מיקרוסקופיה וכתמים: גרם, כמוסה וכתמים אנדוספור

1. כתמי גרם

1. הגדרת
   1. ללבוש כפפות וחלוק מעבדה לא דליק, כמו צבעים יהיה להכתים ידיים ובגדים.
   2. מבער בונזן משמש לחימום תיקון החיידקים. השתמש בזהירות בעת עבודה עם להבה; לקשור שיער ארוך.
   3. ריאגנטים כתם גרם זמין מסחרית ישמשו.
   4. ניקוי שקופיות מיקרוסקופ עם מגבוני מעבדה.
2. פרוטוקול
   1. Pipet 10 μL פוספט אגום מלוח או מרק תרבות על שקופית.
   2. למרוח מושבה חיידקית לתוך הנוזל כדי לייצר שכבה אחידה דקה.
      הערה: אין להשתמש בתרביות שגילן עולה על 24 שעות, שכן חיידקים זקנים מדי עשויים להיות שינויים בדופן התא שלהם אשר ישפיעו על תוצאות כתם גרם (1, 4).
   3. מגלשה יבשה לחלוטין.
   4. לאחר הייבוש, חום לתקן חיידקים על ידי העברת להחליק דרך הלהבה (חיידקים בצד למעלה) 4-5 פעמים.
      הערה: אין להחזיק את השקופית בלהבה זמן רב מדי או שאתה יכול לעוות את התאים החיידקיים (1).
   5. עבודה מעל הכיור, להחזיק את רמת השקופית ולהחיל קריסטל סגול של גרם כדי לכסות לחלוטין את החיידקים קבועים בחום, לאפשר לעמוד 45 שניות.
   6. לשטוף עודף קריסטל ויולט על ידי החזקת השקופית בזווית התזה זרם עדין, עקיף של מים על המגלשה ולתת לו לדרוס את החיידקים המוכתמים. אין להשפריץ מים ישירות על החיידקים.
   7. מחזיק את רמת השקופית שוב, להחיל פתרון יוד של גרם כדי לכסות לחלוטין את החיידקים מוכתמים, לאפשר לעמוד 45 שניות.
   8. יש לשטוף עודף יוד כמו בשלב 1.2.6 לעיל.
   9. תוך החזקת השקופית בזווית, להוסיף כמה טיפות של Decolorizer על השקופית, לתת לו לטפטף למטה על החיידקים המוכתמים רק עד הריצה ברורה; בדרך כלל, כ-5 שניות. יש לשטוף מיד במים כמו בשלב 1.2.6 לעיל.
      הערה: זהו צעד קריטי בפרוטוקול. מתן אפשרות לדקולור לטפטף זמן רב מדי או לא מספיק זמן תגרום להכתמת גרם כוזבת (4).
   10. מחזיק את רמת השקופית שוב, להחיל ספרנין של גרם כדי לכסות לחלוטין את החיידקים, לאפשר לעמוד 45 שניות.
   11. יש לשטוף עודף ספרנין כמו בשלב 1.2.6 לעיל.
   12. כתם, לא לשפשף, עודף מים מן השקופית באמצעות מגבות נייר.
   13. בדוק שקופית על המיקרוסקופ באמצעות טבילת שמן עם מטרה 100X.
3. תוצאות וניתוח נתונים
   1. חיידקים חיוביים לגרם יכתימו סגול.
   2. חיידקים גרם שלילי יכתימו אדום.
   3. צורה (קוצ'י, בסילי, מוטות מעוקלים, ספירלות) של חיידקים תהיה גלויה.
   4. סידור של תאים חיידקיים (תאים בודדים, תאים משויכים, שרשראות של תאים, אשכולות, קיבוצים) יהיה גלוי.

2. כתמי כמוסה

1. הגדרת
   1. ללבוש כפפות וחלוק מעבדה כמו צבעים מכתימים ידיים ובגדים.
   2. להכנת 1% תמיסת קריסטל ויולט, יש לערבב 0.25 גרם קריסטל ויולט עם 25 מ"ל מים מזוקקים עד להמסה.
   3. כדי להכין 1% פתרון אדום קונגו, לערבב 0.25 גרם קונגו אדום עם 25 מ"ל מים מזוקקים עד מומס.
   4. נקה שקופיות עם מגבוני מעבדה.
2. פרוטוקול
   1. מקם 10 μL קונגו אדום על שקופית.
   2. בעזרת קצה צינור, למרוח מושבה חיידקית לתוך הצבע כדי לייצר שכבה אחידה דקה.
   3. מגלשה יבשה לחלוטין עם תערובת צבע/תא, 5-7 דקות.
      הערה: אין לחמם תיקון כמו חימום יכול להתייבש או לעוות את הקפסולה.
   4. להציף את הכתם עם 1% קריסטל ויולט במשך דקה אחת.
   5. שטפו כתם עודף על ידי החזקת המגלשה בזווית והתזה של זרם מים עדין ועקיף על המגלשה ונתנו לו לדרוס את החיידקים המוכתמים. אין להשפריץ מים ישירות על החיידקים.
   6. החזק את המגלשה בזווית של 45 מעלות עד לייבוש אוויר מוחלט.
   7. בחן מריחה על המיקרוסקופ תחת טבילת שמן עם מטרה של פי 100.
3. תוצאות וניתוח נתונים
   1. תאים חיידקיים יכתימו סגול.
   2. רקע השקופית יכתים כהה.
   3. כמוסות יהיו הילה ברורה סביב תאים על רקע כהה.

3. כתמי אנדוספור (שיטת שפר-פולטון)

1. הגדרת
   1. ללבוש כפפות וחלוק מעבדה לא דליק כדי להגן על הידיים והבגדים מפני צבעים ולהבה.
   2. מבער בונזן משמש לחימום תיקון החיידקים. השתמש בזהירות בעת עבודה עם להבה; לקשור שיער ארוך.
   3. להכנת 0.5% תמיסת מלחית ירוקה, מערבבים 0.125 גרם מלחית ירוק עם 25 מ"ל מים מזוקקים עד להמסה.
   4. השתמש בפתרון ריאגנט ספרנין זמין מסחרית של גראם.
   5. נקה שקופיות עם מגבוני מעבדה.
2. פרוטוקול
   1. Pipet 10 μl פוספט אגירה מלוחה (PBS) או מרק תרבות על שקופית.
   2. באמצעות טכניקה אספטית, למרוח מושבה חיידקית לתוך הנוזל כדי לייצר שכבה אחידה דקה.
      הערה: אנדוספורים בדרך כלל לא נוצרים בתאים צעירים, ולכן התרבות מומלץ להיות בין 18 ל 36 שעות (9).
   3. מגלשה יבשה לחלוטין.
   4. תיקון חום על ידי העברת שקופית (חיידקים בצד למעלה) דרך להבה 4-5 פעמים.
   5. כדי לעזור להכיל את הצבע, מניחים פיסת נייר עדשה (לחתוך כדי להתאים את מריחת החיידקים) על החום קבוע מריחה.
   6. נייר עדשה רווי עם תמיסת מלכיט ירוקה.
   7. מניחים להחליק על מים רותחים על צלחת חמה, ומחליקים אדים במשך 5 דקות, שמירה על נייר העדשה לח על ידי הוספת עוד צבע טיפה בכל פעם לפי הצורך.
      הערה: הימנעו מהתחממות יתר וייבוש של תמיסת הצבע.
   8. הסר שקופית מהכוס, הסר והשלך נייר עדשות, אפשר לגלישה להתקרר 2 דקות.
   9. מחזיקים שקופית בזווית, שוטפים היטב על ידי התזת זרם מים עדין ועקיף על מגלשה, ומאפשרים לו להתנקז מעל מריחה.
   10. החזקת רמת שקופית, מריחת שיטפון עם ספרנין, לאפשר לעמוד דקה אחת.
   11. יש לשטוף עודף ספרנין כמו בשלב 3.2.9 לעיל.
   12. אפשר לייבש אוויר.
   13. בדוק שקופית על מיקרוסקופ תחת טבילת שמן עם מטרה 100X.
3. תוצאות וניתוח נתונים
   1. נבגים יכתימו ירוקים.
   2. תאים צמחיים יכתימו באדום.
   3. תאים צמחיים מסוימים יכילו נבגים; התאים יכתימו באדום, בעוד האנוספורים יכתימו בירוק.