הטיות: שיטה להעברת עמידות אמפיצ'ין מתורם לנמען E. coli

1. הגדרת

1. Autoclave כ 1L של לוריא-ברטאני בינוני (LB). זה סטרילי LB ישמש כדי להפוך כ 5 מ"ל של LB המכיל 0.3 mM חומצה diaminopimelic (DAP).
2. לאסוף את הצלחות הבאות: צלחות אגר LB עם 1X טט ו 0.3 mM DAP, צלחות אגר LB עם 1X טט בלבד, ו צלחות אגר LB עם 1X Amp / Tet בלבד.
3. ודא כי כמה גליצרל וקופסה של טיפים פיפטה פלסטיק מעוקר מראש נמצאים בהישג יד.
4. לפני תחילת כל עבודה מעורבים חיידקים, לחטא את סביבת העבודה עם 70% אתנול. תמיד ללבוש את ציוד המגן האישי הדרוש, כולל חלוק מעבדה וכפפות.
5. לאחר סיום, לחטא את כל המשטחים והכפפות עם 70% אתנול ולשטוף ידיים.

2. הכנת מאמץ תורם ומקבל

1. הכן תרביות חיידקיות 5 מ"ל של זנים התורם והנמען ולגדל אותם לילה ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד. זן התורם צריך להיות גדל LB עם 0.3 mM DAP.
2. ספין למטה 1 מ"ל של שתי תרביות (~ 3000 סל"ד במשך 5 דקות) ולשטוף את התאים עם PBS.
3. resuspend התאים 500 μL של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS).

3. הטיות

1. שלב 50 μL של תאים נמענים עם 50 μL של תאים תורמים בצינור microcentrifuge לערבב על ידי pipetting.
2. לדגור על תערובת התא במשך 1 שעה ב 37 °C (50 °F). זה ישפר את היעילות של הטיות לפני ובמהלכו של שלב ה ציפוי הבא.
3. Pipet 100 μL של תערובת התא על צלחת אגר עם 1X טט ו 0.3 mM DAP. אין למרוח על הצלחת.
4. Pipet 100 μL של תרבית תא הנמען על צלחת אגר עם 1X טט ו 0.3 mM DAP. אין למרוח על הצלחת.
5. לדגור על שתי הצלחות בלילה ב 37 °C (50 °F).
6. לגרד את תערובת תא ההטיות ואת תרבית התא הנמען עם מגרד תאים סטרילי. העבר את התאים לצינור microcentrifuge סטרילי ו resuspend התאים ב 1 מ"ל של PBS.
7. מערבולת את התאים בעדינות לסובב אותם למטה (~ 3000 סל"ד במשך 5 דקות).
8. resuspend התאים ב 1 מ"ל של PBS.
9. צלחת תערובת תא תגובת ההטיה על צלחת אגר LB עם 1X Amp / Tet בלבד. על צלחת זו, רק החיידקים הנמענים שהצליחו להשיג את הגן התנגדות אמפר באמצעות הטיות צפויים לגדול.
10. צלחת התאים הנמען על צלחת אגר LB עם 1X טט בלבד. על צלחת זו, רק חיידקי נמען ללא מנונים, שאין להם את הגן התנגדות אמפר, צפויים לגדול.
11. לדגור על הצלחות לילה ב 37 °C (50 °F).
12. בחר מושבות בודדות משתי הצלחות והשתמש בהן כדי לגדל תרביות לילה ב-5 מ"ל מדיה (37 מעלות צלזיוס עם אוויר ב-220 סל"ד).

4. בידוד דנ"א

1. לבודד DNA מן התרבויות שהוכנו בעבר באמצעות 4.5 מ"ל של נפח התרבות הכולל על ידי מיניכנה DNA.
2. כדי לעשות זאת, לחמוק DNA באמצעות 35 μL של מים ללא נוקלאז.
3. DNA טהור ייצור יחס ספיגה (A_260/280) של כ 1.8.
4. השתמש 0.5 מ"ל הנותרים של כל תרבית כדי להכין מניות גליצרול על ידי ביצוע תערובת 1:1 של תרבית חיידקים 100% גליצל.
5. לאחסן את מלאי המקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.

5. אישור הטיות העברת פלסמיד על ידי PCR

1. הכן שני תערובות מאסטר PCR, כל אחד עם קבוצה שונה של פריימרים קדימה והפוך, אחד מיקוד קטע 500 זוג בסיס בתוך הגן התנגדות אמפיצלין והשני מיקוד קטע בתוך גן משק בית.
   1. פריימרים של גנים משק בית נועדו להגביר קטע של DNA בתוך קידוד הגן החיידקי עבור DNA gyrase B (14).
   2. אמצעי האחסון המחודשים הבאים שימשו להכנת 90 μL של כל תערובת ראשית:
      7.5 μL של פריימר קדמי של 10 מיקרומטר
      7.5 μL של פריימר הפוך 10 מיקרומטר
      75 μL של 2X PCR מאסטר מיקס
2. הכן את שש תגובות ה- PCR הבאות באמצעות תערובת מאסטר של 15 μL, 10 ננוגרם של DNA תבנית ומים ללא נוקלאז עד לנפח סופי של 25 μL.
   DNA תגובת הטיות פריימרים אמפיצלין
   DNA תגובת הטיות וראשי משק בית
   פריימרים של שליטה שלילית בדנ"א ובאמפיצילין
   דנ"א שליטה שלילית וראשי תוצאות משק בית
   אין פריימרים DNA ואמפיצילין
   אין פריימרים לדנ"א ולניקיון הבית
3. העבר תגובות אלה למכונת PCR עם הבלוק שחומם מראש ל- 98 C והתחל לבצע תרמוגמה בתנאים הבאים:
   98 °C (70°F) למשך 30 שניות
   25-35 מחזורים של 98 °C (5-10 שניות), 45-72 °C למשך 10 עד 30 שניות ו- 72 °C למשך 15-30 שניות לק"ג
   72 °C (5-10 דקות)
   החזק ב- 4 °C (70 °F)
4. לטעון את כל שש תגובות PCR על ג'ל אגרוז 1% ולהפעיל ב ~ 150V במשך כ 20 דקות.
5. דמיינו את מוצר המחשב באמצעות תאורת UV.