקבוקון שכותרתו 0.45% מלוחים. מערבבים שוב ושוב עד שאף מבול לא נשאר גלוי.
- עם השלמת, הנסיין צריך לעקר מחדש את כל המשטחים ולהשליך כל אורגניזמים לא רצויים, מלאי דילול, צלחות פטרי, או לולאות חנק חד פעמיות על פי הנחיות OSHA. ניתן להסיר בגדי מעבדה לפני שטיפת ידיים.
2. הכנה לתקשורת
- בחר מדיה המתאימה לטיפוח אורגניזם רצוי. ברוב התרחישים, מרק יאפשר צמיחה חיידקית מספקת. מאז אורגניזמים מפרוטוקול וינוגרדסקי רצויים כאן, טור המורכב סידן פחמתי, גופרית, תאית ובוץ הורכב ונשאר ללא הפרעה במשך 7 ימים. הטור המופרד לחלקים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים.
- בחר מדיום המתאים ל ציפוי האורגניזם של עניין. תוספי של מדיה נוזלית עם אגר כיתה מיקרוביולוגיה מועסק בדרך כלל כסוכן מתגבש. LB בינוני / אגר מספיק בעת קצירת דגימות מאזורים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים של הטור forenamed. הערה: דגימות מהאזור המיקרואורופילי לא נקצרים עבור הליך זה. עם זאת, אורגניזמים אלה צריכים להיות מעובדים בצנצנות נרות. החדרת נר לתא הטיפוח הזה לפני האיטום יוצרת סביבת חמצן נמוכה המתאימה להתפשטות מיקרואורופילית.
- מאז אנחנו רוצים להכין 250 מ"ל, להשתמש 500 מ"ל (או גדול יותר) צלוחיות Erlenmeyer כדי למנוע boil-over בעת autoclaving. תייג אחד "מרק" והשני "אגר".
- קבע את כמות המדיה הדרושה ליצירת כל פתרון על-ידי ביצוע המלצות הריכוז של היצרן. LB אגר, המשמש כאן, מוכן על ידי שילוב 25 גרם / L עם מים אולטרה pure. נפח של 250 מ"ל שלנו דורש פתרון של 6.25 LB אגר / 250 מ"ל מים. באופן דומה, מרק LB מוכן על ידי שילוב אותו יחס של מרק LB ומים. מאז זה לא בתוספת עם סוכן מתגבש, זה לא להקשיח כאשר מקורר.
- שקול את המדיה ומערבב אותה עם מים בפרופורציות העולות בקנה אחד עם המלצות היצרן. הוסף 6.25 גרם של LB אגר לבקבוקון שכותרתו "אגר", ו 6.25 גרם של מרק LB לבקבוקון שכותרתו "מרק". מוסיפים 250 מ"ל מים אולטרה-תפותיים לכל בקבוקון.
- עטפו רדיד אלומיניום על כל בקבוקון והשתמשו ב-autoclave כדי לעקר את המדיה למשך 15 דקות לפחות ב-121 מעלות צלזיוס, 15 פסאיי.
- באמצעות כפפה או כרית עמידים בחום, להסיר את הבקבוקונים מן autoclave עם השלמת המחזור ומניחים אותם באמבט מים 40-50 מעלות צלזיוס.
- לאחר הטמפרטורה המתאימה כבר הגיע, לשפוך את התוכן של הבקבוקון שכותרתו "מרק" לתוך 250 מ"ל Erlenmeyer, או בקבוקון עגול התחתון. תייג את הבקבוקון 250 מ"ל "פתרון0".
- להשיג 10, 100mm x 15 מ"מ צלחות פטרי סטריליות ולתייג אותם עם התאריך, שם, סוג המדיה בשימוש ואת אזור העמודה Winogradsky כי אורגניזמים ייקצרו.
- מוציאים את הבקבוקון שכותרתו "אגר" מאמבט המים ומתחילים לשפוך לתוך כל אחת מעשר מנות הפטרי. לא יותר מ 15 מ"ל יש להוסיף לכל מנה. זה יכול להתבצע גם עם pipettor ו 25 מ"ל סרולוגי pipette כדי לשפר את הדיוק. השתמש קצה pipette סטרילי כדי להסיר את כל הבועות הקיימות, ולאחר מכן לכסות עם מכסי הצלחת ולהשאיר להתמצק לילה.
3. הכנה מדוללת
- הכן עשר מבחנה המסוגלות לאחסן 20 מ"ל או יותר בארון תקשורת ולתייג אותן T1-T10. כל מספר צינור עולה בקנה אחד עם גורם הדילול אליו הוא מתאים (כלומר, T4 = 1x10-4 או 0.0001 או 1/10,000th של ריכוז מלאי).
- צינור 9 מ"ל של 0.45% מלוחים לתוך כל אחת מ -10 המבחנות.
- כדורי סרק מלוחים מוכנים כעת לעוקר על ידי autoclave. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות כל אחת מ -10 המבחנות ולאחר מכן העבר אותן למתלה מבחנה תואם אוטומטית. לחטא במשך מינימום של 15 דקות ב 121°C, 15 פסאיי.
- הסר ריק באמצעות כפפות עמידות בחום ולאפשר להתקרר. לכסות ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך כאשר הצינורות הגיעו לטמפרטורת החדר, או כאשר קריר למגע.
4. טיפוח אורגניזם היעד
- לחסן " פתרון0" עם מושבה אחת מצלחת מפוספסת בעבר או 50 μL של מלאי קפוא. אפשר זמן האורגניזם היעד לשכפל על ידי הצבת " פתרון0" מחוסן לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד (במידת הצורך). (הערה: הבקבוקון צריך להיות מכוסה כדי למנוע זיהום. אם האורגניזם היעד הוא אירובי, השתמש גזה סטרילית ותקעים כותנה כדי למנוע זיהום. אם בוחנים אזורים בעמודה של וינוגרדסקי, פשוט הסירו גרם אחד מכל אזור רצוי (אירובי ואנאירובי למטרות מחקר זה) והיתכנו מחדש ב- T1 לפני שתמשיכו לשלב 5.3.
5. דילול סדרתי
- להשיג את הבקבוקון שכותרתו "מרק מיזים" מן האינקובטור ולנער במרץ.
- Pipet 1 מ"ל של " פתרון0" לתוך המבחנה שכותרתו T1. מערבולת T1. אם בוחנים את Explants ווינגרדסקי, שקול 1 גרם של האזור הרצוי ולהוסיף אותו T1 לפני מערבולת. (הערה: 1 מ"ל משמש כאן לפשטות - ניתן להשתמש גם בנפחים קטנים יותר או גדולים יותר של דילול).
- הסר 1 מ"ל מבחנה T1 ולהוסיף אותו מבחנה T2. מערבולת T2.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T2 ולהוסיף אותו במבחנה T3. מערבולת T3.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T3 ולהוסיף אותו במבחנה T4. מערבולת טי-4.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T4 ולהוסיף אותו במבחנה T5. מערבולת T5.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T5 ולהוסיף אותו מבחנה T6. מערבולת T6.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T6 ולהוסיף אותו במבחנה T7. מערבולת T7.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T7 ולהוסיף אותו מבחנה T8. מערבולת T8.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T8 ולהוסיף אותו במבחנה T9. מערבולת טי-9.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T9 ולהוסיף אותו במבחנה T10.
6. ציפוי התפשטות
- Pipet 100 μL של מדגם מדולל מ T1 ישירות על צלחת פטרי. שלב זה יכול להיות, אבל לא צריך להיות, חוזר על עצמו עבור כל צינור.
- יש להשיג מוט מתפשט סטרילי וחד פעמי או להבה לחטא מוט התפשטות זכוכית. בתנועה בכיוון השעון/נגד כיוון השעון, החלק האופקי של מוט ההתפשטות כדי לחלק את המדגם באותה מידה בתוך צלחת הפטרי.
- חזור על הפעולה עבור כל אזור בעמודה Winogradsky שיש להעריך.
- לוחות דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אנאירובי.
7. פסים
- בחר דילול מתאים של אורגניזם היעד שלך. לדוגמה, פתרון4 יניב דילול של 1/10,000 של הריכוז הראשוני שלך. בדרך כלל, דילול של 1/1,000th (T3/Solution), 1/1,000,000th (T6/Solution6)ו-1/1,000,000,000th (T9/Solution9) מוערכים כדי למנות חיידקים.
- באמצעות לולאת חנק חד פעמית סטרילית מפלסטיק או לולאת חנק מתכת לשימוש חוזר שהייתה תחת אש במשך לא פחות מ -10 שניות, לטבול את הפתרון הרצוי מהשלב 5. לולאות חקינה מכוילות אמורות להעביר 0.01 מ"ל. (אזהרה: אין לאפשר לולאה להבה ליצור קשר עם חיידקים מיד לאחר הסרת מהחום)
- להעלות מעט את כיסוי צלחת פטרי בצד אחד, כך רק לולאה מכחיק יכול לגשת אגר. גלה את הלולאה המחוסנת על פני החלק העליון של התקשורת בצורה זיג-זג נזהר לא להתפשר על אגר. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.
- השתמש בלולאת פיקוח חד פעמית חדשה או עיקור מחדש של הלולאה הניתן לשימוש חוזר.
- סובב את הלוח בערך פי1/3 (~ 118°) והפחית את תדירות תנועת זיג-זג.
- שוב, השתמש בלולאה חד פעמית חדשה או עקר מחדש לולאת מתכת לפני סיבוב בפעם האחרונה והפחית את תדר הזיג-זג פעם נוספת. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.
- חזור על שלבים 7.2 - 7.6 עד שלפחות שלוש מנות פטרי פוספסו במשך שלושה דילולים שונים, באמצעות לולאה חד פעמית חדשה או על ידי הלולאה לשימוש חוזר(איור 2).
- הניחו בין לילה מנות פטרי מפוספסות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אירובי.
8. ניתוח נתונים ותוצאות
- תרבויות נקצרו מהאזורים האוקסיים והאנוקסיים של טור וינוגרדסקי בן 7 ימים. אזורים אלה מתאימים לאנרובים הטרוטרופיים ומחמצן ברזל, בהתאמה.
- מסלקי העמודים היו מדוללים באופן סדרתי לפני פסים או התפשטות על לוחות אגר LB.
- פסים חשפו אוכלוסייה מעורבת מכל אחד מאזורי וינוגרדסקי שהוערכו. לוחות התפשטות הניבו תוצאות דומות.
- כדי לחשב CFU/mL או CFU/g, ממוצע מספר המושבות שנספרו משלוש לוחות. הכפל את המספר הממוצע של מושבות על ידי גורם הדילול ולחלק בסכום aliquoted. לדוגמה, אם נספרו בממוצע 65 מושבות על לוחות שחוסנו עם 0.1 מ"ל של פתרון6 (T6) הנוסחה שתוארה בעבר תהיה שווה ל- 650,000,000 יחידות רה-תכליתיות /mL.
- כעת ניתן לבחור מושבות מבודדות מכל צלחת לשימוש בבדיקות העשרה כדי לקבוע את זהות המינים.
מקור:ג'ונתןפ. בלייז 1 , אליזבת סוטר1, וכריסטופר פ קורבו1
1 המחלקה למדעי הביולוגיה, מכללת וגנר, דרך הקמפוס 1, סטטן איילנד ניו יורק, 10301
הערכה כמותית ש…
1. הגדרת
- תרשים זרימה המפרט את כל החומרים, פרוטוקול ניסיוני צעד ושיטה למחיקת חומרים מתכלים צריכים להיכתב במחברת מעבדה ושמר ליד סביבת העבודה הניסיונית.
- יש לעקר סביבות עבודה עם חומר חיטוי מתאים (70% אתנול) ועל הנסיין למתן את סכנת הזיהום על ידי לבישת בגדי מעבדה נקיים המגינים עליהם גם מפני אנומליות חשיפה. בגדים מתאימים כוללים אך אינם מוגבלים לחלוק מעבדה, כפפות לטקס או ניטריל, גוגל, מכונות הנשמה ונעליים סגורות. זה קריטי כדי לשמור על טכניקה אספטית בכל עת.
- הכן 90 מ"ל של 0.45% מלוחים. באמצעות גליל בוגר נקי, למדוד 90 מ"ל של מים סטריליים ולהעביר אותו בקבוקון Erlenmeyer נקי שכותרתו 0.45% מלוחים. שקלו 0.405 גרם נתרן כלורי (סיגמא-אולדריץ' NaCl S9888) והוסיפו אותו לבקבוקון שכותרתו 0.45% מלוחים. מערבבים שוב ושוב עד שאף מבול לא נשאר גלוי.
- עם השלמת, הנסיין צריך לעקר מחדש את כל המשטחים ולהשליך כל אורגניזמים לא רצויים, מלאי דילול, צלחות פטרי, או לולאות חנק חד פעמיות על פי הנחיות OSHA. ניתן להסיר בגדי מעבדה לפני שטיפת ידיים.
2. הכנה לתקשורת
- בחר מדיה המתאימה לטיפוח אורגניזם רצוי. ברוב התרחישים, מרק יאפשר צמיחה חיידקית מספקת. מאז אורגניזמים מפרוטוקול וינוגרדסקי רצויים כאן, טור המורכב סידן פחמתי, גופרית, תאית ובוץ הורכב ונשאר ללא הפרעה במשך 7 ימים. הטור המופרד לחלקים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים.
- בחר מדיום המתאים ל ציפוי האורגניזם של עניין. תוספי של מדיה נוזלית עם אגר כיתה מיקרוביולוגיה מועסק בדרך כלל כסוכן מתגבש. LB בינוני / אגר מספיק בעת קצירת דגימות מאזורים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים של הטור forenamed. הערה: דגימות מהאזור המיקרואורופילי לא נקצרים עבור הליך זה. עם זאת, אורגניזמים אלה צריכים להיות מעובדים בצנצנות נרות. החדרת נר לתא הטיפוח הזה לפני האיטום יוצרת סביבת חמצן נמוכה המתאימה להתפשטות מיקרואורופילית.
- מאז אנחנו רוצים להכין 250 מ"ל, להשתמש 500 מ"ל (או גדול יותר) צלוחיות Erlenmeyer כדי למנוע boil-over בעת autoclaving. תייג אחד "מרק" והשני "אגר".
- קבע את כמות המדיה הדרושה ליצירת כל פתרון על-ידי ביצוע המלצות הריכוז של היצרן. LB אגר, המשמש כאן, מוכן על ידי שילוב 25 גרם / L עם מים אולטרה pure. נפח של 250 מ"ל שלנו דורש פתרון של 6.25 LB אגר / 250 מ"ל מים. באופן דומה, מרק LB מוכן על ידי שילוב אותו יחס של מרק LB ומים. מאז זה לא בתוספת עם סוכן מתגבש, זה לא להקשיח כאשר מקורר.
- שקול את המדיה ומערבב אותה עם מים בפרופורציות העולות בקנה אחד עם המלצות היצרן. הוסף 6.25 גרם של LB אגר לבקבוקון שכותרתו "אגר", ו 6.25 גרם של מרק LB לבקבוקון שכותרתו "מרק". מוסיפים 250 מ"ל מים אולטרה-תפותיים לכל בקבוקון.
- עטפו רדיד אלומיניום על כל בקבוקון והשתמשו ב-autoclave כדי לעקר את המדיה למשך 15 דקות לפחות ב-121 מעלות צלזיוס, 15 פסאיי.
- באמצעות כפפה או כרית עמידים בחום, להסיר את הבקבוקונים מן autoclave עם השלמת המחזור ומניחים אותם באמבט מים 40-50 מעלות צלזיוס.
- לאחר הטמפרטורה המתאימה כבר הגיע, לשפוך את התוכן של הבקבוקון שכותרתו "מרק" לתוך 250 מ"ל Erlenmeyer, או בקבוקון עגול התחתון. תייג את הבקבוקון 250 מ"ל "פתרון0".
- להשיג 10, 100mm x 15 מ"מ צלחות פטרי סטריליות ולתייג אותם עם התאריך, שם, סוג המדיה בשימוש ואת אזור העמודה Winogradsky כי אורגניזמים ייקצרו.
- מוציאים את הבקבוקון שכותרתו "אגר" מאמבט המים ומתחילים לשפוך לתוך כל אחת מעשר מנות הפטרי. לא יותר מ 15 מ"ל יש להוסיף לכל מנה. זה יכול להתבצע גם עם pipettor ו 25 מ"ל סרולוגי pipette כדי לשפר את הדיוק. השתמש קצה pipette סטרילי כדי להסיר את כל הבועות הקיימות, ולאחר מכן לכסות עם מכסי הצלחת ולהשאיר להתמצק לילה.
3. הכנה מדוללת
- הכן עשר מבחנה המסוגלות לאחסן 20 מ"ל או יותר בארון תקשורת ולתייג אותן T1-T10. כל מספר צינור עולה בקנה אחד עם גורם הדילול אליו הוא מתאים (כלומר, T4 = 1x10-4 או 0.0001 או 1/10,000th של ריכוז מלאי).
- צינור 9 מ"ל של 0.45% מלוחים לתוך כל אחת מ -10 המבחנות.
- כדורי סרק מלוחים מוכנים כעת לעוקר על ידי autoclave. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות כל אחת מ -10 המבחנות ולאחר מכן העבר אותן למתלה מבחנה תואם אוטומטית. לחטא במשך מינימום של 15 דקות ב 121°C, 15 פסאיי.
- הסר ריק באמצעות כפפות עמידות בחום ולאפשר להתקרר. לכסות ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך כאשר הצינורות הגיעו לטמפרטורת החדר, או כאשר קריר למגע.
4. טיפוח אורגניזם היעד
- לחסן " פתרון0" עם מושבה אחת מצלחת מפוספסת בעבר או 50 μL של מלאי קפוא. אפשר זמן האורגניזם היעד לשכפל על ידי הצבת " פתרון0" מחוסן לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד (במידת הצורך). (הערה: הבקבוקון צריך להיות מכוסה כדי למנוע זיהום. אם האורגניזם היעד הוא אירובי, השתמש גזה סטרילית ותקעים כותנה כדי למנוע זיהום. אם בוחנים אזורים בעמודה של וינוגרדסקי, פשוט הסירו גרם אחד מכל אזור רצוי (אירובי ואנאירובי למטרות מחקר זה) והיתכנו מחדש ב- T1 לפני שתמשיכו לשלב 5.3.
5. דילול סדרתי
- להשיג את הבקבוקון שכותרתו "מרק מיזים" מן האינקובטור ולנער במרץ.
- Pipet 1 מ"ל של " פתרון0" לתוך המבחנה שכותרתו T1. מערבולת T1. אם בוחנים את Explants ווינגרדסקי, שקול 1 גרם של האזור הרצוי ולהוסיף אותו T1 לפני מערבולת. (הערה: 1 מ"ל משמש כאן לפשטות - ניתן להשתמש גם בנפחים קטנים יותר או גדולים יותר של דילול).
- הסר 1 מ"ל מבחנה T1 ולהוסיף אותו מבחנה T2. מערבולת T2.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T2 ולהוסיף אותו במבחנה T3. מערבולת T3.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T3 ולהוסיף אותו במבחנה T4. מערבולת טי-4.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T4 ולהוסיף אותו במבחנה T5. מערבולת T5.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T5 ולהוסיף אותו מבחנה T6. מערבולת T6.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T6 ולהוסיף אותו במבחנה T7. מערבולת T7.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T7 ולהוסיף אותו מבחנה T8. מערבולת T8.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T8 ולהוסיף אותו במבחנה T9. מערבולת טי-9.
- הסר 1 מ"ל מבחנה T9 ולהוסיף אותו במבחנה T10.
6. ציפוי התפשטות
- Pipet 100 μL של מדגם מדולל מ T1 ישירות על צלחת פטרי. שלב זה יכול להיות, אבל לא צריך להיות, חוזר על עצמו עבור כל צינור.
- יש להשיג מוט מתפשט סטרילי וחד פעמי או להבה לחטא מוט התפשטות זכוכית. בתנועה בכיוון השעון/נגד כיוון השעון, החלק האופקי של מוט ההתפשטות כדי לחלק את המדגם באותה מידה בתוך צלחת הפטרי.
- חזור על הפעולה עבור כל אזור בעמודה Winogradsky שיש להעריך.
- לוחות דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אנאירובי.
7. פסים
- בחר דילול מתאים של אורגניזם היעד שלך. לדוגמה, פתרון4 יניב דילול של 1/10,000 של הריכוז הראשוני שלך. בדרך כלל, דילול של 1/1,000th (T3/Solution), 1/1,000,000th (T6/Solution6)ו-1/1,000,000,000th (T9/Solution9) מוערכים כדי למנות חיידקים.
- באמצעות לולאת חנק חד פעמית סטרילית מפלסטיק או לולאת חנק מתכת לשימוש חוזר שהייתה תחת אש במשך לא פחות מ -10 שניות, לטבול את הפתרון הרצוי מהשלב 5. לולאות חקינה מכוילות אמורות להעביר 0.01 מ"ל. (אזהרה: אין לאפשר לולאה להבה ליצור קשר עם חיידקים מיד לאחר הסרת מהחום)
- להעלות מעט את כיסוי צלחת פטרי בצד אחד, כך רק לולאה מכחיק יכול לגשת אגר. גלה את הלולאה המחוסנת על פני החלק העליון של התקשורת בצורה זיג-זג נזהר לא להתפשר על אגר. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.
- השתמש בלולאת פיקוח חד פעמית חדשה או עיקור מחדש של הלולאה הניתן לשימוש חוזר.
- סובב את הלוח בערך פי1/3 (~ 118°) והפחית את תדירות תנועת זיג-זג.
- שוב, השתמש בלולאה חד פעמית חדשה או עקר מחדש לולאת מתכת לפני סיבוב בפעם האחרונה והפחית את תדר הזיג-זג פעם נוספת. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.
- חזור על שלבים 7.2 - 7.6 עד שלפחות שלוש מנות פטרי פוספסו במשך שלושה דילולים שונים, באמצעות לולאה חד פעמית חדשה או על ידי הלולאה לשימוש חוזר(איור 2).
- הניחו בין לילה מנות פטרי מפוספסות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אירובי.
8. ניתוח נתונים ותוצאות
- תרבויות נקצרו מהאזורים האוקסיים והאנוקסיים של טור וינוגרדסקי בן 7 ימים. אזורים אלה מתאימים לאנרובים הטרוטרופיים ומחמצן ברזל, בהתאמה.
- מסלקי העמודים היו מדוללים באופן סדרתי לפני פסים או התפשטות על לוחות אגר LB.
- פסים חשפו אוכלוסייה מעורבת מכל אחד מאזורי וינוגרדסקי שהוערכו. לוחות התפשטות הניבו תוצאות דומות.
- כדי לחשב CFU/mL או CFU/g, ממוצע מספר המושבות שנספרו משלוש לוחות. הכפל את המספר הממוצע של מושבות על ידי גורם הדילול ולחלק בסכום aliquoted. לדוגמה, אם נספרו בממוצע 65 מושבות על לוחות שחוסנו עם 0.1 מ"ל של פתרון6 (T6) הנוסחה שתוארה בעבר תהיה שווה ל- 650,000,000 יחידות רה-תכליתיות /mL.
- כעת ניתן לבחור מושבות מבודדות מכל צלחת לשימוש בבדיקות העשרה כדי לקבוע את זהות המינים.
לפעמים, כדי לזהות ולחקור חיידקים אנחנו צריכים קודם כל לבודד ולהעשיר אותם מדגימה. לדוגמה, דגימות שהתקבלו מעמודת וינוגרדסקי הן מעורבות, כלומר הן מכילות מינים או זנים רבים של חיידקים, כך שחקר חיידק בודד או ספירת הסוגים השונים הקיימים יכולים להיות מאתגרים. לשם כך, טכניקות דילול וציפוי סדרתיות משמשות בדרך כלל כדי לכמת באופן אמין את העומס החיידקי ולבודד מושבות בודדות.
דילול סדרתי הוא תהליך שבאמצעותו ריכוז האורגניזם, חיידקים בדוגמה זו, מופחת באופן שיטתי באמצעות השעיה עוקבת בכמויות קבועות של מדלל נוזלי. בדרך כלל נפח המדלל הוא כפולה של 10 כדי להקל על הפחתה לוגריתמית של אורגניזם הדגימה. לדוגמה, גרם אחד של משקעים מוסר תחילה מאזור העניין של וינוגרדסקי ומתווסף ל-10 מיליליטר של מדיום נוזלי מתאים. לאחר מכן, מיליליטר אחד של דילול ראשון זה מתווסף לצינור אחר המכיל תשעה מיליליטר של מדיום. ניתן לחזור על התהליך עד שהכינו מספר ריכוזים שונים של חיידקים. דילול סדרתי הוא המפתח לספירת חיידקים בדוגמה זו, מכיוון שדגימות מעורבות מעמודת וינוגרדסקי מכילות מספר לא ידוע, לעתים קרובות גדול, של חיידקים.
לאחר מכן, ציפוי פסים וציפוי מפוזר מאפשרים בידוד וספירה של חיידקים בתוך דגימה, בהתאמה. פסים מושגים על ידי הכנסת דגימה מדוללת לחלק אחד של המדיום המוצק בתוספת חומר מזין, המחולק לשלישים. לאחר מכן מורחים את החיסון הזה על כל שליש של הצלחת בתבנית זיג-זג. כאשר חלקים שונים של הצלחת מפוספסים, חוצים מהדגימה הקודמת פעם אחת בלבד, הדגימה נמרחת דק יותר. המשמעות היא שייתכן שתצטרך לפס רק מדילול אחד כדי להשיג מושבות בודדות בסעיפים המאוחרים יותר. לאחר הדגירה, הלוחות המפוספסים מאפשרים תצפיות על מורפולוגיה של המושבה, מידע שיכול לעזור להבדיל בין מיני חיידקים שונים.
לחלופין, אם המטרה העיקרית היא ספירת החיידקים בדגימה, ניתן להשתמש בציפוי מפוזר. בציפוי מפוזר, כמות של דגימה בודדת מפוזרת באופן שווה על פני כל שטח המדיום המוצק. בדרך כלל, מכיוון שאיננו יודעים את מספרי החיידקים בדגימה המעורבת, נוצרת צלחת פיזור לכל אחד מהדילולים או מדגם מייצג שלהם. לאחר הדגירה, ניתן לבצע ספירה באמצעות לוחות פרוסים אלה. יש להשליך כל צלחות עם ספירת מושבות נמוכה מ-30, מכיוון שספירה קטנה נתונה לשגיאות גדולות יותר. באופן דומה, יש להשליך כל ספירה מעל 300 מכיוון שצפיפות וחפיפה של מושבות עלולות להוביל להערכת חסר של ספירת המושבות. אם ספירת המושבה של כל אחת מהמנות הנותרות הללו נרשמת ומוכפלת במקדם הדילול, ולאחר מכן מחולקת בנפח המצופה, זה מניב את היחידות היוצרות מושבה, או CFUs, למיליליטר של תרחיף. בסרטון זה תלמדו כיצד להעריך באופן איכותי וכמותי דגימה המכילה חיידק ידוע, ואת הקהילות המיקרוביאליות הכלולות באזורים שונים של עמוד וינוגרדסקי באמצעות דילול סדרתי, ציפוי מפוזר וציפוי פסים.
ראשית, לבשו כל ציוד מגן אישי מתאים כולל מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. לאחר מכן, יש לעקר את סביבת העבודה עם 70% אתנול ולנגב את פני השטח. לאחר מכן, אספו שתי צלוחיות ארלנמאייר של 500 מיליליטר וסמנו מרק אחד ואת האגר השני. להכנת תמיסת אגר LB, מערבבים כ -6.25 גרם אגר LB, שלושה גרם אגר טכני ו -250 מיליליטר מים מזוקקים בבקבוק המסומן אגר.
לאחר מכן, הכינו מרק LB על ידי שילוב של 2. 5 גרם מדיה LB ו-100 מיליליטר מים מזוקקים במרק המסומן בבקבוק. לאחר חיטוי הצלוחיות השתמשו בכפפה עמידה בחום כדי להוציא את הצלוחיות מהחיטוי ולהניח אותן באמבט מים של 40 עד 50 מעלות צלזיוס. לאחר שהצלוחיות הן 50 מעלות צלזיוס, הכינו בזהירות שלוש תמיסת המרק של 100 מיליליטר וסמנו כל תמיסת אליקוט אפס. לאחר מכן, אספו 10 צלחות פטרי סטריליות ותייגו אותן עם התאריך, השם, סוג המדיה שבה נעשה שימוש ואזור עמוד וינוגרדסקי שממנו ייאספו האורגניזמים. פיפטה 15 מיליליטר אגר מבקבוק האגר לכל צלחת פטרי. לאחר מכן, השתמש בקצה הפיפטה כדי להסיר בועות, החזר את מכסי הצלחת למקומו ואפשר להם להתמצק על גבי הספסל למשך הלילה.
למחרת, נגב את הספסל עם 70% אתנול. לאחר מכן, סמן 10 מבחנות 20 מיליליטר T1 עד T10 והנח אותן במתלה. פיפטה תשעה מיליליטר של 0.45% מי מלח לכל צינור. כעת, כסו כל אחת מ-10 המבחנות באופן רופף עם הכובעים שלהן והעבירו אותן למתלה מבחנה תואם חיטוי. לאחר השלמת המחזור, הסר את החסר במי מלח בעזרת כפפות עמידות בחום והניח להם להתקרר. אחסן את הצינורות בטמפרטורת החדר עד שהם מגיעים לכ-22 מעלות צלזיוס.
כדי לטפח אורגניזם מטרה ידוע, E. coli בדוגמה זו, חסנו 100 מיליליטר של תמיסה אפס עם מושבה אחת מצלחת מפוספסת בעבר. לאחר מכן, כסו את הצינור ודגרו אותו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי להעריך את האזורים של עמודת וינוגרדסקי, הוסף כגרם אחד של חומר מהאזור האירובי ל-T1 והשהה מחדש על ידי מערבולת. לאחר מכן, חזור על תהליך זה עם גרם אחד של חומר מהאזור האנאירובי.
הוציאו את הצינור המכיל תמיסה אפס מחוסנת ב-E. coli מהאינקובטור ונערו אותו. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד מהתמיסה לתוך מבחנה T1 ומערבולת לערבוב. הסר מיליליטר אחד של תמיסה מ- T1 והעביר אותו ל- T2, מערבולת לערבב. חזור על תהליך זה דרך צינור T10. כדי להעריך את האזורים האירוביים והאנאירוביים של עמוד וינוגרדסקי, הסר מיליליטר אחד של תמיסה מכל אחד מצינורות ה- T1 שהוכנו בעבר והעביר אותו לצינורות T2 המתאימים. לאחר מכן, המשך בדילולים הסדרתיים דרך צינורות T10 כפי שהודגם קודם לכן.
כדי לפזר צלחת, פיפטה 100 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת מכל צינור T3 על צלחת הפטרי המתאימה. לאחר מכן, השתמש במוט פיזור סטרילי כדי לפזר בעדינות את הדגימה על צלחת הפטרי ולהחליף את מכסה הצלחת. חזור על תהליך זה עבור דילול T6 ו-T9, כפי שהודגם קודם לכן. דגרו את הצלחות המכילות אורגניזמים אירוביים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. דגרו את הצלחות המכילות אורגניזמים אנאירוביים בתא אנאירובי המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת הסר את לוחות הדילול T3, T6 ו-T9 מהאינקובטור ומהתא האנאירובי והעביר אותם למשטח הספסל. בעבודה עם צלחת אחת בכל פעם, החלק לולאת חיסון סטרילית על פני החלק העליון של המדיה בתבנית זיג-זג. לאחר מכן, החזר את מכסה צלחת הפטרי. לאחר מכן, סובב את הצלחת ב -1/3 ועקר את הלולאה כדי להפחית את תדירות דפוס הזיגזג שנעשה בעבר. שוב, לאחר עיקור הלולאה, סובב את הצלחת ב-1/3, הפחת את תדירות דפוס הזיגזג בפעם האחרונה והחלף את המכסה. חזור על שיטת פסים זו עבור הלוחות הנותרים, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר מכן, הניחו את הלוחות המפוספסים המכילים אורגניזמים אירוביים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ואת הלוחות המפוספסים המכילים אורגניזמים אנאירוביים בתא אנאירובי המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
תרביות נאספו מהאזורים האירוביים והאנאירוביים של עמוד וינוגרדסקי בן שבעה ימים. לאחר מכן, התרביות דוללו באופן סדרתי לפני הפסים וההתפשטות על לוחות אגר LB. פסים חשפו אוכלוסייה מעורבת מכל אחד מאזורי וינוגרדסקי שהוערכו, ולוחות הפיזור הניבו תוצאות דומות. צלחת מפוספסת מאוכלוסייה מעורבת תביא למושבות חיידקים בצורות, גדלים, מרקמים וצבעים שונים. לעומת זאת, הלוחות המפוספסים והמפוזרים שהכילו את האורגניזם הידוע, E. coli, הדגימו אוכלוסייה הומולוגית. בדרך כלל, עדיף לחשב CFUs למיליליטר באמצעות ספירת המושבה הממוצעת של שלוש צלחות המפוזרות עם אותו דגימה וגורם דילול. הכפל את המספר הממוצע של המושבות במקדם הדילול וחלקו בכמות הנקובה. לבסוף, ניתן להשתמש במושבות מבודדות שנבחרו מכל צלחת במבחני העשרה נוספים לקביעת זהות המינים.
Q1: What is serial dilution and why is it used in microbiology?
Serial dilution is a systematic reduction of bacterial concentration through successive resuspension in fixed volumes of liquid diluent, typically in multiples of 10 for logarithmic reduction. It enables microbiologists to obtain manageable concentrations of organisms from samples containing unknown, often large numbers of bacteria, making enumeration and isolation feasible.
Q2: How does streak plating differ from spread plating?
Streak plating introduces a diluted sample to solid medium in a zig-zag pattern across thirds of the plate, progressively thinning the sample to isolate individual colonies and observe colony morphology. Spread plating distributes an aliquot evenly across the entire plate surface for quantitative enumeration rather than isolation.
Q3: What colony counts are considered valid for CFU calculation?
Plates with fewer than 30 colonies are discarded as too few to count due to greater statistical error. Plates with more than 300 colonies are discarded as too numerous to count because crowding and overlapping lead to underestimation. Valid counts fall between 30 and 300 colonies.
Q4: How do you calculate colony forming units per milliliter?
Average the colony count from three plates spread with the same sample and dilution factor. Multiply the average by the dilution factor and divide by the volume plated. This yields CFU/mL, which can be used to generate growth curves using colony forming units and optical density measurements for further analysis.
Q5: Why are Winogradsky Column samples suitable for serial dilution and plating?
Winogradsky Column samples contain mixed populations with multiple bacterial species and strains at unknown concentrations. Serial dilution and plating techniques allow researchers to isolate individual colonies, observe different morphologies, and quantify the diverse microbial communities present in aerobic and anaerobic zones.
Q6: What information can colony morphology reveal about bacterial populations?
Colony morphology—including shape, size, texture, and color—helps differentiate between bacterial species and strains. A homologous population of a single organism produces uniform colonies, while a mixed population displays colonies with varied characteristics, indicating the presence of different bacterial species or strains in the sample.
Q7: What is the significance of using 0.45% saline as a diluent in serial dilution?
Saline blanks serve as the standardized liquid diluent for successive resuspension steps in serial dilution. The 0.45% saline composition maintains osmotic balance and provides a consistent medium for diluting bacterial samples while preserving cell viability and enabling accurate enumeration and isolation of microorganisms.