פלאק אסאי: שיטה לקביעת טיטר ויראלי כיחידות יוצרות פלאק (PFU)

1. הגדרת

1. לפני תחילת כל עבודה מעורבים חיידקים, ודא כי חלל העבודה מעוקר (למשל ניגב עם 70% אתנול). תמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות, לשמור על שיער ארוך קשור לאחור, ולהבטיח כי כל הפצעים מוגנים היטב במיוחד.
2. בסיום, לעקר את כל המשטחים ולשטוף / לעקר ביסודיות ידיים ופרקי כף היד.

2. פרוטוקול

1. הכנת מדיה LB
   הערה: בהתאם לזן החיידקי המארח ולבקטריופאג ', מדיום נוזלי אחר עשוי להתאים יותר לפולחן הראשוני של זן החיידקים המארח או מדיום מוצק אחר עשוי להתאים יותר לצמיחה הבאה. מרק ליסוגניה (LB) משמש בפרוטוקול זה עבור המרק והאג.
   1. מערבבים 4 גרם LB במים מזוקקים 200 מ"ל, משולש, עבור מרק LB, אגר התחתון המוצק, ואת אגר העליון הרך. כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים במיכלים המסוגלים להחזיק נפח כפול מהנפח הסופי כדי למנוע גלישה בזמן השעבוד האוטומטי.
      הערה: אם מבצעים את ההסתה במשולש, הכינו כמות כפולה של אגר תחתון LB.
   2. התאם את רמת ה-pH של כל שלושת הפתרונות ל-7.4 באמצעות NaOH או HCl לפי הצורך.
   3. הוסיפו 3 גרם כוח אגר לבקבוק אגר התחתון כדי ליצור תמיסה של 1.5% אגר לאגר המוצק
   4. הוסיפו 1.2 גרם של כוח אגר לבקבוק אגר העליון כדי להכין תמיסה של 0.6% אגר לאגר רך.
   5. מניחים את הבקבוקים, עם כובעים מהודקים למחצה, ב- autoclave להגדיר 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לעקר את הפתרונות. סגור את המכסים ברגע שהריצה תסתיים כדי למנוע זיהום.
   6. כאשר מדיה LB הגיע לטמפרטורה של כ 45-50 מעלות צלזיוס, להוסיף 450 μL של סטרילי 1 M CaCl₂ לכל שלושת פתרונות 200 mL LB כדי להפוך את הריכוז הסופי של 2.25 מ"מ.
   7. יוצקים 15 מ"ל עליקוטים של מדיום אגר מוצק לתוך מנות פטרי סטריליות (הימנעו מרעד כדי למנוע הקצפה) ואפשרו לאגר להתמצק במשך כמה שעות או לילה בטמפרטורת החדר(איור 4A). ניתן לאחסן צלחות במהופך ב-4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים.
2. פולחן של תאים מארחים
   1. יום אחד לפני ההסתערות, להוסיף 10 μL של תרבות E. coli כדי 10 מ"ל של מרק LB.
   2. לדגור את החיידקים ב 37°C לילה ב 160 סל"ד באינקובטור רועד.
   3. בבוקר של ה- assay, להוסיף 0.5 מ"ל של תרבות הלילה כדי 10 מ"ל של LB טרי.
      הערה: אם אתה מבצע את ההסתה במשולש, להכין כפול מהכמות של תרבות זו.
   4. לדגור ב 37°C ב 160 סל"ד באינקובטור רועד עד שתרבית החיידקים היא בצמיחה שלב יומן. זה יכול להיקבע באופן ספקטרופוטומטרי על ידי OD600 של 0.5-0.7.
   5. שמור את התרבות בטמפרטורת החדר עד החיידקים הם להוסיף אגר LB העליון.
3. דילול סדרתי פי 10 של בקטריופאג'
   1. הוסף 180μL של מרק LB לשבע בארות בשורה הראשונה של צלחת 96-well
      הערה: מומלץ לבצע את הדילול בטריפליקאט על מנת להגביר את האמינות הסטטיסטית שלו. כדי לעשות זאת, להכין דילול נוסף של הבקטריופאג 'בשורות השנייה והשלישית של הצלחת.
   2. בזהירות מערבולת מדגם הבקטריופאג המקורי כדי להבטיח הומוגניות ולהעביר 20 μL לתוך הבאר הראשונה.
   3. מערבבים היטב את הדגימה על ידי צנרת ולמטה.
   4. העבר 20 μL של ההשעיה המתקבלת לתוך הבאר השנייה.
   5. המשך הדילול הסדרתי על ידי העברת 20 μL של הפתרון בבאר השנייה לתוך הבאר השלישית, וכן הלאה, עד הבאר השישית, עוזב את השביעי גם שליטה שלילית שאליה לא יתווסף פאג'-השעיה. זה ייצור טווח דילול של 10^-1-10^-6.
4. ציפוי
   1. סמן את הבסיס של מנות פטרי (שהוכנו בעבר בשלב 2.1.7) עם שם, תאריך ותיאור מדגם קצר (כולל גורם דילול דגימת הפאג '). מחממים מראש את מנות הפטרי באינקובטור 37 מעלות שעה לפני ההסתה.
   2. ממיסים את אגר-מדיום רך מוצק (נעשה בדרך כלל באמצעות מיקרוגל; אגר מוצק נמס ב 85°C), ולתת לו להגיע סביב 45 מעלות צלזיוס. ניתן למקם את המדיה המחוממת באמבט מים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להגיע לטמפרטורה מתאימה. זה צריך להיות חם מספיק כדי להישאר בצורה נוזלית, אבל מגניב מספיק כדי לא להרוג חיידקים הוסיף.
   3. ערבבו תרבית חיידקים של 4 מ"ל (משלב 2.2) עם אגר רך במשקל 35 מ"ל (ב-45 מעלות צלזיוס). מערבולת כדי להפיץ את התאים באופן שווה, אך להימנע מרעד כדי למנוע הקצפה (איור 4A).
   4. סמן מבחנה סטרילית אחת עבור כל אחד שלבי הדילול הסדרתיים ואחת לדגימת הבקרה, בסך הכל 7 מבחנות מסומנות. מניחים 5 mL aliquots של תערובת אגר חיידקי / אגר רך מ שלב 2.4.3 לתוך 7 צינורות. עבוד במהירות בשלב 2.4.6 מכיוון שנפחים קטנים כאלה של מדיה מבוססת אגר יתגבשו במהירות בטמפרטורת החדר.
   5. הוסף 100 μL של מדגם הבקרה (בשלב 2.3) למבחנת הבקרה והסתובב בזהירות. השליכו את קצה הפיפטה המשומש והעבירו את אותו נפח מכל אחת מדגימות הבקטריופאג' המדוללות באופן סדרתי (שלב 2.3) למבחנות המתאימות להן, מסתחררות לערבב.
   6. העבירו מיד את תערובות 5 מ"ל לצלחות אגר עם התווית, המחוממות מראש, המוצקות(איור 4A). מערבבים בעדינות את הצלחות כדי להפיץ את התערובות.
      הערה: אם אתה מבצע את ההסתה במשולש, חזור על שלבים 2.4.3-6 פעמיים נוספות.
   7. לאטום כל צלחת עם סרט מעבדה, ולאפשר לשתי השכבות להתמצק כראוי בטמפרטורת החדר (כ -15 דקות) לפני הצבתם כלפי מעלה כלפי מטה אינקובטור 37 מעלות צלזיוס, מגרה צמיחה של החיידקים והפאג ', במשך 24 שעות או עד פלאקים לפתח, זה בדרך כלל לוקח בערך 1-5 ימים עבור לוחות להופיע (איור 4B), אבל התזמון משתנה במידה ניכרת בהתאם לתנאי הדגירה, בינוני, ואת המינים החיידקיים.

3. ניתוח נתונים ותוצאות

1. ספירת לוחות
   1. ודא כי אין לוחות גלויים בלוחות המסומנים "שליטה", כמו זה יצביע על זיהום ויראלי.
   2. התחל עם הצלחות המסומנות 10^-6, המכיל את דגימת הבקטריופאג ' המדוללת ביותר. לספור את הלוחות מבלי להסיר את המכסה, סימון אותם עם עט כמו שאתה הולך כדי לציין אילו לוחות כבר נספרו.
   3. תספור את הלוחיות הנותרות. כמה צלחות עשויות להיות מעט מדי או יותר מדי לוחות לספור. השתמש בצלחות עם 10-150 לוחות לניתוח נוסף.
2. חישוב PFU
   1. חלק את מספר הלוחות על ידי גורם הדילול,(למשל. 10^-6 עבור המדגם המדולל ביותר) כדי להגביר את מספר יחידות יצירת פלאק (PFU) ב 100 μL של תערובת פאג '.
      הערה: אם מבצעים את ההסתה בשלושה טריפלים, השתמשו במספר הממוצע של לוחות משלוש הצלחות.
   2. כדי לקבוע את הריכוז (ב PFU / mL) של המדגם המקורי, להכפיל על ידי גורם דילול נוסף של 10, שכן רק 100 μL של מדגם היה מצופה. (כלומר)
   3. חשב את הערך הממוצע של PFU / mL עבור כל הדילולים שהיו בין 10 ל 150 לוחות כדי להשיג תוצאה אמינה יותר.