$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
תאי חיידקים, כמו למשל E. coli, מסוגלים להעביר מידע גנטי מתא לתא. צימוד שונה ממנגנונים אחרים של העברת DNA, כגון התמרה או טרנספורמציה, בכך שהוא דורש מגע פיזי בין התאים.
כדי להמשיך, צימוד דורש תא תורם המבטא את גורם הפוריות, או F, ותא מקבל בלעדיו, תא F מינוס. התהליך דורש שני שלבים. הראשון הוא יצירת קשר ישיר בין תא לתא. לשם כך, התא התורם מייצר מבנה חוטי חוץ-תאי הנקרא פילוס מין. זה נקרא כך מכיוון שצימוד הוא סוג של הזדווגות לחיידקים המתרבים בצורה א-מינית, אך יש לציין כי לא מדובר ברבייה מינית אמיתית מכיוון שלא מחליפים גמטות ולא נוצרים צאצאים.
השלב השני הוא מסירת DNA לתא המקבל. לאחר שפילוס המין יוצר מגע בין שני תאים, נבנה צינור הנקרא מערכת הפרשה מסוג IV המאפשר העברת DNA. לאחר מכן התא התורם מתחיל לשכפל את ה-DNA החוץ-כרומוזומלי שיועבר ונבחר על סמך נוכחות של אלמנט גנטי המכונה OriT או מקור ההעברה. קצה אחד של ה-DNA המשוכפל החדש מושחל לתוך הצינור באמצעות קשירת חלבון DNA. ככל שה-DNA משוכפל עוד יותר, הוא נשאב דרך התעלה, מתאפשר על ידי קומפלקס של חלבונים המקודדים על ידי גנים הממוקמים קרוב ל-OriT. לאחר שה-DNA מועבר במלואו, הוא ייצור פלסמיד כרומוזומלי נוסף, או שהוא עשוי להשתלב בכרומוזום של התא המקבל. לא משנה מה נקודת הקצה של ה-DNA המועבר, הגנים שהוא מקודד יבואו לידי ביטוי. ניתן להשתמש בביטוי גנים זה כדי לאשר צימוד מוצלח.
לדוגמה, חשבו על תרחיש שבו הזן התורם מבטא עמידות לאמפיצילין ומעביר זאת ב-DNA המצומד לחיידק המקבל, אך לזן המקבל יש גם גן עמידות לטטרציקלין שאינו קיים אצל התורם. במקרה זה, כאשר התאים מצופים על מדיה LB המכילה גם טטרציקלין וגם אמפיצילין, המושבות צריכות לצמוח רק מחיידקים מצומדים בהצלחה, אשר יבטאו את שני פנוטיפים העמידות. כדי לאשר עוד יותר צימוד מוצלח, ניתן לקצור DNA פלסמיד מהמושבות הללו ולאחר מכן ניתן להגביר קטע DNA ספציפי לפלסמיד המועבר באמצעות תגובת שרשרת פולימראז, או PCR. כאשר מוצר ה-PCR מופעל על ג'ל אלקטרופורזה לצד סולם בגדלים סטנדרטיים, מקטע PCR בגודל ידוע אמור להיות גלוי על הג'ל, מה שמאשר עוד יותר את ההצמדה המוצלחת. בניסוי זה, פלסמיד ישמש להעברת גן העמידות לאמפיצילין באמצעות צימוד מזן תורם לזן נמען עמיד לטטרציקלין. לאחר מכן, כדי לאשר את ההצמדה, תערובת ההצמדה תודגר על צלחת המכילה את שתי האנטיביוטיקות ותשאיר רק את החיידקים שעברו טרנספורמציה. לבסוף, צימוד מוצלח יאושר עוד יותר עם PCR.
לפני תחילת ההליך, יש ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים, כולל מעיל מעבדה וכפפות. לאחר מכן, עקר את סביבת העבודה באמצעות 70% אתנול כדי לנגב את פני השטח.
בהליך זה, גן העמידות לאמפיצילין יועבר מזן WM3064 של E. coli לזן J53 של E. coli באמצעות צימוד. הזן התורם WM3064 עמיד בפני טטרציקלין ואמפיצילין והוא דורש חומצה דיאמינופימלית, או DAP, כדי לגדול. הזן המקבל J53 עמיד רק לטטרציקלין והוא אינו דורש DAP כדי לגדול. המשמעות היא שתאים מצומדים בהצלחה צריכים להיות עמידים לטטרציקלין ואמפיצילין ויכולים לגדול ללא DAP.
הכן את תרבית הזן התורם על ידי חיסון חמישה מיליליטר של LB המכיל 0.3 מילימול של DAP עם שאריות של מלאי הגליצרול של זן התורם הקפוא. לאחר מכן, הכינו את הזן הנמען על ידי חיסון חמישה מיליליטר של מרק LB ללא DAP עם שאריות של מלאי הגליצרול הקפוא של זן הנמען. גדל את התרביות הללו בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ורעד ב-220 סל"ד באינקובטור רועד. לאחר שהתרביות גדלו ל-OD 600 של שתיים, הסר מיליליטר אחד של תרבית מכל אחת והנח אותו בשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה נפרדים חדשים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את האליקוטים הללו ב-3000 סל"ד למשך חמש דקות כדי לגלול את תאי החיידקים. השליכו את הסופרנטנט ושטפו כל כדור עם 250 מיקרוליטר של 1X PBS. צנטריפוגה שוב של הדגימות ולאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש כל כדור ב-500 מיקרוליטר של PBS.
כדי להתחיל בהליך ההצמדה, יש לשלב תחילה 50 מיקרוליטר של תאים נמענים עם 50 מיקרוליטר של תאי תורם בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ולערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בעדינות. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר מתרבית התאים הנמענת על צלחת טטרציקלין 1X אחרת המכילה DAP. לאחר מכן, הכן את הבקרה השלילית שלך על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר מתרבית התאים הנמענת רק על צלחת אגר לא סלקטיבית המכילה DAP. לאחר מכן, דגרו על לוחות ההצמדה והבקרה השלילית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
למחרת, קח מגרד תאים סטרילי וקצור תאים מצלחת ההצמדה על ידי איסוף מושבות. לאחר מכן, העבירו את המושבות לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של 1X PBS. חזור על תהליך זה כדי לאסוף את תאי הנמען מהצלחת השנייה.
לאחר מכן, מערבל את הדגימות לערבוב. לאחר הערבוב, העבירו את הצינורות לצנטריפוגה כדי לגלול בעדינות את התאים. השליכו את הסופרנטנט, ואז שטפו את כדורי התא במיליליטר אחד של PBS ומערבלו את הצינורות כדי להשהות מחדש את התאים. גלולה את התאים שוב על ידי צנטריפוגה. השליכו שוב את הסופרנטנט והשעו מחדש את שני כדורי התא במיליליטר אחד של PBS. כעת, באמצעות קצה פיפטה סטרילי, צלח 100 מיקרוליטר מתערובת תאי תגובת ההצמדה על צלחת אגר LB ללא DAP המכיל 1X טטרציקלין ו-1X אמפיצילין. חזור על שיטת הציפוי באמצעות 100 מיקרוליטר של דילול פי עשרה של אותה תערובת תאים ב-PBS על צלחת אגר LB אחרת ללא DAP המכיל 1X טטרציקלין ו-1X אמפיצילין.
לבסוף, פיפטה 100 מיקרוליטר מתערובת תאי הבקרה השלילית על צלחת אגר LB אחת עם 1X טטרציקלין בלבד. לאחר דגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס, המושבות אמורות להיות גלויות. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, בחר מושבה בודדת מלוח תגובת ההצמדה והוסף אותה לצינור המכיל חמישה מיליליטר של חומר LB סלקטיבי המכיל את שתי האנטיביוטיקה. לאחר מכן, חזור על בידוד המושבה על ידי בחירת מושבה בודדת מלוחית התא המקבלת. גדל את התרביות הללו בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-220 סל"ד.
למחרת, נגב את הספסל עם 70% אתנול והסר את הצלחות מהחממה. השתמש בערכת הכנת DNA מיני כדי לבודד DNA מ-4. 5 מיליליטר מכל תרבית על פי הוראות היצרן. לאחר השלמת הכנת המיני DNA, יש להוציא את ה-DNA באמצעות 35 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. לבסוף, השתמש ב-0 הנותר. 5 מיליליטר מכל תרבית להכנת מלאי גליצרול מיליליטר אחד על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 100% גליצרול לדילול אחד לאחד. הניחו את האליקוטים הללו במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון עד הצורך.
כדי לאשר צימוד מוצלח על ידי PCR, הכינו תחילה תערובת מאסטר PCR על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2X PCR לצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף 7.5 מיקרוליטר כל אחד של פריימר קדימה של 10 מיקרו-מולרי ופריימר הפוך של 10 מיקרו-מולרי שנועד להגביר את גן העמידות לאמפיצילין מהפלסמיד. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר PCR שנייה על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2X PCR לצינור מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן הוספת 7.5 מיקרוליטר כל אחד של פריימר קדמי של 10 מיקרו-מולרי ופריימר הפוך של 10 מיקרו-מולרי שנועדו להגביר גן משק בית, במקרה זה DNA gyrase B.
כעת, הוסף 15 מיקרוליטר מתערובת המאסטר הראשונה לצינור PCR ולאחר מכן הוסף 10 ננוגרם, כשני מיקרוליטרים של התבנית DNA ניסיוני לאותו צינור. הביאו את התגובה לנפח סופי של 25 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז. חזור על שלבים אלה כדי לייצר את חמש התגובות הנותרות, כך שהצינורות יכילו את הרכיבים המוצגים כאן. כעת, העבירו את התגובות הללו לתרמו-סייקלר כשהבלוק מחומם מראש ל-98 מעלות צלזיוס ואז התחילו את התוכנית. לאחר השלמת ה-PCR, הסר את הצינורות מהמכונה. לאחר מכן, טען שני מיקרוליטר מכל תגובה מעורבב עם שני מיקרוליטרים של צבע טעינה וארבעה מיקרוליטרים של סמן משקל מולקולרי לבארות עוקבות של ג'ל אגרוז 1%. הגדר את הג'ל לפעול על 150 וולט למשך 20 דקות. לבסוף, דמיין את הג'ל באמצעות תאורת UV.
בניסוי זה, ההעברה המוצלחת של גן העמידות לאמפיצילין באמצעות צימוד אושרה באמצעות PCR. כאן, יש להבחין ברצועה בגודל של כ-500 זוגות בסיסים בבאר המכילה את ה-DNA המצומד ואת פריימרים האמפיצילין, ובכן שניים בדוגמה זו. גן משק בית, DNA gyrase B, הוטען לבארות 3 ו-5 עם DNA מצומד ו-DNA של תא מקבל, בהתאמה. רצועות שנצפו בבארות אלה פועלות כבקרה חיובית כדי להבטיח שתבנית ה-DNA הייתה קיימת וש-PCR הצליח. אין להבחין ברצועות בבאר המכילה את התגובה ל-DNA של תא הנמען ולזוג פריימר אמפיצילין, באר ארבע בדוגמה זו, מכיוון שתאי הנמען אינם עמידים לאמפיצילין. בנוסף, אין להבחין ברצועות בתגובות חסרות DNA תבנית, בארות שש ושבע כאן. אם תנאים אלה מתקיימים, זה יאשר את ההעברה המוצלחת של גן העמידות לאמפיצילין, ויעניק עמידות לאמפיצילין מזן WM3064 של E. coli לזן J53 של E. coli.
