הטיות: שיטה להעברת עמידות אמפיצ'ין מתורם לנמען E. coli
מקור: אלכסנדר ס. גולד1, טוניה מ. קולפיטס1
1 המחלקה למיקרוביולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת בוסטון, המעבדות הלאומיות למחלות זיהומים מתעוררות, בוסט…
1. הגדרת
- Autoclave כ 1L של לוריא-ברטאני בינוני (LB). זה סטרילי LB ישמש כדי להפוך כ 5 מ"ל של LB המכיל 0.3 mM חומצה diaminopimelic (DAP).
- לאסוף את הצלחות הבאות: צלחות אגר LB עם 1X טט ו 0.3 mM DAP, צלחות אגר LB עם 1X טט בלבד, ו צלחות אגר LB עם 1X Amp / Tet בלבד.
- ודא כי כמה גליצרל וקופסה של טיפים פיפטה פלסטיק מעוקר מראש נמצאים בהישג יד.
- לפני תחילת כל עבודה מעורבים חיידקים, לחטא את סביבת העבודה עם 70% אתנול. תמיד ללבוש את ציוד המגן האישי הדרוש, כולל חלוק מעבדה וכפפות.
- לאחר סיום, לחטא את כל המשטחים והכפפות עם 70% אתנול ולשטוף ידיים.
2. הכנת מאמץ תורם ומקבל
- הכן תרביות חיידקיות 5 מ"ל של זנים התורם והנמען ולגדל אותם לילה ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד. זן התורם צריך להיות גדל LB עם 0.3 mM DAP.
- ספין למטה 1 מ"ל של שתי תרביות (~ 3000 סל"ד במשך 5 דקות) ולשטוף את התאים עם PBS.
- resuspend התאים 500 μL של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS).
3. הטיות
- שלב 50 μL של תאים נמענים עם 50 μL של תאים תורמים בצינור microcentrifuge לערבב על ידי pipetting.
- לדגור על תערובת התא במשך 1 שעה ב 37 °C (50 °F). זה ישפר את היעילות של הטיות לפני ובמהלכו של שלב ה ציפוי הבא.
- Pipet 100 μL של תערובת התא על צלחת אגר עם 1X טט ו 0.3 mM DAP. אין למרוח על הצלחת.
- Pipet 100 μL של תרבית תא הנמען על צלחת אגר עם 1X טט ו 0.3 mM DAP. אין למרוח על הצלחת.
- לדגור על שתי הצלחות בלילה ב 37 °C (50 °F).
- לגרד את תערובת תא ההטיות ואת תרבית התא הנמען עם מגרד תאים סטרילי. העבר את התאים לצינור microcentrifuge סטרילי ו resuspend התאים ב 1 מ"ל של PBS.
- מערבולת את התאים בעדינות לסובב אותם למטה (~ 3000 סל"ד במשך 5 דקות).
- resuspend התאים ב 1 מ"ל של PBS.
- צלחת תערובת תא תגובת ההטיה על צלחת אגר LB עם 1X Amp / Tet בלבד. על צלחת זו, רק החיידקים הנמענים שהצליחו להשיג את הגן התנגדות אמפר באמצעות הטיות צפויים לגדול.
- צלחת התאים הנמען על צלחת אגר LB עם 1X טט בלבד. על צלחת זו, רק חיידקי נמען ללא מנונים, שאין להם את הגן התנגדות אמפר, צפויים לגדול.
- לדגור על הצלחות לילה ב 37 °C (50 °F).
- בחר מושבות בודדות משתי הצלחות והשתמש בהן כדי לגדל תרביות לילה ב-5 מ"ל מדיה (37 מעלות צלזיוס עם אוויר ב-220 סל"ד).
4. בידוד דנ"א
- לבודד DNA מן התרבויות שהוכנו בעבר באמצעות 4.5 מ"ל של נפח התרבות הכולל על ידי מיניכנה DNA.
- כדי לעשות זאת, לחמוק DNA באמצעות 35 μL של מים ללא נוקלאז.
- DNA טהור ייצור יחס ספיגה (A260/280) של כ 1.8.
- השתמש 0.5 מ"ל הנותרים של כל תרבית כדי להכין מניות גליצרול על ידי ביצוע תערובת 1:1 של תרבית חיידקים 100% גליצל.
- לאחסן את מלאי המקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
5. אישור הטיות העברת פלסמיד על ידי PCR
- הכן שני תערובות מאסטר PCR, כל אחד עם קבוצה שונה של פריימרים קדימה והפוך, אחד מיקוד קטע 500 זוג בסיס בתוך הגן התנגדות אמפיצלין והשני מיקוד קטע בתוך גן משק בית.
- פריימרים של גנים משק בית נועדו להגביר קטע של DNA בתוך קידוד הגן החיידקי עבור DNA gyrase B (14).
- אמצעי האחסון המחודשים הבאים שימשו להכנת 90 μL של כל תערובת ראשית:
7.5 μL של פריימר קדמי של 10 מיקרומטר
7.5 μL של פריימר הפוך 10 מיקרומטר
75 μL של 2X PCR מאסטר מיקס
- הכן את שש תגובות ה- PCR הבאות באמצעות תערובת מאסטר של 15 μL, 10 ננוגרם של DNA תבנית ומים ללא נוקלאז עד לנפח סופי של 25 μL.
DNA תגובת הטיות פריימרים אמפיצלין
DNA תגובת הטיות וראשי משק בית
פריימרים של שליטה שלילית בדנ"א ובאמפיצילין
דנ"א שליטה שלילית וראשי תוצאות משק בית
אין פריימרים DNA ואמפיצילין
אין פריימרים לדנ"א ולניקיון הבית - העבר תגובות אלה למכונת PCR עם הבלוק שחומם מראש ל- 98 C והתחל לבצע תרמוגמה בתנאים הבאים:
98 °C (70°F) למשך 30 שניות
25-35 מחזורים של 98 °C (5-10 שניות), 45-72 °C למשך 10 עד 30 שניות ו- 72 °C למשך 15-30 שניות לק"ג
72 °C (5-10 דקות)
החזק ב- 4 °C (70 °F) - לטעון את כל שש תגובות PCR על ג'ל אגרוז 1% ולהפעיל ב ~ 150V במשך כ 20 דקות.
- דמיינו את מוצר המחשב באמצעות תאורת UV.
תאי חיידקים, כמו למשל E. coli, מסוגלים להעביר מידע גנטי מתא לתא. צימוד שונה ממנגנונים אחרים של העברת DNA, כגון התמרה או טרנספורמציה, בכך שהוא דורש מגע פיזי בין התאים.
כדי להמשיך, צימוד דורש תא תורם המבטא את גורם הפוריות, או F, ותא מקבל בלעדיו, תא F מינוס. התהליך דורש שני שלבים. הראשון הוא יצירת קשר ישיר בין תא לתא. לשם כך, התא התורם מייצר מבנה חוטי חוץ-תאי הנקרא פילוס מין. זה נקרא כך מכיוון שצימוד הוא סוג של הזדווגות לחיידקים המתרבים בצורה א-מינית, אך יש לציין כי לא מדובר ברבייה מינית אמיתית מכיוון שלא מחליפים גמטות ולא נוצרים צאצאים.
השלב השני הוא מסירת DNA לתא המקבל. לאחר שפילוס המין יוצר מגע בין שני תאים, נבנה צינור הנקרא מערכת הפרשה מסוג IV המאפשר העברת DNA. לאחר מכן התא התורם מתחיל לשכפל את ה-DNA החוץ-כרומוזומלי שיועבר ונבחר על סמך נוכחות של אלמנט גנטי המכונה OriT או מקור ההעברה. קצה אחד של ה-DNA המשוכפל החדש מושחל לתוך הצינור באמצעות קשירת חלבון DNA. ככל שה-DNA משוכפל עוד יותר, הוא נשאב דרך התעלה, מתאפשר על ידי קומפלקס של חלבונים המקודדים על ידי גנים הממוקמים קרוב ל-OriT. לאחר שה-DNA מועבר במלואו, הוא ייצור פלסמיד כרומוזומלי נוסף, או שהוא עשוי להשתלב בכרומוזום של התא המקבל. לא משנה מה נקודת הקצה של ה-DNA המועבר, הגנים שהוא מקודד יבואו לידי ביטוי. ניתן להשתמש בביטוי גנים זה כדי לאשר צימוד מוצלח.
לדוגמה, חשבו על תרחיש שבו הזן התורם מבטא עמידות לאמפיצילין ומעביר זאת ב-DNA המצומד לחיידק המקבל, אך לזן המקבל יש גם גן עמידות לטטרציקלין שאינו קיים אצל התורם. במקרה זה, כאשר התאים מצופים על מדיה LB המכילה גם טטרציקלין וגם אמפיצילין, המושבות צריכות לצמוח רק מחיידקים מצומדים בהצלחה, אשר יבטאו את שני פנוטיפים העמידות. כדי לאשר עוד יותר צימוד מוצלח, ניתן לקצור DNA פלסמיד מהמושבות הללו ולאחר מכן ניתן להגביר קטע DNA ספציפי לפלסמיד המועבר באמצעות תגובת שרשרת פולימראז, או PCR. כאשר מוצר ה-PCR מופעל על ג'ל אלקטרופורזה לצד סולם בגדלים סטנדרטיים, מקטע PCR בגודל ידוע אמור להיות גלוי על הג'ל, מה שמאשר עוד יותר את ההצמדה המוצלחת. בניסוי זה, פלסמיד ישמש להעברת גן העמידות לאמפיצילין באמצעות צימוד מזן תורם לזן נמען עמיד לטטרציקלין. לאחר מכן, כדי לאשר את ההצמדה, תערובת ההצמדה תודגר על צלחת המכילה את שתי האנטיביוטיקות ותשאיר רק את החיידקים שעברו טרנספורמציה. לבסוף, צימוד מוצלח יאושר עוד יותר עם PCR.
לפני תחילת ההליך, יש ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים, כולל מעיל מעבדה וכפפות. לאחר מכן, עקר את סביבת העבודה באמצעות 70% אתנול כדי לנגב את פני השטח.
בהליך זה, גן העמידות לאמפיצילין יועבר מזן WM3064 של E. coli לזן J53 של E. coli באמצעות צימוד. הזן התורם WM3064 עמיד בפני טטרציקלין ואמפיצילין והוא דורש חומצה דיאמינופימלית, או DAP, כדי לגדול. הזן המקבל J53 עמיד רק לטטרציקלין והוא אינו דורש DAP כדי לגדול. המשמעות היא שתאים מצומדים בהצלחה צריכים להיות עמידים לטטרציקלין ואמפיצילין ויכולים לגדול ללא DAP.
הכן את תרבית הזן התורם על ידי חיסון חמישה מיליליטר של LB המכיל 0.3 מילימול של DAP עם שאריות של מלאי הגליצרול של זן התורם הקפוא. לאחר מכן, הכינו את הזן הנמען על ידי חיסון חמישה מיליליטר של מרק LB ללא DAP עם שאריות של מלאי הגליצרול הקפוא של זן הנמען. גדל את התרביות הללו בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ורעד ב-220 סל"ד באינקובטור רועד. לאחר שהתרביות גדלו ל-OD 600 של שתיים, הסר מיליליטר אחד של תרבית מכל אחת והנח אותו בשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה נפרדים חדשים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את האליקוטים הללו ב-3000 סל"ד למשך חמש דקות כדי לגלול את תאי החיידקים. השליכו את הסופרנטנט ושטפו כל כדור עם 250 מיקרוליטר של 1X PBS. צנטריפוגה שוב של הדגימות ולאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש כל כדור ב-500 מיקרוליטר של PBS.
כדי להתחיל בהליך ההצמדה, יש לשלב תחילה 50 מיקרוליטר של תאים נמענים עם 50 מיקרוליטר של תאי תורם בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ולערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בעדינות. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר מתרבית התאים הנמענת על צלחת טטרציקלין 1X אחרת המכילה DAP. לאחר מכן, הכן את הבקרה השלילית שלך על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר מתרבית התאים הנמענת רק על צלחת אגר לא סלקטיבית המכילה DAP. לאחר מכן, דגרו על לוחות ההצמדה והבקרה השלילית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
למחרת, קח מגרד תאים סטרילי וקצור תאים מצלחת ההצמדה על ידי איסוף מושבות. לאחר מכן, העבירו את המושבות לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של 1X PBS. חזור על תהליך זה כדי לאסוף את תאי הנמען מהצלחת השנייה.
לאחר מכן, מערבל את הדגימות לערבוב. לאחר הערבוב, העבירו את הצינורות לצנטריפוגה כדי לגלול בעדינות את התאים. השליכו את הסופרנטנט, ואז שטפו את כדורי התא במיליליטר אחד של PBS ומערבלו את הצינורות כדי להשהות מחדש את התאים. גלולה את התאים שוב על ידי צנטריפוגה. השליכו שוב את הסופרנטנט והשעו מחדש את שני כדורי התא במיליליטר אחד של PBS. כעת, באמצעות קצה פיפטה סטרילי, צלח 100 מיקרוליטר מתערובת תאי תגובת ההצמדה על צלחת אגר LB ללא DAP המכיל 1X טטרציקלין ו-1X אמפיצילין. חזור על שיטת הציפוי באמצעות 100 מיקרוליטר של דילול פי עשרה של אותה תערובת תאים ב-PBS על צלחת אגר LB אחרת ללא DAP המכיל 1X טטרציקלין ו-1X אמפיצילין.
לבסוף, פיפטה 100 מיקרוליטר מתערובת תאי הבקרה השלילית על צלחת אגר LB אחת עם 1X טטרציקלין בלבד. לאחר דגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס, המושבות אמורות להיות גלויות. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, בחר מושבה בודדת מלוח תגובת ההצמדה והוסף אותה לצינור המכיל חמישה מיליליטר של חומר LB סלקטיבי המכיל את שתי האנטיביוטיקה. לאחר מכן, חזור על בידוד המושבה על ידי בחירת מושבה בודדת מלוחית התא המקבלת. גדל את התרביות הללו בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-220 סל"ד.
למחרת, נגב את הספסל עם 70% אתנול והסר את הצלחות מהחממה. השתמש בערכת הכנת DNA מיני כדי לבודד DNA מ-4. 5 מיליליטר מכל תרבית על פי הוראות היצרן. לאחר השלמת הכנת המיני DNA, יש להוציא את ה-DNA באמצעות 35 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. לבסוף, השתמש ב-0 הנותר. 5 מיליליטר מכל תרבית להכנת מלאי גליצרול מיליליטר אחד על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 100% גליצרול לדילול אחד לאחד. הניחו את האליקוטים הללו במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון עד הצורך.
כדי לאשר צימוד מוצלח על ידי PCR, הכינו תחילה תערובת מאסטר PCR על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2X PCR לצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף 7.5 מיקרוליטר כל אחד של פריימר קדימה של 10 מיקרו-מולרי ופריימר הפוך של 10 מיקרו-מולרי שנועד להגביר את גן העמידות לאמפיצילין מהפלסמיד. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר PCR שנייה על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2X PCR לצינור מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן הוספת 7.5 מיקרוליטר כל אחד של פריימר קדמי של 10 מיקרו-מולרי ופריימר הפוך של 10 מיקרו-מולרי שנועדו להגביר גן משק בית, במקרה זה DNA gyrase B.
כעת, הוסף 15 מיקרוליטר מתערובת המאסטר הראשונה לצינור PCR ולאחר מכן הוסף 10 ננוגרם, כשני מיקרוליטרים של התבנית DNA ניסיוני לאותו צינור. הביאו את התגובה לנפח סופי של 25 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז. חזור על שלבים אלה כדי לייצר את חמש התגובות הנותרות, כך שהצינורות יכילו את הרכיבים המוצגים כאן. כעת, העבירו את התגובות הללו לתרמו-סייקלר כשהבלוק מחומם מראש ל-98 מעלות צלזיוס ואז התחילו את התוכנית. לאחר השלמת ה-PCR, הסר את הצינורות מהמכונה. לאחר מכן, טען שני מיקרוליטר מכל תגובה מעורבב עם שני מיקרוליטרים של צבע טעינה וארבעה מיקרוליטרים של סמן משקל מולקולרי לבארות עוקבות של ג'ל אגרוז 1%. הגדר את הג'ל לפעול על 150 וולט למשך 20 דקות. לבסוף, דמיין את הג'ל באמצעות תאורת UV.
בניסוי זה, ההעברה המוצלחת של גן העמידות לאמפיצילין באמצעות צימוד אושרה באמצעות PCR. כאן, יש להבחין ברצועה בגודל של כ-500 זוגות בסיסים בבאר המכילה את ה-DNA המצומד ואת פריימרים האמפיצילין, ובכן שניים בדוגמה זו. גן משק בית, DNA gyrase B, הוטען לבארות 3 ו-5 עם DNA מצומד ו-DNA של תא מקבל, בהתאמה. רצועות שנצפו בבארות אלה פועלות כבקרה חיובית כדי להבטיח שתבנית ה-DNA הייתה קיימת וש-PCR הצליח. אין להבחין ברצועות בבאר המכילה את התגובה ל-DNA של תא הנמען ולזוג פריימר אמפיצילין, באר ארבע בדוגמה זו, מכיוון שתאי הנמען אינם עמידים לאמפיצילין. בנוסף, אין להבחין ברצועות בתגובות חסרות DNA תבנית, בארות שש ושבע כאן. אם תנאים אלה מתקיימים, זה יאשר את ההעברה המוצלחת של גן העמידות לאמפיצילין, ויעניק עמידות לאמפיצילין מזן WM3064 של E. coli לזן J53 של E. coli.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the sex pilus and what role does it play in bacterial conjugation?
The sex pilus is an extracellular filamentous structure generated by the donor cell to establish direct cell-to-cell contact with the recipient cell. This physical contact is essential for conjugation to proceed. The sex pilus is encoded by the F (fertility) factor and serves as the initial bridge between donor and recipient cells before DNA transfer begins.
Q2: How does the Type IV secretion system facilitate DNA transfer during conjugation?
After the sex pilus establishes contact, a conduit called the Type IV secretion system is built between the two cells. This multiprotein complex allows DNA to be actively transported from the donor to the recipient. The system works with coupling proteins to pump replicated DNA through the channel, enabling the transfer of genetic material encoding traits like ampicillin resistance.
Q3: Why is selective plating used to confirm successful conjugation in this experiment?
Selective plating uses antibiotics to isolate only successfully conjugated cells. The donor strain requires diaminopimelic acid (DAP) to survive, while the recipient lacks ampicillin resistance. Plating on media with both tetracycline and ampicillin without DAP eliminates donor cells and non-conjugated recipients, leaving only recipient cells that acquired ampicillin resistance through conjugation.
Q4: What is the origin of transfer (OriT) and why is it important for conjugation?
The origin of transfer (OriT) is a genetic element on the plasmid that signals where DNA replication and transfer should begin. A relaxase enzyme cleaves at the nic site within the OriT sequence and covalently attaches to the DNA strand, initiating the formation of the relaxosome complex. This complex is essential for directing which DNA gets replicated and transferred to the recipient cell.
Q5: How does PCR confirm the successful transfer of ampicillin resistance genes?
PCR amplifies a specific DNA sequence from the transferred plasmid using primers designed for the ampicillin resistance gene. Successfully conjugated cells contain this gene and produce a visible band of known size on an agarose gel. A housekeeping gene serves as a positive control, while recipient-only DNA should show no amplification, confirming the resistance gene was successfully transferred.
Q6: How does conjugation differ from other bacterial DNA transfer mechanisms?
Conjugation requires direct physical contact between donor and recipient cells through the sex pilus, unlike transduction or transformation. It is unidirectional, with DNA flowing from donor to recipient, and naturally occurs in bacteria. This process has contributed to the spread of antibiotic resistance and can be manipulated in laboratory settings using selective pressures for horizontal gene transfer.
Q7: What happens to transferred DNA once it enters the recipient cell?
Once transferred, the DNA can either form an extrachromosomal plasmid or integrate into the recipient cell's chromosome. Regardless of its final location, the genes encoded on the transferred DNA are then expressed in the recipient cell. This gene expression produces the new phenotype, such as ampicillin resistance, which can be detected through selective plating or PCR analysis.