$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
חיידקים הם אורגניזמים חיים מיקרוסקופיים שיש להם מאפיינים ייחודיים רבים כמו צורה, סידור תאים, האם הם מייצרים כמוסות או לא, ואם הם יוצרים נבגים. ניתן לדמיין את כל התכונות הללו על ידי צביעה ולסייע בזיהוי וסיווג של מיני חיידקים שונים.
כדי לבחון את שני המאפיינים הראשונים של צורת התא וסידורו, אנו יכולים להשתמש בשיטה פשוטה שנקראת צביעת גרם. כאן, סגול קריסטל מוחל על חיידקים, שקובעו בחום על מגלשה. לאחר מכן, תמיסת היוד של גרם מתווספת לשקופית, וכתוצאה מכך נוצר קומפלקס בלתי מסיס בין הסגול הקריסטלי לתמיסת היוד של גראם. לאחר מכן מורחים מסיר צבע וכל חיידק עם שכבת פפטידוגליקן עבה יכתים סגול, מכיוון ששכבה זו אינה חודרת בקלות על ידי מסיר הצבע. חיידקים אלה מכונים גראם-חיוביים.
לחיידקים גראם-שליליים יש שכבה פפטידוגליקנית דקה יותר והם יסירו את מסיר הצבע, ויאבדו את הצבע הסגול. עם זאת, הם יכתמו ורוד-אדמדם כאשר מוסיפים כתם נגד ספרנין, שנקשר לשכבת ליפופוליסכריד מבחוץ. לאחר הצביעה, ניתן לצפות בתאים למורפולוגיה, גודל וסידור, כגון בשרשראות או באשכולות, מה שמסייע עוד יותר בסיווג וזיהוי.
טכניקה שימושית נוספת בערכת הכלים של המיקרוביולוג היא כתם הקפסולה, המשמש להדמיית כמוסות חיצוניות המקיפות סוגים מסוימים של תאי חיידקים. בשל ההרכב הלא יוני של הקפסולה ונטייתה להדוף כתמים, שיטות צביעה פשוטות לא יעבדו. במקום זאת, נעשה שימוש בטכניקת צביעה שלילית, שצובעת תחילה את הרקע בצבע חומצי, כגון אדום קונגו, לפני שתאי החיידקים מוכתמים בסגול קריסטל. זה משאיר כל קפסולה קיימת כהילה ברורה סביב התאים.
טכניקת הצביעה העיקרית האחרונה המכוסה כאן יכולה לעזור לקבוע אם החיידקים הנחקרים יוצרים נבגים. בתנאים קשים, חלק מהחיידקים מייצרים אנדוספורים, מבנים רדומים, קשיחים ולא רבייתיים שתפקידם העיקרי הוא להבטיח את הישרדותם של חיידקים בתקופות של לחץ סביבתי, כמו טמפרטורות קיצוניות או התייבשות. אולם לא כל מיני החיידקים מייצרים אנדוספורים, וקשה להכתים אותם בשיטות סטנדרטיות מאחר שהם אטומים לצבעים רבים. שיטת שפר-פולטון משתמשת בכתם ירוק מלכיט, אשר מוחל על החיידקים הקבועים על מגלשה. לאחר מכן נשטפת המגלשה במים לפני שהיא מוכתמת בספרנין. תאים וגטטיביים ייראו אדומים-ורדרדים, בעוד שכל אנדוספורים הקיימים ייראו ירוקים. בסרטון זה תלמדו כיצד לבצע את טכניקות הצביעה הנפוצות הללו של חיידקים, ולאחר מכן תבחנו את דגימות הצביעה באמצעות מיקרוסקופ אור.
כדי להתחיל בהליך, קשרו שיער ארוך לאחור ולבשו את ציוד המגן האישי המתאים, כולל מעיל מעבדה וכפפות.
לאחר מכן, נקו שקופית מיקרוסקופ טרייה עם מגבון מעבדה. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של מי מלח 1X חוצץ פוספט על השקופית הראשונה. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לבחור מושבת חיידקים בודדת מצלחת אגר LB. מרחו את מושבת החיידקים בנוזל כדי לייצר שכבה דקה ואחידה. הנח את המגלשה על הספסל ואפשר לה להתייבש לחלוטין באוויר.
לאחר הייבוש, הדליקו מבער בונסן כדי לתקן את החיידקים בחום. בעזרת מלקחיים העבירו את המגלשה דרך להבת המבער מספר פעמים, כשצד החיידקים כלפי מעלה, והקפידו לא להחזיק את המגלשה בלהבה זמן רב מדי, מה שעלול לעוות את התאים.
כעת, עבדו מעל הכיור, החזיקו את המגלשה בגובה ומרחו כמה טיפות של סגול הקריסטל של גרם כדי לכסות לחלוטין את מריחת החיידקים ואז הניחו את השקופית על הספסל כדי לעמוד למשך 45 שניות. לאחר מכן, החזיקו את המגלשה בזווית והשפריצו בעדינות זרם מים על החלק העליון של המגלשה, והקפידו לא להשפריץ את מריחת החיידקים ישירות. כעת, החזק שוב את המגלשה בגובה הישר, מרח את תמיסת היוד של Gram כדי לכסות לחלוטין את החיידקים המוכתמים ולאחר מכן אפשר לה לעמוד למשך 45 שניות נוספות. לאחר מכן, שטפו בזהירות את היוד מהשקופית, כפי שהוצג קודם לכן. תוך כדי החזקת השקופית בזווית, הוסף כמה טיפות של מסיר הצבע של גרם לשקופית, ואפשר לה לזרום על החיידקים המוכתמים, רק עד שהנגר ברור, למשך כ-5 שניות. יש לשטוף מיד במים כפי שהוצג קודם לכן. זה יגביל את הסרת הצבע יתר של המריחה. לאחר מכן, החזק שוב את השקופית במפלס, מרח את כתם הנגד של ספרנין של גראם כדי לכסות לחלוטין את החיידקים המוכתמים. לאחר 45 שניות יש לשטוף בעדינות את הספרנין מהמגלשה במים, כפי שהוצג קודם לכן, ולאחר מכן לייבש במגבות נייר.
לבסוף, הוסף טיפת שמן טבילה ישירות לשקופית, ולאחר מכן בחן את השקופית באמצעות מיקרוסקופ אור עם עדשת אובייקטיבית שמן פי 100.
כדי להתחיל בפרוטוקול מכתים זה, יש ללבוש תחילה את ציוד המגן האישי הנכון ולאחר מכן לוודא כי מגלשות הזכוכית שישמשו נקיות.
לאחר מכן, הכינו את הפתרונות. להכנת תמיסת סגול קריסטל 1%, מערבבים 0.25 גרם אבקת סגול קריסטל עם 25 מיליליטר מים מזוקקים ומערבולת עד להמסה. לאחר מכן, הכינו תמיסה אדומה של קונגו 1% על ידי ערבוב 0.25 גרם אבקה אדומה של קונגו עם 25 מיליליטר מים מזוקקים ומערבולת עד להמסה. כעת, פיפטה 10 מיקרוליטר מהתמיסה האדומה של קונגו על המגלשה. בעזרת קצה פיפטה נקי וסטרילי, בחר מושבת חיידקים בודדת מצלחת אגר LB. לאחר מכן, מרחו את מושבת החיידקים לתוך הצבע כדי ליצור שכבה דקה ואחידה. יבש לחלוטין את שקופית החיידקים באוויר למשך 5-7 דקות. לאחר שהמגלשה יבשה, הציפו את המריחה במספיק סגול קריסטל 1% כדי לכסות את המריחה ותנו לה לשבת במשך דקה אחת. כעת, החזיקו את המגלשה בזווית והשפריצו בעדינות זרם מים על החלק העליון של המגלשה, והקפידו לא להשפריץ את החיידקים ישירות. המשך להחזיק את המגלשה בזווית של 45 מעלות עד לייבוש מלא באוויר. לבסוף, הוסף טיפת שמן טבילה ישירות לשקופית, ולאחר מכן בחן את השקופית באמצעות מיקרוסקופ אור עם מטרת שמן פי 100.
כדי לבצע צביעת אנדוספור, ראשית, הכינו תמיסה ירוקה של 0.5% מלכיט על ידי ערבוב 0. 125 גרם אבקה ירוקה מלכיט עם 25 מיליליטר מים מזוקקים, ואז מערבל את התמיסה עד להמסה. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של 1X PBS על מרכז השקופית. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לבחור מושבת חיידקים בודדת מצלחת אגר LB. מרחו את החיידקים לתוך הנוזל כדי לייצר שכבה דקה ואחידה. כעת, הנח את המגלשה על הספסל ואפשר לה להתייבש לחלוטין באוויר. לאחר הייבוש, הדליקו מבער בונסן כדי לתקן את החיידקים בחום. העבירו את המגלשה דרך להבת המבער הכחולה מספר פעמים, כשצד החיידקים פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, לאחר שהשקופית התקררה, הנח פיסת נייר עדשה חתוכה מראש מעל המריחה הקבועה בחום. לאחר מכן, הפעל פלטה להגדרה הגבוהה ביותר, והביא כוס מים לרתיחה.
יש להרוות את נייר העדשה בתמיסה הירוקה מלכיט, ובעזרת מלקחיים להניח את השקופית על גבי כוס המים הרותחים לאדים למשך 5 דקות. שמור על לחות נייר העדשה על ידי הוספת צבע נוסף, טיפה אחת בכל פעם, לפי הצורך. לאחר מכן, שוב בעזרת מלקחיים, הרם את השקופית מהכוס והסר והשליך את נייר העדשה. הניחו לשקופית להתקרר במשך 2 דקות. עבדו מעל הכיור, החזיקו את המגלשה בזווית והשפריצו בעדינות זרם מים על החלק העליון של המגלשה. כעת, החזק את השקופית ברמה והחל את Safranin כדי לכסות לחלוטין את השקופית. לאחר מכן, הניחו לו לעמוד למשך דקה אחת. לאחר מכן, החזק את השקופית בזווית ושטוף כפי שהוצג קודם לכן. הניחו למגלשה להתייבש באוויר על הספסל. לבסוף, הוסף טיפת שמן טבילה ישירות לשקופית, ולאחר מכן בחן את השקופית במיקרוסקופ אור, עם מטרת שמן פי 100.
בפרוטוקול צביעת גרם, יכולים להיווצר שני כתמים בצבעים שונים. צביעה סגולה כהה מצביעה על כך שהחיידקים הם גראם-חיוביים ושהם שמרו על הכתם הסגול הקריסטלי. לעומת זאת, צביעה ורודה-אדמדמה היא אופיינית לחיידקים גראם-שליליים, אשר במקום זאת ייצבעו על ידי כתם הנגד של ספרנין. בנוסף, ניתן לדמיין צורות וסידורים שונים של חיידקים לאחר צביעת גרם. לדוגמה, ניתן להבדיל בין Cocci, או חיידקים עגולים, לבין Bacillus בצורת מוט, או לזהות חיידקים, היוצרים גדילים, בהשוואה לאלה שבדרך כלל מצטברים כגושים או מופיעים לבד.
בתמונת מיקרוסקופ מוכתמת בקפסולה, תאי החיידקים יהיו בדרך כלל מוכתמים בסגול, והרקע של השקופית צריך להיות מוכתם כהה. על רקע כהה זה, קפסולות החיידקים, אם קיימות, יופיעו כהילה ברורה סביב התאים.
לבסוף, בצביעה אנדוספורית, תאים צמחיים ייצבעו באדום על ידי צביעת הנגד של ספרנין. אם קיימים אנדוספורים בדגימה, אלה ישמרו על הכתם הירוק מלכיט וייראו בצבע ירוק-כחלחל.
