עקומות צמיחה: יצירת עקומות צמיחה באמצעות יחידות יוצרות מושבה ומדידות צפיפות אופטית

1. הגדרת

1. חומרי מעבדה נדרשים: מדיה נוזלית, מדיית אגר מוצקה, צלוחיות ארלנמאייר, מברכות 15 מ"ל, תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), מפיץ תאים חיידקיים, 70% אתנול וספטרופיוטומטר. יש לעקר את כל הפתרונות וכלי הזכוכית לפני השימוש.
2. הכן את תחנת העבודה על ידי עיקור עם 70% אתנול. לעבוד ליד מבער בונזן כדי למנוע זיהום של מדיה.
3. בעת עבודה עם חיידקים, ציוד מגן אישי מתאים וטכניקה אספטית יש להשתמש. חלוק מעבדה וכפפות נדרשים בעת עבודה עם תרביות חיידקים.
4. מתכונים למאגרים, פתרונות ות reagents
   1. תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) (8).
   2. לוריא-ברטאני מרק (LB) (9).

2. פרוטוקול

1. הכנת מדיה
   1. זהה את מדיה הצמיחה שבה לגדל את החיידקים ולהכין הן מרק נוזלי אגר מוצק (1.5% w / v אגר) מדיה בבקבוקים autoclavable נפרדים. כאן, מרק LB אגר LB היו מוכנים לצמיחה של Escherichia coli.
   2. לחטא את המדיה עם מכסה מהודק למחצה ב autoclave להגדיר 121 °C (55 °F) במשך 35 דקות.
   3. עבור מדיה אגר, לאחר autoclaving, מניחים באמבט מים להגדיר 50 °C (50 °F) במשך 30 דקות כדי להתקרר. לאחר התקררות, יוצקים 20-25 מ"ל אגר מדיה לתוך 100x15mm עגול פטרי מנות. אפשרו לצלחות לקבוע 24 שעות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
2. הכנה ראשונית של חיידקים
   1. ממלאי קפוא, חיידקי פסים לבידוד על אגר מדיה נבחר כדי לקבל מבודדי מושבה אחת. דגירה בתנאי גדילה המותרים לחיידקים הנבחרים. כאן, E. coli הוא פסים על אגר LB והוא דגירה ב 37 °C (16-18h).
   2. באמצעות לולאת חיסון סטרילית, בחר מושבה אחת מצלחת הפס ולחסן מדיה נוזלית 4 מ"ל במבחנה של 15 מ"ל ולגדול בתנאים המותרים לחיידקים שנבחרו. כאן, E. coli גדל ב 37 °C (50 °F) עם רועד ב 210 סל"ד לילה (16-18h).
3. כיוונון עקומת גדילה
   1. הכנת בקבוקון צמיחה
      1. בקבוקוני ארלנמייר בגודל מתאים. בדרך כלל, נעשה שימוש ביחס של 1:5 בין מדיה לאמצעי האחסון הכולל של הבקבוקון. כאן, 100 mL LB מדיה משמש בקבוקון 500 מ"ל.
      2. באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר מדיה סטרילית לבקבוק ארלנמייר.
   2. הכנת סדרת דילול
      1. תוויות 15 מ"ל מבחנות: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, ו -9, הפצת PBS 9mL לכל אחד. מספרים אלה תואמים לגורם הדילול המשמש לחישוב CFU/mL. יש צורך בערכה חדשה של צינורות עבור כל נקודת זמן של איסוף. (איור 2)
   3. הכנת צלחת אגר
      1. תוויות לוחיות עם זמן איסוף וגורם דילול. עבור כל נקודת זמן תהיה צלחת אחת עבור כל דילול.
4. פרוטוקול עקומת גדילה
   1. חיסון מדיה
      1. באמצעות תרבות נוזלית לילה שהוכנה כחלק מצעד 2.2.2, לחסן את התקשורת הבקבוקון עם 1:1000 נפח של תרבות. כאן, 100 μL תרבות נוזלית לילה מתווסף מדיה 100 mL LB.
      2. מערבבים את התקשורת כדי להפיץ באופן שווה את החיידקים.
   2. אוסף נקודות זמן
      1. כיוונון תנאי צמיחה
         1. מניחים בקבוקון בתנאי גדילה ניסיוניים שנבחרו עבור החיידקים הנתון. נקודות זמן יש לקחת לעתים קרובות עבור חיידקים הגדלים במהירות וניתן לקחת במרווחי זמן ארוכים יותר עבור חיידקים הגדלים לאט. כאן, E. coli גדל ב 37 °C עם רועד ב 210 מהפכות לדקה (סל"ד) ונקודות זמן נלקח כל שעה אחת.
      2. מדידת צפיפות אופטית (OD600)
         1. בכל נקודת זמן, כולל נקודת הזמן ההתחלתית (t = 0), לסגת 1 מ"ל של תרבית חיידקים ולחלק לתוך cuvette ספקטרופוטומטר.
         2. נגב את הקובט נקי ורשום את הצפיפות האופטית אורך גל של 600 ננומטר. אם קריאת הצפיפות האופטית גדולה מ- 1.0, דלל 100 μL של תרבות 1:10 עם מדיה טרייה של 900 μL, תעד את הצפיפות האופטית והכפל ערך זה ב- 10 עבור מדידת OD600.
      3. מדידת יחידת יצירת מושבה (CFU/mL)
         1. בכל נקודת זמן, לסגת 1 מ"ל של תרבות חיידקים ולחלק לתוך מבחן זכוכית -1 המכיל 9 מ"ל של PBS.
         2. עבור סדרת הדילול, להעביר באופן סדרתי 1 מ"ל מהצינור -1 למטה כל צינורות דילול אל -9, מערבולת לאחר כל העברה. (איור 2)
         3. עבור כל דילול, לחלק 100 μL של השעיית תא לצלחת אגר מדיה מוצקה שכותרתו בהתאמה. (איור 2)
         4. באמצעות מפזר תאים כי כבר מעוקר אתנול, עבר דרך להבת מבער Bunsen, מקורר על ידי נגיעה על פני השטח של אגר, להפיץ את 100 μL של השעיית התא עד פני השטח של צלחת אגר מתייבש.
         5. לדגור על לוחות ההתפשטות הפוכים בטמפרטורה התומכת בצמיחת החיידקים. כאן, E. coli הוא דגירה ב 37°C.
         6. לאחר הדגירה, ברגע שמושבות נראות לעין מתעוררות, לספור את מספר מושבות החיידקים על כל צלחת ולתעד ערכים אלה יחד עם גורם הדילול הקשורים שלהם עבור כל הלוחות בכל נקודת זמן.

3. ניתוח נתונים ותוצאות

1. צפיפות אופטית (OD600) נתח עקומת גדילה
   1. התווה את הצפיפות האופטית (OD600) לעומת הזמן בסולם חצי יומן. (איור 3)
2. מושבה יוצר יחידה (CFU / מ"ל) עקומת גדילה התוויה
   1. עבור כל נקודת זמן, בחר את לוח הדילול שבו ספירת המושבה נפלה בטווח של 30-300 חיידקים. הכפל את מספר ספירת המושבות בגורם הדילול ולאחר מכן ב- 10 כאשר התפשטות 100 μL נחשבת דילול נוסף של 1:10 בעת חישוב CFU/ mL.
      
   2. התווה את יחידות יצירת המושבה לעומת זמן בקנה מידה של יומן למחצה. (איור 4)
3. הנוגעים לצפיפות אופטית ויחידות יוצרות מושבה
   1. התווה את יחידות יצירת המושבה לעומת צפיפות אופטית בקנה מידה ליניארי עבור קריאות OD600 פחות או שווה ל- 1.0 OD600 מכיוון שהקשר בין OD600 ל- CFU/mL פחות מדויק מעבר ל- 1.0 OD600. כאן, שש נקודות הזמן הראשונות זוממות. (איור 5)
   2. צור קו מגמה של רגרסיה ליניארית המציג את המשוואה ואת ערך R^2.
4. קביעת זמן הכפלת חיידקים
   1. באמצעות התוויית עקומת הצמיחה של היחידה היוצרת מושבה, במהלך שלב מעריכי, זהה שתי נקודות בגרף עם השיפוע התלול ביותר ביניהן כדי לחשב את זמן ההכפלה.
   2. חישוב זמן ההכפלה
      1. 
      2. ΔTime = t ₂ - t₁, כאשר t₁ = נקודת זמן 1 ו- t₂ = נקודת זמן 2
      3. כאשר b = מספר החיידקים ב- t₂, B = מספר החיידקים ב- t₁, ו- n = מספר הדורות., נגזר מ: .
      4. חשב זמן הכפלה באמצעות: