טרנסדוקציה של פאג': שיטה להעברת עמידות לאמפיצ'ילין מתורם לנמען E. coli

1. הגדרת

1. לפני תחילת כל עבודה המערבת חיידקים, לעקר את סביבת העבודה באמצעות 70% אתנול. השתמש תמיד PPE הדרוש (חלוק מעבדה וכפפות).
2. ודא כי לוחות אגר LB עם אמפיצילין 1x, פתרון P1 phage ליסאט זמין מסחרית, כלורופורם, 1 M נתרן סיטראט, גליצלול, וקופסה של טיפים פיפטה פלסטיק מעוקר מראש ומפזרי תאים נמצאים בהישג יד.
3. הכן LB סטרילי על ידי autoclaving ולהשתמש בו כדי להפוך שלושה 1 mL aliquots של פתרון מלח LB.
   1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 מיקרוגרם), 5 מ"מ CaCl₂ (11.098 מ"ג), 0.1-0.2% גלוקוז (100-200 מיקרוגרם)
   2. מ"מ MgSO₄ (12.0366 מ"ג), 5 מ"מ CaCl₂ (11.098 מ"ג)
   3. mM נתרן סיטראט (25.806 מ"ג)
4. לאחר סיום, לחטא את כל המשטחים, כמו גם כפפות עם 70% אתנול לשטוף ידיים.

2. פרוטוקול

1. תורם פאג' ליסאט הכנה
   1. הכן תרבות 1 מ"ל של תורם W3110 זן E. coli ב LB עם אמפיצלין 1x גדל לילה ב 37 °C (77 °F) עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
   2. לדלל את זה תרבות לילה 1:100 ב 1 מ"ל של LB טרי בתוספת 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, ו 0.1-0.2% גלוקוז.
   3. לגדל את זה דילול חיידקי ב 37 °C (50 °F) במשך 2 שעות עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
   4. לאחר תאים אלה הגיעו לשלב הצמיחה הלוגריתמית המוקדמת (צמיחה ניכרת וערבולות קלות), להוסיף 40 μL של P1 phage זמין מסחרית ולהשאיר ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
      1. לפני תוספת פאג', הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 ננומטר של תאים אלה צריכה להיות בערך 0.4 (6).
   5. נטר את התאים במשך 1-3 שעות עד שתרבית התסיסה.
      1. תמיס תגרום לפסולת תאית מוגברת, כמו גם לירידה ניכרת בעכורה (כלומר תאים ייחשבו lysed ברגע אחד הוא מסוגל לראות דרך התרבות).
   6. הוסף מספר טיפות (50-100 μL) של כלורופורם ליסאט ומערבבים על ידי מערבולת.
      1. כלורופורם מעקר את הפאג' ליסאט על ידי הריגת כל התאים התורמים הנותרים, משאיר רק פאג' ומגדיל את הצמיג של ליסאט זה.
   7. צנטריפוגה lysate ב 14,000 סל"ד במשך 2 דקות כדי להסיר פסולת ולהעביר supernatant לצינור טרי.
   8. מוסיפים כמה טיפות של כלורופורם ומאחסנים ב 4 °C (70 °F) לא יותר מיום אחד.
2. טרנסדוקציה
   1. הכן תרבות 1 מ"ל של נמען זן J53 E. coli גדל לילה ב LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
   2. העבר 100 μL של תורם פאג ליסאט (2.1) לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל ודגרה עם כובע פתוח ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות.
      1. דגירה זו מאפשרת לכל כלורופורם שנותר בתמיסת ה- P1 lysate להתאדות לפני הוספתו לתאי הנמען.
   3. מסנן כדורים בעדינות מתאי צנטריפוגה ב-6,000 סל"ד למשך 5 דקות.
   4. Resuspend תאים אלה ב 300 μL של LB טרי המכיל 100 mM MgSO₄ ו 5 mM CaCl₂. (P1 phage דורש סידן להיות זיהומיות).
   5. הגדר שתי תגובות באמצעות תאי חיידקי הנמען והכנת פאג ' ליסאט תורם: 1) תגובת טרנסדוקציה המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL תורם פאג 'ליסאט, ו 2) שליטה שלילית המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL של LB המכיל 100 mM MgSO₄ ו 5 mM CaCl₂.
   6. דגירה ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות עם רועד ב 220 סל"ד.
   7. הוסף 1 מ"ל LB ו 200 μL 1M נתרן סיטראט (pH = 5.5) ודגרה במשך שעה אחת ב 37 °C (57 °F) עם רועד ב 220 סל"ד.
      1. סיטראט משמש כדי להפחית את ההדבקה של P1 על ידי כלאט עם סידן, מניעת תמוגה של חיידקים המטופל.
      2. דגירה של פתרון זה מאפשרת את הביטוי של סמן התנגדות אמפיצלין.
   8. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 סל"ד במשך 5 דקות.
   9. כדורי תא resuspend ב 100 μL של LB עם 100 mM נתרן ציטוט (pH 5.5). מערבולת וצלחת פתרון שלם עבור שתי התגובות על שתי צלחות אגר LB.
      1. צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
      2. P1 זיהום פאג ' על צלחת זו דורש פסים מחדש לפני מלאי המקפיא ניתן להכין.
      3. אם פאג' לא יוסר, תרבויות הגדלות ממושבות אלה לא יגדלו אלא אם כן בנוכחות כלטור סידן.
   10. בחר כ 3-4 מושבות משתי הצלחות ופס שוב על שתי צלחות אגר LB להתפשט עם 100 μL של 1 M נתרן סיטראט (pH = 5.5).
       1. צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
   11. לדגור על הצלחות ב 37 °C (55 °F) לילה כדי לאפשר מושבות ללא פאג לגדול.
   12. בחר מושבות משתי הצלחות והשתמש בהן כדי לגדל תרביות לילה ב 5 מ"ל של LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
   13. לבודד DNA מתרביות אלה על ידי DNA miniprep באמצעות 4.5 מ"ל של נפח התרבות הכולל.
       1. יש לפנות דנ"א באמצעות 35 מיקרו-אל של מים נטולי נוקלאז.
       2. למדוד את הריכוז המתקבל על ידי Nanodrop. DNA טהור ייצור יחס ספיגה (A_260/280) של כ 1.8.
   14. השתמש 0.5 מ"ל הנותרים של כל תרבית כדי להכין 1 מ"ל מניות גליצרול על ידי ביצוע תערובת 1:1 של 100% גליצרול ותרבות חיידקים.
   15. לאחסן מלאי גליסול חיידקי ב -80 °C (50 °F).

3. ניתוח נתונים ותוצאות

1. אישור התמרת על-ידי qPCR
   1. הכן שני תערובות מאסטר qPCR עבור שש תגובות qPCR, שלושה באמצעות פריימרים qPCR עבור הגן התנגדות אמפיצלין, ושלושת האחרים באמצעות פריימרים qPCR עבור גן משק בית (14.5 μL לתגובה): 12.5 μL qPCR חיץ לערבב + 1 μL פריימר קדימה + 1 μL פריימר הפוך.
      1. בניסוי זה, השתמשנו בתערובת מאסטר ירוק SYBR.
      2. פריימרים של גנים של משק בית תוכננו להגביר מקטע דנ"א בתוך קידוד הגן החיידקי עבור gyrase DNA B (7).
   2. עבור כל תגובת qPCR, שלב 100 מיקרוגרם של DNA מכל תגובה (10.5 μL) עם 14.5 μL של תערובת מאסטר qPCR.
   3. באמצעות מכונת qPCR ופרוטוקול התרמו-אופניים המפורט בטבלה 1, נמדדה הגברה עבור עמידות האמפיצלין וגנים משק בית עבור כל שש התגובות.
   4. ערכי Cq שנוצרו על ידי qPCR שימשו לחישוב יעילות התמסורת מנורמלת של הגן עמידות אמפיצלין (איור 3), המאשר את התמרה המוצלחת של הגן עמידות אמפיצלין.
      1. ערך Cq, או ערך כימות המחזור, של מדגם הוא מספר מחזור ה- PCR המוקדם ביותר שבו מזוהה אות חריגה מסף הרקע. ערכי Cq נמוכים תואמים לרצף יעדים נוסף, להיפך.
      2. יעילות טרנסדוקציה מנורמלת של גן בתוך מדגם ניתן לחשב באמצעות ערכי Cq אלה על ידי חיסור הערך של הגן משק הבית מזה של גן היעד, יצירת ערך ΔCq, אשר ניתן להשתמש בו כדי לחשב יעילות transduction מנורמל על ידי 2^(-ΔCq).

	טמפרטורה	זמן
דנטורציה	94 °C (77 °F)	2 דקות
40 מחזורים:
דנטורציה	94 °C (77 °F)	15 שניות
קריאה על חישול, הארכה ופלואורסצנטיות	60 °C (5 °F) או 5 °C (5 °F) מתחת לראש הממשלה הנמוך ביותר Tm	1 דק'

טבלה 1: פרוטוקול תרמורכיבה על אופניים qPCR