Why are variable regions of 16S rRNA useful for bacterial identification?

Variable regions of 16S rRNA serve as unique molecular fingerprints for bacterial species because they differ among bacteria while conserved regions remain essential for ribosome function. These variable regions allow scientists to distinguish phenotypically identical strains that appear the same under microscopy or on growth media, making 16S rRNA sequencing more accurate than conventional identification methods.

What are the main steps in a PCR reaction for 16S rRNA amplification?

PCR consists of repeated cycles of three key steps: denaturation of double-stranded DNA template, annealing of universal primer pairs to conserved regions of the gene, and extension of primers by DNA polymerase. Universal primers bind to highly conserved regions, allowing amplification of the 16S rRNA gene in any bacterial species. The process generates millions of copies of the target DNA fragment for subsequent analysis.

How do you evaluate the quality of a PCR product before sequencing?

PCR product quality is assessed using agarose gel electrophoresis, where successful amplification yields a single band of expected size, typically up to 1500 base pairs. The band should appear distinct without smearing or multiple bands, indicating a pure product. If the gel shows multiple bands or no band, the PCR reaction failed and should be repeated with optimized conditions.

What information does a DNA chromatogram reveal about sequencing quality?

A DNA chromatogram displays peaks representing nucleotides in the sequence. An ideal chromatogram has evenly spaced peaks with minimal background signals. Double peaks indicate multiple DNA templates were present, while broad peaks suggest loss of resolution. Poor quality sections typically appear at the five prime and three prime ends and should be removed before database comparison.

How does BLAST database searching confirm bacterial species identity?

After assembling forward and reverse primer sequences into one continuous sequence, the sequence is entered into the BLAST nucleotide database for comparison with reference 16S rRNA sequences. BLAST returns matches ranked by highest similarity, allowing confirmation of bacterial identity. One hundred percent identity with a reference sequence provides definitive species identification.

Why is genomic DNA quality critical before beginning PCR?

High-quality genomic DNA free of contaminants is essential because impurities can inhibit the PCR reaction and prevent successful amplification. DNA should appear as a thick band above 10 kilobases with minimal smearing on an agarose gel. Creating serial dilutions of the isolated DNA helps optimize the template concentration for PCR, improving amplification efficiency and product quality.

What advantages does 16S rRNA sequencing offer over conventional bacterial identification methods?

Sixteen S rRNA sequencing is faster and more accurate than conventional methods like microscopy, growth on selective media, and biochemical tests. It enables identification of bacteria difficult to culture in laboratory conditions and allows discrimination between phenotypically identical strains at the molecular level. This molecular approach provides definitive species and strain identification based on genetic variation.

ריצוף rRNA 16S: טכניקה מבוססת PCR לזיהוי מינים חיידקיים

0 צפיות10:57 דק׳

1. ערוך

בעת טיפול במיקרואורגניזמים, יש לעקוב אחר פרקטיקה מיקרוביולוגית טובה. כל המיקרואורגניזמים, במיוחד דגימות לא ידועות, צריכים להיות מטופלים כאל פתוגנים פוטנציאליים. בצע טכניקה אספטית כדי למנוע זיהום הדגימות, החוקרים, או המעבדה. יש לשטוף ידיים לפני ואחרי הטיפול בחיידקים, להשתמש בכפפות וללבוש ביגוד מגן.
בצע הערכת סיכונים עבור הפרוטוקול הניסיוני לבידוד DNA גנומי וטיהור מוצר PCR. ריאגנטים מסוימים עלולים להזיק!
תרבות טהורה חיונית לרצף 16S rRNA. לפני שתמשיכו לבידוד הדנ"א הגנומי, ודאו שהחומר ההתחלתי טהור לחלוטין. זה יכול להיעשות על ידי ציפוי פסים כדי לבודד מושבות בודדות. אלה יכולים לגדול עוד יותר פסים על צלחות בנפרד, או מרק, במידת הצורך.
ציוד מעבדה נדרש:
1. רוכב אופניים תרמי עבור פי.סי.אר. הפונקציה של רוכב האופניים התרמי היא להעלות ולהוריד את הטמפרטורה על פי תוכנית מוגדרת. בעת יצירת התוכנית תתבקש להזין את ערכי הטמפרטורה והשעה עבור כל שלב PCR, כמו גם מספר מחזורים כולל.
2. מערכת אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. הוא משמש להפרדת שברי DNA בהתבסס על גודלם ומטעןם. בפרוטוקול זה, אלקטרופורזה ג'ל אגרוז ישמש כדי לדמיין את האיכות של DNA גנומי מבודד ומוצרי PCR.

2. פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול המודגם חל על ריצוף גנים 16S rRNA מתרבית חיידקים טהורה. זה לא חל על מחקרים מטגנומיים.

פולחן חיידקים לבידוד של DNA גנומי (gDNA).
1. הגדל את המיקרואורגניזם שלך במדיום מתאים. ניתן להשתמש הן במדיה נוזלית והן במדיה מוצקה בשלב זה. בחר תנאים שמניבים את הצמיחה הטובה ביותר. בעת תכנון הניסוי, יש לזכור כי חיידקים הגדלים באיטיות עשויים להזדקק למספר ימים כדי להגיע לשלב הצמיחה המאוחרת/ נייחת. בפרוטוקול זה, Bacillus subtilis 168 גדל מרק ליסוגניה (LB) לילה בחממה רועדת להגדיר ב 200 סל"ד, 37 °C.
בידוד של GDNA.
1. אם חיידקים גדלו על מדיום מוצק, לגרד כמה תאים באמצעות לולאה סטרילית resuspend אותם 1 מ"ל של מים מזוקקים
2. אם חיידקים גדלו במדיום נוזלי, השתמש כ 1.5 מ"ל של תרבות לילה.
3. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה (דקה אחת, 12,000 - 16,000 × גרם), להסיר את supernatant, ולהשתמש בתאים לבידוד gDNA באמצעות ערכה מסחרית או פרוטוקולים סטנדרטיים [למשל CTAB הכולל הכנת DNA (13) או מיצוי פנול-כלורופורם (14)]. כאן, ערכה מסחרית שימשה כדי לבודד gDNA מ 1.5 מ"ל של B. subtilis 168 תרבות לילה, OD₆₀₀ = 1.5.
  הערה 1: עבור חיידקים גרם שליליים מסוימים ניתן להשמיט שלב זה ולהחליף על ידי שחרור פשוט של DNA מהתאים על ידי רותחים. כדור חיידקי resuspend במים מזוקקים ודגרה בבלוק חימום להגדיר על 100 °C (10 דקות).
  הערה 2: קשה לשבש תאי חיידקים חיוביים גרם. לכן מומלץ לבחור שיטת בידוד gDNA או ערכה המוקדשת לבידוד מקבוצת חיידקים זו.
בדיקת איכות gDNA.
1. בדוק את האיכות של gDNA מבודד על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. ראשית, לערבב 5 μL של gDNA מבודד עם 1 μL של צבע הטעינה (6x), לטעון את המדגם על ג'ל אגרוז 0.8% המכיל ריאגנט מכתים DNA.
2. לטעון תקן מסה מולקולרית ולהפעיל את האלקטרופורזה עד חזית הצבע מגיע לתחתית הג'ל.
3. לאחר השלמת האלקטרופורזה, דמיינו את הג'ל על טרנסילומינטור מתאים (אור UV או כחול). gDNA מופיע כפס מולקולרי גבוה ועבה (מעל 10 kb). דוגמה לבדיקת האיכות של gDNA מוצגת באיור 3.
4. אם ה- gDNA עובר את בקרת האיכות (כלומר,הרצועה המולקולרית הגבוהה קיימת ויש מעט מאוד מריחה של ה- gDNA), לדלל את ה- gDNA שלך באופן סדרתי על ידי תיוג ראשון 3 צינורות microcentrifuge כדלקמן: "10x", "100x" ו -"1000x".
5. פיפטה 90 μL של מים מזוקקים סטריליים לתוך כל אחד 3 צינורות.
6. קח 10 μL של פתרון gDNA ולהוסיף אותו לצינור מסומן "10x".
7. הזרימו את כל הנפח(כלומר 100 μL) למעלה ולמטה ביסודיות כדי להבטיח שהפתרון מעורבב באופן אחיד. לאחר מכן, לקחת 10 μL של הפתרון מן הצינור הזה ולהעביר אותו לצינור מסומן "100x".
8. לערבב כמתואר לפני ולחזור על אותו הליך על ידי העברת 10 μL של הפתרון מצינור "100x" לצינור "1000x". דילולים אלה ישמשו כתבנית בתגובת ה- PCR.

איור 3: אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של gDNA מבודד Bacillus subtilis. נתיב 1: M - סמן מסה מולקולרית (מלמעלה למטה: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp). נתיב 2: gDNA - DNA גנומי מבודד מבצילוס סובטיליס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגברה של גן 16S rRNA על ידי PCR.
הערה: פרוטוקול PCR להלן מותאם לפולימראז DNA מסוים וזוג פריימר 8F - 1492R (ראה טבלה 1). אופטימיזציה של הפרוטוקול נדרשת עבור כל זוג פולימראז ופריימר.
1. להפשיר את כל הריאגנטים על קרח.
2. הכן את תערובת המאסטר של PCR כפי שמוצג בטבלה 2. מאז פולימראז DNA פעיל בטמפרטורת החדר, הגדרת התגובה חייבת להתבצע על קרח, כלומר צינורות PCR ואת רכיבי התגובה צריך להישמר על קרח כל הזמן. הכן תגובה אחת לכל דגימת gDNA ותגובה אחת לשליטה שלילית. שליטה שלילית היא תערובת PCR ללא תבנית gDNA ומשמשת כדי להבטיח כי הרכיבים האחרים של התגובה אינם מזוהמים.
  הערה: במקרה של דגימות מרובות, תערובת מאסטר מוכנה בדרך כלל. תמהיל ראשי הוא פתרון המכיל את כל רכיבי התגובה למעט התבנית. זה עוזר להשמיט צנרת חוזרת, למנוע שגיאת pipetting, ומבטיח עקביות גבוהה בין הדגימות. כדי להכין תערובת ראשית, הכפל את עוצמת הקול של כל רכיב (למעט תבנית ה- DNA) במספר הדגימות שנבדקו. מערבבים את כל הרכיבים בצינור microcentrifuge וצינור את כל הנפח למעלה ולמטה מספר פעמים.
3. Aliquot 49 μL של תערובת מאסטר לתוך צינורות PCR בודדים.
4. הוסף תבנית μL אחת לצינורות עם תערובת ראשית. לשליטה שלילית להוסיף 1 μL של מים סטריליים. כדי להבטיח כי הרכיבים מעורבים היטב, בעדינות pipet את התערובת למעלה ולמטה ~ 10 פעמים עם pipette להגדיר 30-50μL.
5. הגדר את מחשב ה- PCR עם התוכנית המוצגת בטבלה 3.
6. שים את הצינורות במכונת PCR ולהתחיל את התוכנית.
7. לאחר השלמת התוכנית, לבחון את איכות המוצר PCR שלך על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.
8. תגובת PCR מוצלחת באמצעות צמד פריימר 8F-1492R מניבה רצועה אחת של כ- 1.5 kb (איור 4). אם קיימים רצועות אחרות (כלומר מוצרים לא מוגדרים), מיטוב תוכנית ה- PCR על-ידי התאמת טמפרטורת ה- annealing. אם קיימת רצועה אחת בגודל צפוי, המשך לשלב הבא. כאן, תגובת PCR עם תבנית gDNA מדוללת פי 100 הניבה את המוצר הטוב ביותר מכיוון שהיה לה רצועה חדה בגודל הצפוי וחסרה מוצרים לא יפים. לפיכך הוא נבחר להיות מטוהר ונשלח לרצף.
9. לפני הרצף, יש לנקות את המוצר משיורי פריימרים, deoxyribonucleotides, פולימראז, חוצץ אשר היו נוכחים בתגובת PCR. ניתן לבודד את מוצרי ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית. תגובת ה- PCR נטענת בעמודה המכילה מטריצת איגוד DNA. מוצר ה- PCR מאוגד לעמודה, בעוד שרכיבים אחרים זורמים דרך העמודה. לאחר מכן, העמוד נשטף באמצעות חיץ כביסה, ולבסוף, הדנ"א נחוץ במאגר הבחירה. ודא שמאגר ההבעה בתוספת הערכה תואם לרצף.
10. שלח את מוצר ה- PCR המטוהר לרצף דנ"א. פעל בהתאם להנחיות להגשת דגימות ריצוף במתקן הרצף שנבחר. לקבלת כיסוי הרצף הטוב ביותר, השתמש בפריימרים להגברת PCR (זהים לנעשה בהם שימוש בסעיף 2.4.1) כפריימרים רצפים. כאן, פריימרים 8F ו 1492R שימשו לרצף את מוצר PCR.

רכיב	ריכוז סופי	עוצמת קול לכל תגובה	עוצמת קול לתגובות x (עירוב ראשי)
מאגר תגובה 5x	1x	10 μL	10 μL × x
10 mM dNTPs	200 מיקרומטר	1 μL	1 μL × x
10 מיקרומטר פריימר 8F	0.5 מיקרומטר	2.5 μL	2.5 μL × x
10 מיקרומטר פריימר 1492R	0.5 מיקרומטר	2.5 μL	2.5 μL × x
פוציון פולימראז	יחידה אחת	0.5 μL	0.5 μL × x
DNA של תבנית *	-	1 μL	-
ddH₂O	-	32.5 μL	32.5 μL × x
סה"כ אמצעי אחסון		50 μL	49 μL × x

טבלה 2: רכיבי תגובת פי.סי.אר. * השתמש ב-gDNA 10x, 100x או 1000x מדולל מהשלב 2.3.

צעד	טמפרטורה	זמן	מחזורים
denaturation ראשונית	98°C	30 שניות
דנטורציה	98°C	10 שניות	25-30
חישול	60°C	30 שניות
סיומת	72°C	45 שניות
הארכה סופית	72°C	7 דקות
אחז	4°C	∞

טבלה 3: תוכנית PCR להגברת הגן 16S rRNA.

איור 4: אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של מוצרי PCR מוגבר באמצעות פריימרים 8F ו 1492R ו- gDNA כתבנית. דגימת ה-gDNA מ-B. subtilis (ראו איור 3) דולדה 10, 100 ו-1000 פעמים כדי לבדוק את התוצאה הטובה ביותר. נתיב 1: M - סמן מסה מולקולרית (מלמעלה למטה: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). נתיב 2: תגובת PCR עם תבנית מדוללת פי 10. נתיב 3: תגובת PCR עם תבנית מדוללת 100x. נתיב 4: תגובת PCR עם תבנית מדוללת 1000x. נתיב 5: (C-) - שליטה שלילית (תגובה ללא תבנית ה- DNA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוח נתונים ותוצאות

הערה: מוצר PCR הוא רצף באמצעות קדימה (כאן 8F) ואת הפריימרים ההפוכים (כאן 1492R). לכן, נוצרות שתי קבוצות של רצף נתונים, אחת עבור הפורוורד ואחת עבור פריימר הפוך. עבור כל רצף נוצרים לפחות שני סוגים של קובץ: i) קובץ טקסט המכיל את רצף ה- DNA ו- ii) כרומטוגרמה של DNA, המציגה את איכות ריצת הרצף.

עבור הפריימר הקדמי, פתח את הכרומטוגרמה, ובחן בקפידה את הרצף. כרומטוגרמה אידיאלית לרצף איכות צריכה להיות פסגות מרווחות באופן שווה ואותות רקע מעטים או ללא אותות רקע (איור 5A).
אם הכרומטוגרמה אינה באיכות גבוהה, יש למחוק את הרצף, או לשנות את קובץ טקסט הרצף בהתאם לאפשרויות הבאות:
1. נוכחות של פסגות כפולות ברחבי הכרומטוגרמה מצביעה על נוכחות של תבניות DNA מרובות. זה יכול להיות המקרה אם התרבות החיידקית לא הייתה טהורה. יש לבטל רצף כזה (איור 5B).
2. כרומטוגרמה מעורפלת עשויה לנבוע מנוכחות של פסגות צבעוניות שונות באותו מיקום. אחת השגיאות הנפוצות ביותר היא נוכחות של שתי פסגות צבעוניות שונות באותו מיקום והקצאה לא נכונה של הבסיסים על ידי תוכנת הרצף (איור 5C). תקן באופן ידני את כל הנוקלאוטידים שהוקצו באופן שגוי וערוך אותם בקובץ הטקסט.
3. כרומטוגרמה ברזולוציה נמוכה עלולה לגרום ל"פסגות רחבות" שלעתים קרובות גורמות לספירה שגויה של הנוקלאוטידים באזורים אלה (איור 5D). שגיאה זו קשה לתיקון, ולכן אין להתייחס לאי-התאמות אפשריות בשלב היישור הנוסף כאמינים.
4. איכות קריאה ירודה של כרומטוגרמה ונוכחות של פסגות מרובות נראית בדרך כלל בקצוות של 5 ' ו -3 'של הרצף. תוכנות רצפים מסוימות מסירות קטעים באיכות נמוכה אלה באופן אוטומטי (איור 5E), והנוקלאוטידים אינם כלולים בקובץ הטקסט. אם הרצף שלך לא נחתך באופן אוטומטי, קבע את הקטעים באיכות נמוכה (למשל אות חלש, פסגות חופפות, אובדן רזולוציה) בקצוות והסר את הבסיסים המתאימים מקובץ הטקסט.

איור 5: דוגמאות לפתרון בעיות ברצף דנ"א. A) דוגמה לרצף כרומטוגרמה איכותי (פסגות חד-משמעיות בעלות מרווחים שווים). B) רצף איכות ירודה המתרחש בדרך כלל בתחילת הכרומטוגרמה. אזור האזור האפור נחשב לאיכות נמוכה והוסר באופן אוטומטי על-ידי תוכנת הרצף. ניתן לקצץ בסיסים נוספים באופן ידני. ג) נוכחות של פסגות כפולות (המצוינות על ידי חצים). נוקלאוטיד המצוין על ידי החץ האדום נקרא על ידי הרצף כ- "T" (פסגה אדומה), אך הפסגה הכחולה חזקה יותר, והיא יכולה להתפרש גם כ- "C". ד) פסגות חופפות מצביעות על זיהום DNA (כלומר יותר מתבנית אחת). ה) אובדן רזולוציה ומכונה "פסגות רחבות" (המסומנות במלבן) המונעות שיחות בסיס אמינות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חזור על 3.1 ו-3.2 עבור הפריימר ההפוך.
לבסוף, להרכיב את הרצפים קדימה והפוך לתוך רצף רציף אחד. ריצת רצף טובה מניבה רצף של עד 1100 bp. בהתחשב בכך שמוצר ה- PCR הוא באורך ~ 1500 bp, הרצפים המתקבלים באמצעות פריימרים קדמיים והופוכים צריכים לחפוף חלקית.
1. מזג את שני הרצפים באמצעות תוכנית ההרכבה של רצף ה- DNA, למשל כלי חופשי כגון CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
2. הוסף את שני הרצפים בתבנית FASTA לתיבה שצוינה. לחץ על לחצן "שלח" והמתן לחזרת התוצאות.
3. כדי להציג את הרצף המורכב הקש "Contigs" בכרטיסיית התוצאה. כדי להציג את פרטי היישור, הקש על "פרטי ההרכבה".
  הערה 1: אם תוכנת CAP3 משמשת להרכבה contig אין צורך להמיר את רצף פריימר הפוך לתוך הפוך משלים; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בשלב זה אם נעשה שימוש בתוכנית אחרת.
  הערה 2: תבנית FASTA היא תבנית מבוססת טקסט המייצגת את רצף הנוקלאוטידים. השורה הראשונה (שורת התיאור) בקובץ FASTA מתחילה בסימן ">" ואחריו השם או המזהה הייחודי של הרצף. לאחר שורת התיאור נמצא רצף הנוקלאוטידים. הדבק את הרצפים בתבנית הבאה:
  
  >sequence_frw_primer
  הדבק את הרצף מקובץ הטקסט כאן
  >sequence_rvs_primer
  הדבק את הרצף מקובץ הטקסט כאן
ערוך חיפוש במסד נתונים על-ידי ביקור באתר האינטרנט עבור כלי חיפוש היישור המקומי הבסיסי (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1. בחר בכלי "Nucleotide BLAST" כדי להשוות את הרצף למסד הנתונים.
2. הזן את הרצף שלך (הרצף שהורכב ב- 3.5) בתיבת הטקסט "רצף שאילתות", ולאחר מכן בחר את מסד הנתונים "רצפי rRNA 16S (חיידקים וארצ'יה)" בתפריט הגלילה למטה.
3. לחץ על לחצן "BLAST" בתחתית העמוד. הרצפים הדומים ביותר יוחזרו. תוצאת BLAST לדוגמה מוצגת באיור 6. בניסוי שהוצג הלהיט העליון הוא B. subtilis זן 168, מראה 100% זהות עם הרצף זמין במסד הנתונים BLAST.
4. אם הלהיט העליון אינו מציג 100% זהות, עבור ליישור ובדוק אם יש אי-התאמות. בעת לחיצה על הלהיט העליון, תופנה לפרטי היישור. נוקלאוטידים מיושרים יצטרפו לקווים אנכיים קצרים בעוד לנוקלאוטידים לא תואמים יש פער ביניהם. חזור לכרומטוגרמה שקיבלת מחברת הרצף ושנה את הרצף שוב תוך התמקדות באזור שאינו תואם. תקן את הרצף אם נמצאו שגיאות נוספות. הפעל שוב את BLAST באמצעות הרצף המתוקן.

איור 6: דוגמה לתוצאה של נוקלאוטיד BLAST. רצף גנים rRNA 16S מתרבות טהורה של B. subtilis 168 שימש כרצף שאילתות. הלהיט העליון מראה 100% זהות (הדגיש) לזן B. subtilis 168, כצפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מקור: אווה בוקובסקה-פאניבנד¹, עדדה אנדרסון¹, רולף לוד¹
¹ המחלקה למדעים קליניים לונד, החטיבה לרפואת זיהומים, המרכז הביו-רפואי, אוניברסיטת לונד, 221 00 ל…

Browse More Videos

PCR

DNA

BLAST