Name: פורסים הכנה אופקי של הרשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למד שיטת פריסה אופקית חדשנית להכנת רשתית השומרת על מורפולוגיית דנדריטים. שיטה זו משפרת את ניתוח מעגלים רטינליים ומספקת חלופה אמינה לשיטות מסורתיות במחקר עצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. Richard H. Masland ו Akimichi Kaneko שנתן לנו עצות ערך והצעות להקים את הליך הכנת הפרוסה האופקי של הרשתית.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לחסום אגר (30 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 3%, כלומר במים מזוקקים). ממיסים במיקרוגל ועל זה קודם ושופכים אותו לתוך צלחת זכוכית. שמור את המנה במקרר ב 4 o C. טיפ: הבלוק אגר אמור להיות מוכן מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בטמפרטורה נמוכה ההיתוך agarose ג&#39;ל (25 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 2.5% כלומר, בינוני). ממיסים במיקרוגל ועל זה. שמור את זה באמבט מים חמים על 35 ° C. טיפ: שמרו על ג&#39;ל agarose לא חם מדי. אם זה חם מדי, זה לוקח זמן רב להיות הקרושה, ג&#39;ל עשוי להרוג את הרשתית . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את enucleate, חיה גלגל העין ופתח אותו כמו עיינית. כדי לנזל הומור זגוגי, עיינית נפתחה ספוגה במשך 10 דקות ב hyaluronidase במדיום (0.07 מ&quot;ג / מ&quot;ל), אם בהכרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אגר לגוש (למשל, 1 ס&quot;מ X 1.5 ס&quot;מ הרשתית העכבר) ו מחובר היטב על ידי דבק מיידית על הבמה vibratome. שמור את בלוק אגר רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את להב ב 5 מעלות על מבצעה. בעדינות לחתוך את המשטח העליון של לחסום את אגר במהירות של כ. 50 מיקרומטר / sec, freq. 50 הרץ. טיפ: ודאו כי המשטח העליון של לחסום את אגר חלקה לגמרי שטוח. כמה חתכים (לפחות 3 פעמים) עשוי להיות נחוץ כדי לקבל את משטח חלק ושטוח של גוש אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את עיינית עם המדיום ללא hyaluronidase. לבודד את הרשתית של אפיתל הפיגמנט ולמקם אותו photoreceptor בצד על נייר הסינון. כדי בתוקף לצרף את הרשתית לנייר סינון, ואקום הרשתית על הנייר מסנן מספר פעמים. טיפ: ודא הרשתית מחובר נייר הסינון שטוח לחלוטין. לאחר לשים הרשתית על הנייר לסנן, לחתוך את נייר הסינון עודף סביב הרשתית (Fig.2A). העיתון לסנן עודף לעתים קרובות מונע להב מללכת לתוך שכבת המתאים של הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב בעדינות את עודף בינוני ברחוב אגר ובזהירות המקום הרשתית על הנייר סינון לחסום את אגר. כדי בתוקף במקום נייר סינון לחסום את אגר, דבק לצרף מיידית על קצה נייר הסינון. עצה: כדי להימנע סדק unexpectable, המקום הרשתית כחזית ככל האפשר על פני השטח העליון של לחסום את אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים בעדינות את הג&#39;ל בטמפרטורה נמוכה ההיתוך agarose על הרשתית. חכו דקות 1 בעדינות לשפוך את המדיום בו כדי לצנן אותה. הג&#39;ל הופך agarose הקרושה במהירות. טיפ: חם מדי agarose ג&#39;ל הורג את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את עמדת להב מיקרומטר כמה מאות מעל המשטח העליון של גוש אגר בעדינות לחתוך את החלק העליון של הקרושה agarose ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחתון למטה את המיקום להב. חותכים את הרשתית ברמה של הפרוקסימלית שליש שכבת הגרעין הפנימית (בערך בין 200 לבין 250 מיקרומטר מעל המשטח העליון של גוש אגר). טיפ: מהירות רבה מדי של הלהב יפגע קשות ברשתית. כ. 50 מיקרומטר / sec (50 הרץ) המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב כי תאים amacrine עכשיו עם הפנים כלפי מטה. בזהירות להרים את הפרוסה של הרשתית יחד עם הקרושה agarose ג&#39;ל ולמקם אותו עם הפנים כלפי מעלה בתא או צלחת. טיפ: מכיוון הרשתית העכבר הזעיר וגלי, קשה לקבל פרוסת אופקי מושלמת שכבת המתאים. פרוסת &quot;עקיפה&quot; עשוי להיות שיטה חלופית כדי לקבל את פרוסת שטוח יחסית של הרשתית. כדי לקבל את פרוסת אלכסונית, לשים עוד נייר מסנן בין הרשתית על הנייר לסנן את הבלוק אגר כפי שמוצג Fig.2B. למרות שלא ניתן לצפות פרוסת אופקי מושלם, תמיד יש כמה תחומים שבהם סומה תא amacrine הוא על פני השטח של הפרוסה. </li></ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

כל הפרוטוקולים הניסוי נערכו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בבעלי חיים.

ישנם מספר יתרונות חשובים של הכנת החתך האופקי של הרשתית. ראשית, מורפולוגיה של תאים דנדריטים להרחיב את אופקי, כגון תאים amacrine תאים אופקיים, נשמר. הוכח כי קיימים מעל 20 סוגים של תאים amacrine ברשתית (מקניל ו Masland, 1998), ולכן חשוב מאוד להשוות את המורפולוגיה של התאים עם הנכס פיזיולוגיים. שנית, ברשתית כל הר, את הסיקור הנרחב של endfeets תא של גליה מונע גישה של pipettes תיקון לתאי amacrine. ב פרוסות אופקיות,...

<table><tbody><tr><td>אגר (Agar)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז L (Agarose L)</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>317-01182</td><td>אגרוז בהמסכה בטמפרטורה נמוכה</td></tr><tr><td>היאלורונידאז (Hyaluronidase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Type I-S, 300 U/mg</td></tr><tr><td>תווך (Medium)</td><td></td><td></td><td>ב-mM: 102 NaCl, 3.1 KCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 23 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, ו-10 glucose, מתוחזק ב-pH 7.8, או, Ames&amp;rsquo; Solution (Sigma)</td></tr><tr><td>מיקרוגל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים חמים</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>סלייסר ויברטום (Vibratome slicer)</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>מסנני ממברנת MF</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>נייר סינון, גודל נקבוביות 0.45 &amp;#181;m</td></tr><tr><td>כלי ניתוח</td><td></td><td></td><td>פינצטות, להב, מלקחיים, &lt;em&gt;וכו&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td>דבק מהיר</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;למשל&lt;/em&gt; Alonalpha, Krazy Glu</td></tr><tr><td>מזרק 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

Horizontal Slice Preparation of the Retina

באופן מסורתי פרוסה האנכי והכנת כל הר של הרשתית שימשו ללימוד פונקציה של מעגלים הרשתית. עם זאת, רבים של נוירונים ברשתית, כגון תאים amacrine, להרחיב הדנדריטים שלהם בצורה אופקית, כך מורפולוגיה של תאים אמור להינזק קשות פרוסות אנכי. לקראת כל הר, במיוחד עבור תיקון-clamp הקלטות, הנוירונים ברשתית בשכבת הביניים אינם נגישים בקלות בשל הסיקור הנרחב של גליה (תאים מולר) endfeets של התא. כאן, אנו מתארים את הרומן חיתוך שיטה לשמר את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים ברשתית ללא פגע. פרוסה נעשתה אופקית על השכבה הפנימית של הרשתית באמצעות מבצעה vibratome אחרי הרשתית היה מוטבע נמוכה טמפרטורת ההתכה agarose ג&#39;ל. בהכנה זו פרוסה האופקי של הרשתית, למדנו את תפקוד הנוירונים ברשתית בהשוואה המורפולוגיה שלהם, באמצעות תיקון-clamp הקלטה, טכניקת הדמיה סידן, immunocytochemistry, ואת תא בודד RT-PCR.

באופן מסורתי פרוסה האנכי והכנת כל הר של הרשתית שימשו ללימוד פונקציה של מעגלים הרשתית. כאן, אנו מתארים את הרומן חיתוך שיטה לשמר את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים ברשתית ללא פגע.

באופן מסורתי, נעשה שימוש בחתך אנכי ובבהירה של רשתית בשלמה (whole-mount preparation) כדי לחקור את תפקודם של מעגלי הרשתית. עם זאת, רבים מ...

אז הלג'נדרי כבר כאן, וזהו מאמר מבוסס תמונות.

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרימטים שאינם בני אדם היא מין translational חשוב להבנת התפתחות והזדקנות. הארגון האנטומי של הרשתית הפרימטים עשויה לספק תובנות חשובות בתנאים נורמליים ופתולוגיים אצל בני אדם.

השער המוח: בניתוח עיניים הפרימאטים

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות...

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג'לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או השתלה.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

למד שיטת פריסה אופקית חדשנית להכנת רשתית השומרת על מורפולוגיית דנדריטים. שיטה זו משפרת את ניתוח מעגלים רטינליים ומספקת חלופה אמינה לשיטות מסורתיות במחקר עצבים.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

גלה סרטונים נוספים