What does it mean for E. coli cells to be competent?

Competent E. coli cells are capable of taking in DNA molecules from their environment. Chemical competence is induced by incubating cells in a calcium chloride solution, which makes the cell membrane permeable to DNA. This treatment allows negatively-charged DNA to overcome the repulsion from the negatively-charged bacterial cell surface.

Why is a heat shock step necessary during bacterial transformation?

The heat shock at 42 degrees Celsius for 45 seconds drives DNA across the bacterial cell wall and membranes into competent cells. This temperature change, followed by rapid cooling on ice, favors DNA uptake by creating a temperature imbalance that enhances the transformation process and increases efficiency.

How do antibiotic resistance genes help identify successfully transformed bacteria?

Plasmids like pUC19 carry antibiotic resistance genes that serve as selectable markers. When transformed bacteria are plated on selective media containing ampicillin, only cells that have taken up the plasmid survive and express the resistance gene product. Non-transformed cells cannot survive on antibiotic-containing media.

What is the purpose of calculating transformation efficiency in this experiment?

Transformation efficiency measures how many bacterial cells successfully take up plasmid DNA per microgram of DNA used. It is calculated by dividing the colony-forming units (CFUs) counted on selective plates by the amount of DNA plated and the dilution factor, providing a quantitative assessment of the transformation procedure's success.

Why must E. coli cells be in mid-exponential growth phase before transformation?

Bacterial cells in mid-exponential growth phase are physiologically robust enough to withstand the heat shock treatment during transformation. Cells in other growth stages are too sensitive to the temperature stress, resulting in loss of viability and significantly decreased transformation efficiency.

How does restriction enzyme digestion confirm successful plasmid transformation?

After isolating plasmid DNA from transformed colonies, a restriction enzyme digest cuts the DNA at predictable locations. When digested pUC19 is run on an agarose gel, it produces a single band at 2,686 base pairs, confirming the expected plasmid size and verifying successful transformation of the desired DNA.

What different conformational states can circular plasmid DNA adopt in a gel?

Uncut circular plasmid DNA can exist in multiple conformational states: supercoiled, open circular, or more linear forms. Each conformation migrates through the gel at different rates, causing the undigested plasmid lane to display two or three bands of varying brightness rather than a single band.

טרנספורמציה של תאי E. coli באמצעות הליך סידן כלוריד מותאם

0 צפיות10:54 דק׳

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה וההפיכה של E. coli DH5α מוסמך באמצעות הסתגלות של הליך סידן כלורי (12).

1. הגדרת

ציוד
- ספקטרופוטומטר
- צנטריפוגה סורבה (או שווה ערך)
- צנטריפוגה על הספסל
- בלוק חום או אמבט מים
- שייקר מסלולית
- חממה נייחת
- מגש יציקת ג'ל
- ובכן מסרקים
- מקור מתח
- קופסת ג'ל
- מקור אור UV
- מיקרוגל
פתרונות ותגמולים
- ציר לוריא-ברטאני (LB) (10 גר' קזאין אנזימי הידרוליזאט, 5 גר' תמצית שמרים ו-5 גר' נתרן כלורי ב-1,000 מ"ל של H₂O)
- מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט (SOC): (2% (w/v) טריפטון, 0.5% (w/v) תמצית שמרים, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 מ"מ MgSO_4,ו 20 mM גלוקוז)
- פתרון CaCl₂-MgCl₂ (80 מ"מ MgCl₂, 20 מ"מ CaCl_2).
- פתרון M CaCl₂ (אם תאים ישתנו באופן מיידי) או פתרון 0.1M CaCl₂ המכיל 10% (v/v) גליסול (אם תאים יוקפאו לשימוש עתידי).
- לוחות אגר LB
- לוחות סלקטיביים אגר LB (לניסוי זה, מאז plasmid בשימוש מעניק עמידות אמפיצלין, לוחות אגר LB המכיל אמפיצלין 100 מיקרוגרם / mL שימשו)
- אי קולי זן DH5α
- פלסמיד pUC19 DNA (100 pg / μl)
- ערכת מיני-הכנה ספין QIAprep (קיאגן)
- הינדי אנזים הגבלת III
- 1 kb בתוספת סולם DNA
- אגרוז נקודת התכה נמוכה
- 1X TAE buffer (בסיס טריס 40 מ"מ, 20 מ"מ חומצה אצטית ו-1mM EDTA)
- אתידיום ברומיד (10 מ"ג/מ"ל)
הערות בטיחות כלליות
אי קולי DH5α מסווג כ-Biosafety רמה 1 (BSL1). חיידקים בקטגוריה זו מהווים איום קטן עד לא קטן של זיהום אצל מבוגרים בריאים. עם זאת, נדרשת מניפולציה זהירה של המיקרואורגניזם.

חשוב כל השלבים בפרוטוקול זה צריך להתבצע באמצעות טכניקות אספטיות ועל קרח או 4 מעלות צלזיוס, אלא אם צוין.

2. פרוטוקול

מתוך מלאי קפוא של E. coli DH5α (קפוא ב 20% גלילסול מתרבות לילה גדל LB) פס החוצה חיידקים לבידוד על צלחת אגר LB. דגירה ב 37°C לילה (16-20 שעות).
לחסן מושבה אחת לתוך 3 מ"ל של מרק LB בצינור. תגדלו רועדים ב-210 סל"ד ב-37°C בלילה (16-20 שעות).
מדוד את OD600 של תרבות הלילה. השתמש בתרבות הלילה כדי לחסן 100 מ"ל של מרק LB בבקבוקון 1 ליטר ל- OD600 = 0.01. לדגור על התרבות רועדת במרץ (210 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס ניטור OD600 בספקטרופוטומטר כל 15-20 דקות, עד התרבות מגיעה OD600 = 0.35 (כ 3 שעות).
הערה: כדי שהטרנספורמציה תהיה יעילה, תאים חיידקיים צריכים להיות בשלב צמיחה בינוני מעריכי. המספר המרבי של תאים צריך להיות 10⁸ תאים / מ"ל, אשר עבור רוב הזנים של E. coli מתאים OD600 = 0.4. השימוש בספקטרופוטומטר מאפשר למדוד את OD600, המאפשר לקבוע כי התאים נמצאים בשלב הצמיחה המתאים. אם פרוטוקול זה ישמש לזנים אחרים של חיידקים, כיול כדי לקבוע את מספר המושבות היוצרות יחידות בערכי OD600 ספציפיים יהיה צורך לקבוע מתאם זה.
העבר את 50 מ"ל של התרבות לכל אחד מ -2 בקבוקי צנטריפוגה פוליפרופילן קר כקרח. מניחים את הבקבוקים על קרח במשך 20 דקות כדי להתקרר.
לשחזר את התאים על ידי צנטריפוגה ב 2700g (4100 סל"ד ברוטור GSA סורבאלי) במשך 10 דקות ב 4°C.
הסר את סופר-טבעי. לנקז את עקבות האחרונים של מדיה על ידי הנחת הבקבוק הפוך על כרית או מגבת נייר.
resuspend כל גלולה חיידקית לתוך 30 מ"ל של CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl_2,20 mM CaCl₂) פתרון קר כקרח. ראשית להוסיף 5 מ"ל של הפתרון, מערבולת בזהירות עד הכדור נמס לחלוטין ולאחר מכן להוסיף את 25 מ"ל הנותרים של פתרון.
חזור על שלב 2.4.
חזור על שלב 2.5.
אם תאים מוסמכים הולכים להשתנות ישירות, resuspend כל גלולה חיידקית לתוך 2 מ"ל של CaCl₂ (0.1 M) פתרון קר כקרח על ידי מערבולת הצינורות בזהירות. אם הכדור אינו מקבל resuspended עם שיטה זו, resuspend על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה (הימנעות היווצרות בועה).
לחלופין, ניתן להקפיא ולאחסן את התאים המוסמכים לשימוש מאוחר יותר. כדי להכין מלאי קפוא של תאים מוסמכים, resuspend הכדור ב 2 מ"ל של פתרון 0.1M CaCl₂ המכיל 10% (v/ v) גליסrol. פתרון זה צריך להיות קר כקרח. השעיית תאי Aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן 1.5 מ"ל קרים כקרח (160 μl לכל צינור). להקפיא תאים מוסמכים מיד באמבט קרח / אתנול יבש. מעבירים צינורות למקפיא בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס.
כדי להפוך את CaCl₂תאים שטופלו, להעביר 50 μl של תאים מוסמכים לכל אחד 2 צינורות פוליפרופילן 1.5 מ"ל. הוסף את 1 μl (100 pg) של PUC19 plasmid DNA לאחד הצינורות ולהשאיר את הצינור השני ללא DNA (שליטה שלילית). מערבבים בעדינות (הימנעו מהיווצרות בועה). דגירה במשך 30 דקות על קרח.
הערה: לא יותר מ 50 ננוגרם של DNA בנפח של 10 μL או פחות צריך לשמש טרנספורמציה.
מעבירים את הצינורות לבלוק החום ודגר ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 מעלות בדיוק.
הערה: הלם חום הוא צעד קריטי. אין לחרוג מהטמפרטורה או זמן הדגירה.
בקלות להעביר צינורות לקרח. דגירה במשך 2 דקות.
הוסף 950 μL של מדיה SOC ודגור את הצינורות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחיידקים להתאושש ולהביע את הסמן עמיד לאנטיביוטיקה מקודד plasmid.
לדלל 10 μL של השעיית התא ב 1000 μL ב SOC (1/100 דילול) ו 100 μL של השעיית התא ב 1000 μL ב SOC (1/10 דילול). צלחת 100 μl של דילול, כמו גם את השליטה, על לוחות סלקטיביים, ולהפיץ באמצעות מרית. בדרך כלל, ציפוי 100 μL של דילול 1/100 ו 1/10 יניב מספיק מספר של מושבה להרכיב יחידות (cfu) לכל צלחת. באופן אידיאלי, מספר זה צריך לנוע בין 30-300 cfu, כך שיש מספיק מושבות אבל מופרדים אחד מהשני. עם זאת, מספר cfu יהיה תלוי ביעילות ההמרה (ראה ניתוח נתונים ותוצאות סעיף).
לדגור על הצלחות ב 37°C. מושבות שעברו טרנספורמציה אמורות להופיע בעוד 12-16 שעות (טווח זה יהיה תלוי במתח התא ובשיטת הבחירה). אף מושבה לא צריכה לגדול בשליטה השלילית.
ספר את cfu / צלחת המתקבל עבור ההמרה(טבלה 1).
כדי לאמת את טרנספורמטורים מחסה pUC19 plasmid, הכנה plasmid ועיכול לאחר מכן יבוצע. כדי לשים קץ, לחסן מושבה אחת לתוך 3 מ"ל של מרק LB בצינור. תגדלו רועדים ב-210 סל"ד ב-37°C בלילה (16-20 שעות).
הכן הכנת פלסמיד באמצעות ערכת מיני-הכנה ספין QIAprep, בהתאם להוראות היצרן.
לעכל את 1 מיקרוגרם של pUC19 מטוהר עם אנזים ההגבלה HindIII ב 37°C במשך 1 שעה.
הערה: כל אנזים שחותך באתר שיבוט מרובים pUC19 יכול לשמש עבור שלב זה.

רכיב	כמות
מאגר תקציר הגבלות של 10X	2.5 מיקרול
פלסמיד pUC19	1 מיקרוגרם
הינדי השלישי	1 מיקרול
_ח2O	20.5 μl (ל 25 μl)

הפעל סולם משקל מולקולרי, DNA pUC19 מעוכל ואותה כמות של DNA pUC19 לא מעוכל בג'ל אגרוז 1% המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל אתידיום ברומיד במשך שעה אחת ב 95 V.
הערה: הזמן והמתח ישתנו בהתאם לציוד המשמש.
דמיינו ג'ל תחת אור UV. השווה את גודל הדנ"א pUC19 המעוכל והבלתי מעוכל(איור 2)(ראה סעיף ניתוח נתונים ותוצאות).
המשך בצעדים הדרושים כדי לאמת את השינוי בהתאם למטרה של כל ניסוי טרנספורמציה מסוים.

איור 2: עיכול של DNA פלסמיד שהתאושש מתאי DH5α שעברו טרנספורמציה. DNA Plasmid התאושש מתאי DH5α שעברו טרנספורמציה, מתעכלים עם HindIII, לרוץ בג'ל אגרוז 1% ודמיינו עם מקור UV (שלבים 2.19 עד 2.22).

3. ניתוח נתונים ותוצאות

כדי לחשב את יעילות הטרנספורמציה, אינדיקטור עד כמה התאים לקחו את ה- DNA החוץ-תאי, המושבות שהושגו בטרנספורמציה צריכות להיספר:

דילול	Cfu
1/100	34
1/10	246

טבלה 1: יחידות יוצרות מושבה (cfu) שנספרו מניסוי טרנספורמציה.

יעילות טרנספורמציה (TE) היא מדד של מספר cfu הנובע מהפיכת 1 מיקרוגרם של plasmid לאמצעי אחסון נתון של תאים מוסמכים. פרמטרים רבים משפיעים על יעילות הטרנספורמציה: גודל plasmid, גנוטיפ התא, שלב הצמיחה במהלך הכנת יכולת, שיטות של טרנספורמציה, וכו '). בעת חישוב TE חשוב לשקול איזה דילול (אם בכלל) בוצע לפני ה ציפוי ולשלב אותו בחישוב המספר הכולל של cfu. יעילות ההמרה (TE) מחושבת באמצעות המשוואה הבאה:

ראשית לחלק את cfu על ידי מיקרוגרם של DNA, בדוגמה זו 0.0001μg. לאחר מכן לחלק את התוצאה על ידי גורם הדילול. בדוגמה זו, נעשה שימוש בדילול של 1/10 ו- 100μL של פתרון 1 מ"ל היה מצופה (דילול: 1/10 × 100 μL / 1000 μL = 0.01).