טרנסדוקציה של פאג': שיטה להעברת עמידות לאמפיצ'ילין מתורם לנמען E. coli
מקור: אלכסנדר ס. גולד1, טוניה מ. קולפיטס1
1 המחלקה למיקרוביולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת בוסטון, המעבדות הלאומיות למחלות זיהומים מתעוררות, בוסט…
1. הגדרת
- לפני תחילת כל עבודה המערבת חיידקים, לעקר את סביבת העבודה באמצעות 70% אתנול. השתמש תמיד PPE הדרוש (חלוק מעבדה וכפפות).
- ודא כי לוחות אגר LB עם אמפיצילין 1x, פתרון P1 phage ליסאט זמין מסחרית, כלורופורם, 1 M נתרן סיטראט, גליצלול, וקופסה של טיפים פיפטה פלסטיק מעוקר מראש ומפזרי תאים נמצאים בהישג יד.
- הכן LB סטרילי על ידי autoclaving ולהשתמש בו כדי להפוך שלושה 1 mL aliquots של פתרון מלח LB.
- mM MgCl2 (952.11-2.3803 מיקרוגרם), 5 מ"מ CaCl2 (11.098 מ"ג), 0.1-0.2% גלוקוז (100-200 מיקרוגרם)
- מ"מ MgSO4 (12.0366 מ"ג), 5 מ"מ CaCl2 (11.098 מ"ג)
- mM נתרן סיטראט (25.806 מ"ג)
- לאחר סיום, לחטא את כל המשטחים, כמו גם כפפות עם 70% אתנול לשטוף ידיים.
2. פרוטוקול
- תורם פאג' ליסאט הכנה
- הכן תרבות 1 מ"ל של תורם W3110 זן E. coli ב LB עם אמפיצלין 1x גדל לילה ב 37 °C (77 °F) עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
- לדלל את זה תרבות לילה 1:100 ב 1 מ"ל של LB טרי בתוספת 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, ו 0.1-0.2% גלוקוז.
- לגדל את זה דילול חיידקי ב 37 °C (50 °F) במשך 2 שעות עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
- לאחר תאים אלה הגיעו לשלב הצמיחה הלוגריתמית המוקדמת (צמיחה ניכרת וערבולות קלות), להוסיף 40 μL של P1 phage זמין מסחרית ולהשאיר ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
- לפני תוספת פאג', הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 ננומטר של תאים אלה צריכה להיות בערך 0.4 (6).
- נטר את התאים במשך 1-3 שעות עד שתרבית התסיסה.
- תמיס תגרום לפסולת תאית מוגברת, כמו גם לירידה ניכרת בעכורה (כלומר תאים ייחשבו lysed ברגע אחד הוא מסוגל לראות דרך התרבות).
- הוסף מספר טיפות (50-100 μL) של כלורופורם ליסאט ומערבבים על ידי מערבולת.
- כלורופורם מעקר את הפאג' ליסאט על ידי הריגת כל התאים התורמים הנותרים, משאיר רק פאג' ומגדיל את הצמיג של ליסאט זה.
- צנטריפוגה lysate ב 14,000 סל"ד במשך 2 דקות כדי להסיר פסולת ולהעביר supernatant לצינור טרי.
- מוסיפים כמה טיפות של כלורופורם ומאחסנים ב 4 °C (70 °F) לא יותר מיום אחד.
- טרנסדוקציה
- הכן תרבות 1 מ"ל של נמען זן J53 E. coli גדל לילה ב LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
- העבר 100 μL של תורם פאג ליסאט (2.1) לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל ודגרה עם כובע פתוח ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות.
- דגירה זו מאפשרת לכל כלורופורם שנותר בתמיסת ה- P1 lysate להתאדות לפני הוספתו לתאי הנמען.
- מסנן כדורים בעדינות מתאי צנטריפוגה ב-6,000 סל"ד למשך 5 דקות.
- Resuspend תאים אלה ב 300 μL של LB טרי המכיל 100 mM MgSO4 ו 5 mM CaCl2. (P1 phage דורש סידן להיות זיהומיות).
- הגדר שתי תגובות באמצעות תאי חיידקי הנמען והכנת פאג ' ליסאט תורם: 1) תגובת טרנסדוקציה המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL תורם פאג 'ליסאט, ו 2) שליטה שלילית המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL של LB המכיל 100 mM MgSO4 ו 5 mM CaCl2.
- דגירה ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות עם רועד ב 220 סל"ד.
- הוסף 1 מ"ל LB ו 200 μL 1M נתרן סיטראט (pH = 5.5) ודגרה במשך שעה אחת ב 37 °C (57 °F) עם רועד ב 220 סל"ד.
- סיטראט משמש כדי להפחית את ההדבקה של P1 על ידי כלאט עם סידן, מניעת תמוגה של חיידקים המטופל.
- דגירה של פתרון זה מאפשרת את הביטוי של סמן התנגדות אמפיצלין.
- כדורי תאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 סל"ד במשך 5 דקות.
- כדורי תא resuspend ב 100 μL של LB עם 100 mM נתרן ציטוט (pH 5.5). מערבולת וצלחת פתרון שלם עבור שתי התגובות על שתי צלחות אגר LB.
- צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
- P1 זיהום פאג ' על צלחת זו דורש פסים מחדש לפני מלאי המקפיא ניתן להכין.
- אם פאג' לא יוסר, תרבויות הגדלות ממושבות אלה לא יגדלו אלא אם כן בנוכחות כלטור סידן.
- בחר כ 3-4 מושבות משתי הצלחות ופס שוב על שתי צלחות אגר LB להתפשט עם 100 μL של 1 M נתרן סיטראט (pH = 5.5).
- צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
- לדגור על הצלחות ב 37 °C (55 °F) לילה כדי לאפשר מושבות ללא פאג לגדול.
- בחר מושבות משתי הצלחות והשתמש בהן כדי לגדל תרביות לילה ב 5 מ"ל של LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
- לבודד DNA מתרביות אלה על ידי DNA miniprep באמצעות 4.5 מ"ל של נפח התרבות הכולל.
- יש לפנות דנ"א באמצעות 35 מיקרו-אל של מים נטולי נוקלאז.
- למדוד את הריכוז המתקבל על ידי Nanodrop. DNA טהור ייצור יחס ספיגה (A260/280) של כ 1.8.
- השתמש 0.5 מ"ל הנותרים של כל תרבית כדי להכין 1 מ"ל מניות גליצרול על ידי ביצוע תערובת 1:1 של 100% גליצרול ותרבות חיידקים.
- לאחסן מלאי גליסול חיידקי ב -80 °C (50 °F).
3. ניתוח נתונים ותוצאות
- אישור התמרת על-ידי qPCR
- הכן שני תערובות מאסטר qPCR עבור שש תגובות qPCR, שלושה באמצעות פריימרים qPCR עבור הגן התנגדות אמפיצלין, ושלושת האחרים באמצעות פריימרים qPCR עבור גן משק בית (14.5 μL לתגובה): 12.5 μL qPCR חיץ לערבב + 1 μL פריימר קדימה + 1 μL פריימר הפוך.
- בניסוי זה, השתמשנו בתערובת מאסטר ירוק SYBR.
- פריימרים של גנים של משק בית תוכננו להגביר מקטע דנ"א בתוך קידוד הגן החיידקי עבור gyrase DNA B (7).
- עבור כל תגובת qPCR, שלב 100 מיקרוגרם של DNA מכל תגובה (10.5 μL) עם 14.5 μL של תערובת מאסטר qPCR.
- באמצעות מכונת qPCR ופרוטוקול התרמו-אופניים המפורט בטבלה 1, נמדדה הגברה עבור עמידות האמפיצלין וגנים משק בית עבור כל שש התגובות.
- ערכי Cq שנוצרו על ידי qPCR שימשו לחישוב יעילות התמסורת מנורמלת של הגן עמידות אמפיצלין (איור 3), המאשר את התמרה המוצלחת של הגן עמידות אמפיצלין.
- ערך Cq, או ערך כימות המחזור, של מדגם הוא מספר מחזור ה- PCR המוקדם ביותר שבו מזוהה אות חריגה מסף הרקע. ערכי Cq נמוכים תואמים לרצף יעדים נוסף, להיפך.
- יעילות טרנסדוקציה מנורמלת של גן בתוך מדגם ניתן לחשב באמצעות ערכי Cq אלה על ידי חיסור הערך של הגן משק הבית מזה של גן היעד, יצירת ערך ΔCq, אשר ניתן להשתמש בו כדי לחשב יעילות transduction מנורמל על ידי 2(-ΔCq).
- הכן שני תערובות מאסטר qPCR עבור שש תגובות qPCR, שלושה באמצעות פריימרים qPCR עבור הגן התנגדות אמפיצלין, ושלושת האחרים באמצעות פריימרים qPCR עבור גן משק בית (14.5 μL לתגובה): 12.5 μL qPCR חיץ לערבב + 1 μL פריימר קדימה + 1 μL פריימר הפוך.
| טמפרטורה | זמן | |
| דנטורציה | 94 °C (77 °F) | 2 דקות |
| 40 מחזורים: | ||
| דנטורציה | 94 °C (77 °F) | 15 שניות |
| קריאה על חישול, הארכה ופלואורסצנטיות | 60 °C (5 °F) או 5 °C (5 °F) מתחת לראש הממשלה הנמוך ביותר Tm | 1 דק' |
טבלה 1: פרוטוקול תרמורכיבה על אופניים qPCR
חיידקים יכולים להסתגל במהירות לסביבה המשתנה במהירות על ידי החלפת חומר גנטי ואחת הדרכים שהם יכולים לעשות זאת היא באמצעות טרנסדוקציה, חילופי חומר גנטי בתיווך וירוסים חיידקיים. בקטריופאג', לעתים קרובות מקוצר לפאג', הוא סוג של וירוס שמדביק חיידקים על ידי היצמדות תחילה לפני השטח של המארח ולאחר מכן הזרקת ה-DNA שלו לתא החיידק. לאחר מכן הוא מפרק את ה-DNA של התא המארח עצמו ומשכפל את הגנום הנגיפי שלו, תוך שהוא חוטף את מנגנון התא כדי לסנתז עותקים רבים של החלבונים שלו. לאחר מכן, חלבוני הפאג'ים הללו מרכיבים את עצמם ואורזים את גנום הפאג'ים ליצירת צאצאים מרובים. עם זאת, בשל הנאמנות הנמוכה של מנגנון אריזת ה-DNA, מדי פעם, הפאג'ים אורזים שברי DNA חיידקי לתוך קפסיד הפאג'. לאחר גרימת הליזיס של המארח, צאצאי הפאג'ים משתחררים, וברגע שפאג' כזה מדביק תא מארח אחר, הוא מעביר את שבר ה- DNA של המארח הקודם שלו. לאחר מכן זה יכול להשתלב מחדש ולהשתלב באופן קבוע בכרומוזום של המארח החדש, ובכך לתווך העברת גנים בין שני החיידקים.
כדי לבצע התמרת פאג'ים במעבדה יש צורך בזן תורם המכיל גן מעניין, זן נמען שחסר אותו, פאג' שיכול להדביק את שני הזנים ושיטה לבחירת החיידקים המועברים. ברוב המקרים, זו תהיה מצע גידול מוצק סלקטיבי התומך בצמיחה של חיידקים מתמרים אך מעכב את הצמיחה של חיידקים שאינם מתמרים. ראשית, הזן התורם המכיל את הגן המעניין מתורבת במצע גידול נוזלי. כאשר כל החיידקים מתחלקים באופן פעיל בשלב היומן של צמיחתם, התרבות מחוסנת בפאג המטרה. לאחר שלוש עד ארבע שעות של דגירה, כאשר כמעט כל החיידקים עברו ליזה ושחררו את חלקיקי הפאג'ים, ליזאט הפאג'ים התורם מחוסן לתרבית טרייה של זן החיידקים המקבל. לאחר דגירה קצרה של שעה, התרבית צריכה להכיל כעת תערובת של תאי חיידקים מתמרים ולא מתמרים וזה מוקרן עבור התאים המתמרים על ידי פיזור חלק מהתרחיף על מצע גידול מוצק סלקטיבי מתאים. עם דגירה נוספת, התאים המומרים צריכים לגדול ולהתרבות כדי להניב מושבות גלויות. לאחר מכן ניתן לבחור מושבות אלו לניתוח נוסף באמצעות מגוון שיטות כדי לאשר עוד יותר התמרה מוצלחת, כגון PCR מושבה, ריצוף DNA או PCR כמותי.
לפני תחילת ההליך, יש ללבוש כל ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה וכפפות. לאחר מכן, יש לעקר את סביבת העבודה עם 70% אתנול ולנגב את פני השטח.
לאחר מכן, הכינו שלוש מנות של מיליליטר אחד של תמיסת מלח LB. כעת, הכינו תרבית זן תורם על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של E. coli לבקבוקון חרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיום גידול LB עם 500 מיקרוגרם אמפיצילין. לאחר מכן, גדל את התרבית בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ורעידות ב-220 סל"ד. למחרת, נגב את החלק העליון של הספסל עם 70% אתנול לפני הוצאת התרבית מהחממה הרועדת. לאחר מכן, יש לדלל את תרבית הלילה מ-1 ל-100 על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של זן תורם ל-990 מיקרוליטר של LB טרי בתוספת תמיסת מלח.
אפשר לדילול החיידקים לגדול ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם אוורור וניעור ב-220 סל"ד. לאחר שהתאים הגיעו לשלב היומן המוקדם, הוציאו את התרבית מהחממה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של פאג' P1 לתרבית ודגרו שוב. המשיכו לעקוב אחר התאים במשך שעה עד שלוש שעות עד שהתרבית תסתיים. לאחר מכן, הוסיפו 50 עד 100 מיקרוליטר כלורופורם לליזט וערבבו על ידי מערבולת. לאחר מכן, צנטריפוגה את הליזאט כדי להסיר פסולת ולהעביר את הסופרנטנט לצינור טרי. הוסיפו כמה טיפות של כלורופורם לסופרנטנט ואחסנו אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לא יותר מיום אחד.
כדי להתחיל בהליך ההתמרה, השג תרבית מיליליטר אחת של זן הנמען. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של ליזאט פאג' תורם לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ודגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כשהמכסה פתוח למשך 30 דקות כדי לאפשר לכל כלורופורם שנותר להתאדות. בזמן שהליזאט של הפאג' התורם דוגר על תאי הזן של המקבל באמצעות צנטריפוגה עדינה. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-300 מיקרוליטר של LB טרי המכיל 100 מילי-מולרי מגנזיום גופרתי ו-5 מילי-מולרי סידן כלורי.
לאחר מכן, הגדר את תגובת ההתמרה על ידי שילוב של 100 מיקרוליטר של זן הנמען ו-100 מיקרוליטר של ליזאט הפאג' התורם בצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, הגדר את הבקרה השלילית על ידי שילוב של 100 מיקרוליטר של הזן המקבל ו-100 מיקרוליטר של ה-LB עם מגנזיום גופרתי וסידן כלורי. לאחר הדגירה, הוסף 200 מיקרוליטר של נתרן ציטראט מולארי אחד ומיליליטר אחד של LB לשני הצינורות, וערבב על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. לאחר מכן, לאחר הדגירה של הצינורות במשך שעה, גלולה בעדינות את התאים באמצעות צנטריפוגה.
לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים הגלולים ב-100 מיקרוליטר של LB עם נתרן ציטראט של 100 מילי-מולרי. מערבל את התמיסות ופיפטה את כל הדגימה המומרת על צלחת אגר LB עם אמפיצילין 1X. לבסוף, פיפטה את כל הנפח של תערובת תאי הבקרה השלילית על צלחת אגר LB ללא אמפיצילין. לאחר דגירה של הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לבחור שלוש עד ארבע מושבות מלוח ההתמרה ולפס אותן על צלחת אגר LB חדשה המכילה 1X אמפיצילין ו-100 מיקרוליטר של נתרן ציטראט מולארי אחד. חזור על שיטת ציפוי זו לבקרה השלילית על צלחת אגר LB אחרת המכילה רק 100 מיקרוליטר של נתרן ציטראט מולארי אחד. לאחר מכן, דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר למושבות נקיות מפאג'ים לצמוח.
למחרת, נגב את החלק העליון של הספסל עם 70% אתנול לפני שתוציא את הצלחות שלך מהחממה. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, בחרו שלוש מושבות מלוח ההתמרה והוסיפו כל אחת מהן לצינור נפרד המכיל חמישה מיליליטר של מדיה LB. לאחר מכן, בחר שלוש מושבות מלוח הבקרה השלילי והוסף אותן לצינור אחר המכיל חמישה מיליליטר של מדיה LB. גדל את התרביות בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ורעידות ב-220 סל"ד. לאחר עיקור משטח הספסל כפי שהודגם קודם לכן, השתמש בערכת מיני-הכנה ל-DNA כדי לבודד DNA מ-4.5 מיליליטר מכל תרבית בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, יש להוציא את ה-DNA עם 35 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז ולמדוד את הריכוז המתקבל על ידי ספקטרופוטומטר מעבדה. לבסוף, הכינו מלאי גליצרול על ידי הוספת 0.5 מיליליטר הנותרים של שתי תמיסות החיידקים ל -0.5 מיליליטר של 100% גליצרול.
כדי לאשר את ההעברה, הכינו תחילה שתי תערובות מאסטר qPCR ל-24 תגובות qPCR. לתערובת המאסטר הראשונה, הוסף 150 מיקרוליטר של תערובת חיץ qPCR לצינור מיקרוצנטריפוגה ו-12 מיקרוליטר כל אחד של פריימר קדימה ואחורה שנועד להגביר את גן העמידות לאמפיצילין. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר שנייה של qPCR על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של תערובת מאסטר qPCR לצינור מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן הוספת 12 מיקרוליטר כל אחד של פריימר קדימה ופריימר הפוך שנועדו להגביר גן משק בית.
עבור כל תגובת qPCR, שלב 100 מיקרוגרם של DNA ניסיוני מכל תגובה עם 14.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר qPCR. כעת, הכינו את התגובות הנותרות כפי שהודגם קודם לכן. העבירו את התגובות לתרמו-ציקלר שחומם מראש ל-94 מעלות צלזיוס ולאחר מכן התחילו את התוכנית. לבסוף, השתמש בערכי כימות המחזור, או Cq, שנוצרו על ידי qPCR כדי לחשב את יעילות ההתמרה המנורמלת של גן העמידות לאמפיצילין.
ערכי כימות המחזור, או Cq, עבור הגנים המעניינים נערכו בטבלה עבור כל אחד מהבקרות השליליות והדגימות שהומרו. ערכי Cq נמוכים, בדרך כלל מתחת ל-29 מחזורים, כמו הדגימות המומרות בדוגמה זו מצביעים על כמויות גבוהות של רצף המטרה.
גן משק בית, שגם הוא מופיע כאן, משמש כבקרת העמסה כדי לנרמל את כמות ה-DNA בכל תגובה וכבקרה חיובית כדי להבטיח שה-qPCR עובד. בתנאי שנטענות אותן כמויות של גן משק הבית, הוא נמצא באותו שיעור יחסית בכל דגימה.
לאחר מכן, כדי לחשב את ערך הדלתא Cq עבור כל דגימה, הפחיתו את ערך ה-Cq של גן משק הבית עבור כל דגימה מערך ה-Cq של גן היעד המתאים לה. לדוגמה, הדלתא Cq של הבקרה השלילית הראשונה הוא 13.54. לאחר מכן, השתמש בערך זה כדי לחשב את יעילות ההתמרה המנורמלת של כל דגימה באמצעות הנוסחה המוצגת כאן. לבסוף, ניתן לחשב את יעילות ההתמרה המנורמלת הממוצעת עבור כל קבוצת מדגם.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does a bacteriophage transfer DNA between bacterial cells?
A bacteriophage attaches to a bacterial cell surface and injects its DNA, then replicates its genome while hijacking the host's machinery. Due to low-fidelity DNA packaging, the phage occasionally packages bacterial DNA fragments into its capsid. When this phage infects another cell, it transfers the bacterial DNA, which can recombine and integrate into the new host's chromosome, mediating gene transfer between bacteria.
Q2: What are the key requirements for performing phage transduction in the laboratory?
Phage transduction requires a donor strain containing the gene of interest, a recipient strain lacking it, a phage capable of infecting both strains, and a selective growth media that supports transduced bacteria while inhibiting non-transduced ones. The selective media is essential for screening and identifying which bacterial cells successfully received the transferred genetic material.
Q3: Why is chloroform added to the phage lysate during preparation?
Chloroform is added to the phage lysate to inhibit bacterial growth and preserve the phage particles. After centrifugation removes debris, the supernatant containing phage is treated with chloroform and stored at four degrees Celsius for no more than one day, ensuring the phage remains viable for the transduction procedure.
Q4: What role do magnesium sulfate and calcium chloride play in transduction?
Magnesium sulfate and calcium chloride are added to the recipient strain suspension to enhance phage attachment and DNA transfer efficiency. These divalent cations stabilize the phage-bacterial cell interaction, increasing the likelihood of successful transduction by promoting optimal conditions for DNA uptake by recipient cells.
Q5: How does qPCR confirm successful transduction of the ampicillin resistance gene?
qPCR measures cycle quantification (Cq) values for the ampicillin resistance gene and a housekeeping gene. Low Cq values below 29 cycles indicate high target sequence amounts in transduced samples. Delta Cq values normalize results against the housekeeping gene, and normalized transduction efficiency is calculated to confirm the gene transfer occurred in recipient cells.
Q6: What is the purpose of the negative control in phage transduction experiments?
The negative control combines recipient strain with LB medium containing magnesium sulfate and calcium chloride, but without phage lysate. This control undergoes identical steps as the transduction reaction, allowing researchers to verify that any ampicillin resistance detected in transduced samples resulted from phage-mediated gene transfer, not contamination or spontaneous resistance.
Q7: Why is sodium citrate used during the transduction procedure?
Sodium citrate is added after the one-hour incubation period to chelate divalent cations and halt phage-mediated DNA transfer. This stops the transduction reaction at a defined time point, preventing continued gene transfer and allowing researchers to accurately assess the efficiency of the transduction event that occurred during the incubation window.