What is the minimum inhibitory concentration (MIC) and how is it determined?

The minimum inhibitory concentration (MIC) is the lowest antibiotic concentration at which bacteria can no longer survive or multiply. It is determined by observing where bacterial growth stops in response to increasing antibiotic concentrations. In an E-test, the MIC value is read at the point where the growth inhibition zone intersects the antibiotic strip. In broth dilution methods, MIC is identified as the lowest antibiotic concentration showing no visible bacterial growth or turbidity.

How does the Epsilometer test (E-test) measure antibiotic susceptibility?

The E-test uses a plastic strip impregnated with a predefined gradient of antibiotic applied to a Mueller-Hinton agar plate inoculated with bacteria. The antibiotic diffuses into the agar, and susceptible bacteria cannot multiply, forming a clear growth inhibition zone around the strip. The MIC value is determined by reading the numerical scale on the strip at the point where bacterial growth intersects the strip edge.

What is antibiotic synergy and how is it evaluated?

Antibiotic synergy occurs when the combined effect of two antibiotics is greater than the sum of their individual activities. Synergy is evaluated by calculating the fractional inhibitory concentration (FIC) index, which sums the ratio of each antibiotic's MIC in combination to its individual MIC. An FIC index less than 0.5 indicates significant synergy between the two antibiotics.

What is the difference between cross and non-cross E-test methods for synergy testing?

In the non-cross test, E-strips are applied sequentially to the same plate location after the first strip is removed, requiring two plates and more time. In the cross test, both E-strips are placed simultaneously at a 90-degree angle on a single plate, making it faster and requiring fewer materials. Both methods determine MIC values in combination and calculate the FIC index to assess synergy.

How does the broth micro dilution method determine MIC values?

The broth micro dilution method creates two-fold serial antibiotic dilutions in a 96-well microtiter plate containing bacteria in growth medium. After incubation, the MIC is identified as the well with the lowest antibiotic concentration showing no visible bacterial growth or turbidity. This quantitative method offers flexibility in choosing specific antibiotic concentrations and can be applied to multiple bacterial species.

Why is preparing a standardized bacterial suspension important for antibiotic susceptibility testing?

A standardized bacterial suspension ensures consistent and comparable results across tests. The suspension is prepared by matching its turbidity to a McFarland 0.5 standard, which establishes a uniform bacterial concentration. This standardization is critical because varying bacterial concentrations would produce inconsistent growth inhibition zones and unreliable MIC values.

What does an FIC index greater than 0.5 indicate about antibiotic combinations?

An FIC index greater than 0.5 indicates that the two antibiotics do not act synergistically against the tested bacterial strain. Instead, their combined effect is either additive, meaning the joint effect equals the sum of individual activities, or potentially antagonistic. This result suggests that combination therapy may not provide enhanced efficacy compared to single antibiotic treatment.

בדיקת רגישות אנטיביוטית: בדיקות אפסילומטר לקביעת ערכי המיקרופון של שתי אנטיביוטיקות והערכה של סינרגיה אנטיביוטית

0 צפיות13:39 דק׳

1. בדיקות אפסילומטר (בדיקות אלקטרוניות)

הגדרת
1. ללבוש כפפות וחלוק מעבדה
2. הכן את סביבת העבודה על ידי עיקורו באמצעות 70% אתנול
3. לאסוף מולר-הינטון צלחות אגר (לוחות MHA)
הכנת תקן עגמת מקפרלנד מס' 0.5
1. הכן פתרון של 1% של בריום כלוריד (BaCl₂):
  יש להוסיף 1 גרם בריום כלוריד נטול מים (BaCl₂₎במים מזוקקים ב-100 מ"ל. מערבולת היטב.
2. הכן פתרון של 1% של חומצה גופרתית (H₂SO₄):
  הוסף 1 מ"ל של H מרוכז₂SO₄ ב 99 מ"ל של מים מזוקקים. מערבולת היטב.
3. הכן תקן עכוז מקפרלנד מס ' 0.5:
  50 μL BaCl₂ פתרון ב 5 מ"ל של 1% H₂SO₄ פתרון. מערבולת הפתרון היטב כדי לקבל השעיה עגבת.
4. שמור על תקן עכוז מקפרלנד מס' 0.5 בצינור מכוסה בנייר כסף. יש לאחסן ב-25°C למשך 6 חודשים לכל היותר. מערבולת גם לפתרון הומוגני לפני השימוש.
הכנת לוחות MHA
1. לגרד סטרפטוקוקוס קבוצה G חיידקים מצלחת אגר דם באמצעות לולאה סטרילית. מערבבים לתוך 1mL של תמיסת מלח, מערבולת להשעיה של החיידקים.
2. השווה את ההשעיה לתקן מקפרלנד מס '0.5 כדי להשיג את אותה עכום על מנת שיהיה לו גודל אינוקולום זהה במהלך הניסויים. התאם את הריכוז באמצעות תמיסת מלח או חיידקים נוספים.
3. לחסן את לוחות MHA באמצעות אפליקטור כותנה סטרילי. ספוגית הצלחת בעדינות כדי לכסות את פני השטח. המשך באחת משלוש השיטות המתוארות להלן (1.4-1.6).
בדיקת עמידות לאנטיביוטיקה אחת. קבוצת סטרפטוקוקוס G, התנגדות לפניצילין G או גנטמיצין
1. הניחו רצועת מבחן אלקטרוני (פניצילין G או גנטמיצין) במרכז צלחת MHA(איור 1 A,B).
2. דגירה במשך 18-20 שעות, 37°C.
3. קרא את התוצאות. מיקרופון נמדד כאזור העיכוב שחוצה את רצועת הבדיקה האנטיביוטית המדורגת(איור 1 C,D).

איור 1: מבחן אלקטרוני יחיד. מיקום של רצועת בדיקה אלקטרונית של A) פניצילין G ו- B) גנטמיצין על צלחת אגר מולר הינטון מכוסה במושבות חיידקיות של קבוצה G סטרפטוקוצ'י לפני (A ו- B) ואחרי (C ו- D) דגירה לילה ב 37 ° C 5% CO_2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סינרגיה בוחנת גישה צולבת. קבוצת סטרפטוקוקוס G, התנגדות לפניצילין G וג'נטמיצין.
1. מניחים שתי רצועות בדיקה אלקטרונית עם אנטיביוטיקה שונה (למשל פניצילין G וגנטמיצין) על צלחת MHA מחוסנת במבנה צולב.
  1. לקבלת התוצאות המדויקות ביותר, כוון למקם את הצלב בזווית של כ-90° בצומת בין המאזניים בערכי המיקרופון שלהם, שנקבעו בעבר בבדיקת עמידות לאנטיביוטיקה בודדת (איור 2 A).
  2. שים לב כי ברגע שהרצועות ממוקמות על צלחת אגר, הם לא צריכים להיות מועברים, שכן כמה אנטיביוטיקה אולי כבר נספג על ידי הצלחת. לכן, מתאים יותר לשמור על הרצועות בזווית מעט לא נכונה (למשל 85°) ועד 1-2 מ"מ מערך המיקרופון בפועל. מומלץ להפעיל את הניסוי משולש כדי להפחית את הבעיה.
2. דגירה במשך 18-20 שעות, 37°C.
3. קרא את התוצאות. MIC נמדד כאזור העיכוב שחוצה את רצועת הבדיקה האנטיביוטית המדורגת בכל רצועת מבחן אלקטרוני בהתאמה (איור 2 B).
4. השתמש בנוסחה עבור ריכוז מעכבי שברים (FIC) (משוואה 1) כדי לקבוע סינרגיה.

איור 2: זיהוי סינרגיזם - בדיקה צולבת. תוצאות של בדיקת סינרגיה מיקרוביאלית של מיקרופון של פניצילין G וג'נטמיצין על קבוצת סטרפטוקוקוס G לפני (A)ואחרי (B) דגירה לילה ב 37 ° C 5% CO₂. זווית של 90° נוצרת בין שני ערכי MIC בודדים (פניצילין G: 0.094 מיקרוגרם / מ"ל, גנטמיצין: 8 מיקרוגרם / מ"ל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סינרגיה בודקת גישה לא צולבת. קבוצת סטרפטוקוקוס G, התנגדות לפניצילין G וג'נטמיצין.
1. מקם את רצועת הבדיקה האלקטרונית במרכז צלחת MHA(איור 3 A,D).
2. סמן היכן היה ערך ה- MIC שנקבע בעבר בכל רצועה.
3. דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.
4. יש להשליך את רצועת הבדיקה האלקטרונית עבור כל צלחת MHA(איור 3 B,E).
5. מקם את רצועת הבדיקה האלקטרונית השנייה (המכילה אנטיביוטיקה שונה) על שטח הרצועה שהוסרה מוקדם יותר בהתאמה, כך שערכי המיקרופון שלהם יתאימו לסימן ומיושרים.
6. דגירה במשך 18-20 שעות, 37°C.
7. קרא את התוצאות. מיקרופון נמדד כאזור העיכוב שחוצה את רצועת הבדיקה האנטיביוטית המדורגת בכל רצועת מבחן אלקטרוני בהתאמה (איור 3 C, F).
8. על מנת לקבוע סינרגיה, הנוסחה לריכוז מעכבי שברים (FIC) משמשת (משוואה 1).

איור 3: זיהוי סינרגיזם - בדיקה לא צולבת. תוצאות של בדיקת סינרגיה מיקרוביאלית של MIC של פניצילין G וג'נטמיצין על סטרפטוקוקוס קבוצה G. A) רצועת גנטמיצין (8 מיקרוגרם / מ"ל מרוכז) על גבי קבוצת סטרפטוקוקוס חיידקים G, B) הסרת רצועת גנטמצין, C) משולב גנטמיצין / פניצילין G רצועת (0.094 מיקרוגרם / מ"ל מרוכז) על גבי קבוצת סטרפטוקוקוס חיידקים G, D) פניצילין G רצועה (0.094 מיקרוגרם / מ"ל מרוכז), E) הסרת רצועת פניצילין G, F) רצועת פניצילין G / גנטמיצין משולבת (8 מיקרוגרם / מ"ל מרוכז) על גבי חיידקי קבוצת סטרפטוקוקוס G. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. בדיקת מרק

הגדרת
1. ללבוש כפפות וחלוק מעבדה
2. הכן את סביבת העבודה על ידי עיקורו באמצעות 70% אתנול
3. לאסוף 15mL מרק MH עם 50% דם סוס lysed ו 20 מ"ג / מ"ל β-NAD (MH-F)
(אופציונלי) ביצוע בדיקה אלקטרונית [פרוטוקול 1] כדי לקבוע את המיקרופון באמצעי מוצק
1. בעוד אופציונלי, ידע כזה יאפשר עיצוב ניסיוני טוב יותר (למשל ריכוזי אנטיביוטיקה שנוספו יכול להיות מתוכנן להקיף את ערך MIC שנקבע מהצלחת), שיפור הסיכויים של ניסוי מוצלח.
מכין תימוכין חיידקי. כאמור לעיל, ריכוז חיידקים ניתן להעריך על ידי מדידות OD nm או תקני עכוז מקפרלנד
1. שיטת OD600 ננומטר
  1. להשיג השעיה חיידקית עם ריכוז חיידקי מבוסס
  2. לדלל את התרבות מרק MH-F כדי להשיג OD600 של 0.003
2. שיטת העקשנות של מקפרלנד
  1. שים 15 מ"ל מרק MH-F בצינור סטרילי.
  2. לחסן את מרק MH-F עם חיידקים (מצלחת) לרמת מקפרלנד. מערבולת הפתרון במרץ. יוצקים את הפתרון לצלחת פטרי סטרילית.
הכנת אנטיביוטיקה
1. לקבוע את הריכוז של אנטיביוטיקה הרצוי
  1. זהה את ערך המיקרופון ממבחן E (לדוגמה 0.125 מיקרוגרם /מ"ל עבור פניצילין G ו- 8 מיקרוגרם / מ"ל עבור גנטמיצין)
  2. הכפל את ערך MIC צלחת אגר ב 2⁴-2⁷, המתאים ארבע-שבע 2x דילול טורי. זה יהיה הריכוז ההתחלתי של אנטיביוטיקה. (לדוגמה עבור פניצילין G, שבעה דילול טורי 2x: 0.125 מיקרוגרם / מ"ל x 2⁷ = 16 מיקרוגרם / מ"ל; עבור גנטמיצין, ארבעה דילול טורי 2x 8 מיקרוגרם / מ"ל x 2⁴ = 128 מיקרוגרם / מ"ל
  3. הכפל את הערך ההתחלתי הרצוי 100x על מנת לקבוע ליצור ריכוז מלאי של אנטיביוטיקה (למשל מניות של 1.6 מ"ג / מ"ל פניצילין G ו 12.8 מ"ג / מ"ל גנטמיצין)
2. הכן ריכוז מלאי אנטיביוטי פי 100 בהתאם
  1. להמיס את האנטיביוטיקה במים autoclaved 10mL, ומערבולת כדי ליצור פתרון מלאי (למשל 16 פניצילין G ו 128 מ"ג גנטמיצין כדי ליצור את המניות לעיל)
הוספת חיידקים לבארות מיקרו-לוח
1. Aliquot 200 מרק MH-F המכיל אינוקולום חיידקים לבארות ב -3 השורות הראשונות של צלחת microtiter 96 טוב לניסוי משולש.
הוסף אנטיביוטיקה לבארות מיקרו-לוח
1. הוסף 200 מרק MH-F נוסף של μL עם חיידקים לעמודה הראשונה של בארות (A1, B1, C1) כדי להביא את הנפח הכולל ל 400 μL.
2. הוסף 4 μL של ריכוז מלאי של אנטיביוטיקה לעמוד הראשון של בארות. מאז המדגם מכיל 400 μL זה יגרום דילול 100x של האנטיביוטיקה.
3. ליצור דילול סדרתי 2x על ידי העברת 200 חיידקים μL / אנטיביוטיקה מ A1 ל- A2, כל הדרך A11. הצינור במרץ בין הדילולים. חזור על השלב עבור שורות נוספות.
4. הסר 200 μL מהעמודה 11 כך אמצעי האחסון הסופי בכל בארות הם 200 μL.
5. השאירו את העמודה האחרונה (A12, B12, C12) ללא אנטיביוטיקה, כפקדים.
קביעת ערכי מיקרופון
1. לדגור על צלחת microtiter 96-well במשך 24 שעות ב 37°C מבלי לרעוד.
2. ערך המיקרופון מוגדר כבאר האחרונה בסדרת הדילול שלא מציגה צמיחה נראית לעין של חיידקים (איור 4). עם זאת, ניתן לתת אמון בערך זה רק אם גודל ההסתמכות המקורי היה נכון.

איור 4: קביעת מיקרופון על ידי דילול מרק. מיקרופון מוגדר כאן כבאר האחרונה שמציגה בהירות (ללא צמיחה של חיידקים) לפני שהיא משנה את העקרנות. שורה הן כפילויות של ערך המיקרופון של פניצילין G ושורה הן כפילויות של ערך המיקרופון של גנטמיצין, הן לעומת איזולט של קבוצת סטרפטוקוקוס G. A) תוצאה ניסיונית בפועל, ב) פרשנות סכמטית של הערכים מ- A (אפור = ללא צמיחה; לבן = צמיחה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הליך סכמטי של סדרת דילול לספירת ריכוז החיידקים המקורי. דילול בוצעו כמתואר (20 μL מדולל ב 180 μL עבור סדרת דילול 10x), ולאחר מכן 10 μL מן השורות A-H מצופים על שתי לוחות אגר דם נפרדים כפי שצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קביעת גודל ההסתה המקורי
הערה: בדיקות מיקרו-ברות רגישות מאוד לגודל ההנוקולום המקורי שבו נעשה שימוש. גודל אינוקולום מוגזם ייתן תוצאה חיובית כוזבת, שכן האנטיביוטיקה שנוספה לא תוכל לעכב את הצמיחה יותר ביחס זה. לכן, זה קריטי כדי לוודא כמה חיידקים נוספו microwells. בעוד שהנתונים לא יהיו זמינים בנקודת הניסוי (בשל הצורך בדגורה של 24 שעות) הוא ישמש כבקרה. אם מספר החיידקים המוספים נמצא בטווח הריכוז המוצהר, ניתן לסמוך על ערכי המיקרופון. אם ההנמקולום היה גבוה מדי או נמוך מדי, יש לחזור על הניסוי.
1. לדלל את החיידקים באופן סדרתי
  1. הכן צלחת microtiter 96 היטב כדי לדלל את ריכוז החיידק המקורי על מנת לקבוע את גודל inoculum. האופטימלי הוא נפח של 200 μL עם 10^5-6 חיידקים. כדי לבצע את הדילולים, הראשון aliquot 180 μL סטרילי PBS לכל באר B-H (ב משולש 1-3).
  2. לאחר מכן, להוסיף 100 μl של פתרון חיידקי A (משולש 1-3).
  3. ליצור דילול סדרתי 10x (במשולש) על ידי העברת 20 חיידקים μl מ A ל- B, pipet במרץ. חזור על השלבים עבור C-H.
2. צלחת דילול חיידקי לקביעת גודל inoculum
  1. סמנו לוחות אגר דם לפי איור 5.
  2. העבר 10 μL מהה בדילול הסדרתי לצלחת לפי איור 5.
  3. לדגור על הצלחת ב 37°C במשך 20-24 שעות.
3. קבע את גודל האינוקולום החיידקי
  1. ספרו את מספר החיידקים בנקודות בתוך 5-50 מושבות(איור 6).
  2. חשב את גודל inoculum הראשוני על ידי חישוב הממוצע של דגימות משולש, להכפיל על ידי גורם דילול (למשל 10x עבור דגימות B, 100x עבור דגימות C, 1000x עבור דגימות D, וכו ') ולאחר מכן על ידי 100 כדי לפצות על נפח התצפית של 10 μL, וכתוצאה מכך גודל inoculum cfu / mL. אם ההסתמכות היא בתוך 10^5-6 cfu/mL ניתן לתת אמון בנתוני ה- MIC.

איור 6: קביעת גודל ההסתה. חיידקים שחוסנו על פי איור 5 דוגר במשך 20-24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן נספרו. לשורה D יש מספר טוב של מושבות לספור (למשל 5-50). דגימות ב- A אינן מדוללות, B מדולל 10x, C מדולל 100x, ו- D מדולל 1000x, ורק 10 μL מצופה בכל נקודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.