ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה
February 18th, 2009
אנו מציגים שיטה להפקת cDNA מ-mRNA הסביבה. באופן כללי, הכולל RNA נאסף הראשון הסביבה, rRNA מוסר סלקטיבי, mRNA מוגבר באופן סלקטיבי, ועל cDNA מסונתז ממאגר mRNA מועשר הוא רצף. רצפים ששוחזרו ניתן להוסיף הערות באמצעות תקן טכניקות ביואינפורמטיקה כדי לזהות את הגנים לידי ביטוי.
הליך זה מתחיל ברכישת ביומסה מיקרוביאלית ימית מדגימות מים על ידי סינון מקדים דרך מסננים של חמישה ושלושה מיקרומטרים, ולאחר מכן איסוף על מסנן של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן מופק ה-RNA הכולל מהאורגניזמים שנשמרו במסנן של 0.22 מיקרומטר. ה-RNA שלנו מוסר מכלל ה-RNA על ידי פירוק אנזימטי סלקטיבי והכלאה חיסורית מועשרת Mr.N מוגברת באופן ליניארי באמצעות זנב polyA ושעתוק במבחנה.
לאחר מכן מומר ה-RNA האנטי-סנס המוגבר ל-CD NA דו-גדילי באמצעות הקסמר אקראי. ניתן לשכפל ולרצף את ה-CD NA המתקבל או לרצף ישירות את הפירו. היי, אני רייצ'ל פרסקי מהמעבדה של ד"ר מריאן מורן במחלקה למדעי הים באוניברסיטת ג'ורג'יה.
היום אנו הולכים להראות לכם נוהל לבחינת ביטוי גנים מדגימות סביבתיות. שימוש במטא טרנסקריפטומיקה סביבתית. סקוט גיפורד יראה לך כיצד לעבד דגימות סביבתיות לאיסוף RNA.
אני אראה לך כיצד לחלץ RNA מהדגימות ומ-Johanna RINs. AON תדגים הסרת RNA. לאחר מכן מריה קוסטה תעבור את שלבי הגברת ה-RNA וסינתזת CD NA.
אז בואו נתחיל. כדי להתחיל באיסוף ה-RNA הסביבתי, הקמנו את מערכת קווי הסינון על ידי הנחת קצה אחד של הצינור למים בעומק הרצוי לדגימה ומחברים את הקצה הנגדי למסנן שלושה מיקרומטר בנפח גבוה ומניחים את המשאבה בין שני קצוות הצינור. לאחר מכן מחברים את מסנן שלושת המיקרומטר למגדל המסנן של 0.22 מיקרומטר והזרימה מופנית ממגדל 0.22 מיקרומטר למטען מדורג.
העבירו כמה ליטר מים דרך המערכת לשטיפה. בסיום, הסר את הצינור מהמים בזמן שהמשאבה פועלת כדי לטהר את שארית המים מהקו. לאחר מכן, השתמש בזוג מלקחיים כדי להניח פילטר של 0.22 מיקרומטר על מגדל המסנן ולסגור אותו.
החזר את קצה הקו למים והפעל את המשאבה. אפשר לטהר את האוויר משני המסננים ולפקח על נפח המים המסוננים עם הקרבוי. לאחר סינון הנפח הרצוי, הסר את הקו מהמים והוציא את המים הנותרים מהמערכת.
ברגע שהמסנן יבש, הסר במהירות את לוחית המסנן העליונה וקפל את נייר המסנן. הנח את המסנן באריזה מערבולת והקפיא בחנקן נוזלי. לפני שנתחיל בניסוי, חשוב לציין שמכיוון ש-RNA נמצאים בכל מקום ו-mRNAs מתכלים במהירות, יש להקפיד על אמצעי זהירות סטנדרטיים לעבודה בסביבה נטולת ריבונוקלאז, כולל משטחי עבודה ופיפטות.
עם זאת בחשבון, יש ללבוש כפפות נקיות בעת טיפול בחומרים המשמשים בהליך זה. ויש לעבד דגימות בזמן קצר ככל האפשר. כדי להתחיל במיצוי ה-RNA הכולל מהמסנן של 0.22 מיקרומטר, אנו מכינים צינורות חרוזי חרוזים על ידי הוספת שמונה מיליליטר של מאגר RLT עם אתנול בטא מטו שנוסף לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.
לאחר מכן מוסיפים מיליליטר עד שניים של חרוזי RNA מערכת מיצוי קרקע ניידת. הוציאו במהירות את המסנן הקפוא מהמקפיא ושמרו אותו באריזת העולם. ניפץ אותו עם פטיש.
הוסף את המסנן המנופץ לצינור החרוטי המוכן של 50 מיליליטר ואטום את מכסה הצינור עם בושם או מערבולת סרט מעבדה למשך 10 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את צינור ה-50 מיליליטר ב-5,000 סל"ד למשך דקה אחת. בטמפרטורת החדר, הסר כמה שיותר מהליזאט והעביר אותו לצינור של 15 מיליליטר לפני הצנטריפוגה שוב למשך חמש דקות.
ב-5,000 פעמים G, הסופרנטנט מועבר לאחר מכן לצינור חדש של 50 מיליליטר ונפח אחד של 100% אתנול מתווסף לליזאט. בעזרת מזרק של 10 מיליליטר, משוך את הליזאט למעלה דרך מחט בגודל 18 עד 21 והעביר אותו בחזרה כחמש פעמים. שלבי החילוץ הבאים, השתמש ב-KaiGen R ובערכת המיני הקלה בהתאם להוראות היצרן, החל את הליזט על העמודה המסופקת עם סעפת הוואקום או עם צנטריפוגה חוזרת.
כמת את ספקטרו ה-RNA הכולל באופן פוטומטרי. לאחר קביעת תפוקת ה-RNA הכוללת, אנו משתמשים בערכה נטולת DNA טורבו אמביאן בהתאם להוראות היצרן כדי להסיר זיהומי DNA. עכשיו כשמיצוי ה-RNA הושלם, אני הולך למסור את ה-RNA הכולל לג'והנה, שתבצע את השלבים הראשונים והשניים של הסרת ה-RNA.
תודה רייצ'ל. כדי להתחיל בהסרת ה-RRNA יש לערבב בעדינות ולצנטריפוגה קצרה את ה-mRNA רק פי 10 ממאגר התגובה לפני השימוש בצינור סטרילי נטול RNA של 0.5 מיליליטר, לשלב את הנפחים המתאימים של מעכב RNA פי 10, דגימת RNA כוללת ואקסונוקלאז מסיים. על פי פרוטוקול מוקד הרעש, דגרו את התגובה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות בתרמו-סייקלר עם מכסה מחומם או אמבט מים.
לאחר מכן, סיים את התגובה עם משקעי פנול אתנול על ידי הוספת מים ללא RNA לנפח כולל של 200 מיקרוליטר ולאחר מכן הוספת נפח אחד של תמיסת פנול כלורופורם אחד לאחד לצנטריפוגת ה-mRNA. אוספים את השלב המימי ואז משקעים עם מאה אחוז אתנול ותקיפה. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
ניתן לאחסן RNA בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שאדם מוכן להשתמש בדגימה ביישומים במורד הזרם. לאחר שהשלמנו את העשרת ה-mRNA הראשונה, נשתמש בערכות העשרת חיידקי אמביאן ואקספרס מיקרוב על פי הוראות היצרן כדי להסיר כל שאריות RRNA מהדגימה שלנו. כדי להקל על הסרת RRNA אוקריוטי, נשתמש בערכת העשרת החיידקים.
כל הנפחים נקבעים על ידי קריאת הוראות היצרן. כדי להתחיל פיפטה, 300 מיקרוליטר של מאגר מחייב לתוך צינור של 1.5 מיליליטר. הוסף חמישה עד 100 מיקרוגרם RNA כולל בנפח מקסימלי של 30 מיקרוליטר ומערבולת.
הוסיפו בעדינות שני מיקרוליטרים של תערובת אוליגו לכידה לחמישה מיקרוגרם RNA במאגר קשירה והקישו בעדינות על השפופרת. סובב בקצרה את התערובת. דנטורציה של התערובת ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני כריעת התערובת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
במהלך הדגירה הזו, הכינו את חרוזי האוליגו מג על ידי שטיפתם פעם אחת במים נטולי נוקלאז ופעם אחת במאגר קשירה ולכידת החרוזים על מעמד מגנטי בין שטיפות. אחסן את החרוזים על קרח וחמם אותם לטמפרטורת החדר. חמש דקות לפני השימוש מחממים את תמיסת הכביסה ל -37 מעלות צלזיוס בגוש חום.
הוסף את תערובת האוליגו לכידת ה- RNA לחרוזי האוליגו השטופים, קבור בעדינות את הצינור וסובב. דוגרים בקצרה את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הנח את הצינור במעמד המגנטי והמתן כשלוש דקות לפני שאיבת ה-mRNA המכיל סופרנטנט ולאחר מכן העברתו לצינור איסוף על קרח.
לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת כביסה מחוממת מראש לחרוזים שנלכדו. ומערבולת עדינה ללכוד את החרוזים ולהחזיר את השוטה העל. סופרנטנט זה עם Mr.NA בצינור האיסוף על קרח.
הנח צינור איסוף על קרח תוך כדי הכנה להסרת RRNA פרוקריוטי באמצעות ערכת האקספרס של חיידקי אמבי, בה נשתמש כדי להסיר שאריות פרוקריוטיות, RRNA. השתמש בביו-אנלייזר או ב-Experion כדי לבדוק אם יש זיהום RRNA ו-MR. NA איכות. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
ניתן לאחסן RNA בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת ה-RRNA, נשתמש בערכת שני החיידקים של הודעת אמביאן AMP בהתאם להוראות היצרן כדי להגביר את ה-mRNA שלנו. אז עכשיו כשיש לנו דגימה טהורה של mRNA, אני אעביר את הניסוי למריה, שתיקח אתכם דרך הגברת mRNA וסינתזת CDNA.
תודה לך, האנה. לפני שנתחיל בהגברת ה-mRNA, מחשבים את הנפחים של כל רכיב בהודעת האמביאן AMP שני חיידקים מאסטר ערכת ערבובים מקוונים, אנו מתחילים בפוליאדנילציה של תבנית RNA על ידי הנחת עד 1000 ננוגרם של RNA כולל לתוך צינור מיקרו פוגה סטרילי ללא RNA. השתמש ב-6.5 מיקרוליטר של דגימה וללא מים נטולי RNA במאגר הראשון כדי לסנתז RNA באמצעות שעתוק במבחנה.
מומלץ להשתמש בתנור הכלאה או חממה בגלל הטמפרטורה האחידה שלהם. ומכיוון שחשוב ביותר שלא ייווצר עיבוי בתוך הצינורות, אנו ממליצים בחום על דגירה של תגובת שעתוק במבחנה של 14 שעות. כדי למקסם את תפוקת ה-RNA עבור תפוקת ה-A הגבוהה ביותר, בצע את ה-IBT בנפח תגובה סופי של 40 מיקרוליטר, מאגר RNA A ב-80 מעלות צלזיוס שלילי ב-quats של כ-10 מיקרוליטר.
לאחר הגדלת ה-RNA, הגיע הזמן לסנתז את המשלים או ה-CDNA. שיבוט הריבוטים האוניברסלי של פרומגה. ערכת מערכת סינתזה CDNA משמשת לסינתזה של CD NA מה- NA. הערכה מספקת הוראות להמרת שני מיקרוגרם, NA ל-CD NA. אנו ממליצים להזין שישה עד 10 מיקרוגרם ל-NA ולשנות את קנה המידה של התגובות בהתאם.
נקה את ה- CD NA באמצעות משקעי אתנול או מערכת ניקוי ה- DNA של אשף פרומגה. על פי הוראות היצרן, ניתן לרצף דגימות חנות ב-CDNA דו-גדילי שלילי של 80 מעלות צלזיוס ישירות בשלב זה מ-10 ליטר מי ים, הפקנו כ-10 מיקרוגרם של RNA סביבתי והגדלנו פי 20 באמצעות המרה של ה-MR המוגבר. NA ל-CDNA דו-גדילי נוצרו כמויות מספיקות של חומר לריצוף וניתוח של תעתיקים סביבתיים. זה עתה הראינו לכם כיצד להעריך ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאליות ימיות באמצעות מטא-טרנסקריפטומיקה סביבתית.
זכור תמיד שכאשר מבצעים הליך זה, ה-mRNA מתכלה במהירות ו-RNA נמצא בכל מקום. אז נקוט באמצעי זהירות סטנדרטיים לעבודה בסביבה נטולת גרעין צלעות ועבד את הדגימות במהירות האפשרית. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לייצור cDNA מ-mRNA סביבתי, המתמקדת בביומסה מיקרוביאלית ימית. התהליך כולל איסוף RNA כולל, הסרה סלקטיבית של rRNA, הגברת mRNA, וייצור cDNA לצורך רצף.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה סביבתית
- ניתוח mRNA
- ביואינופורמטיקה
רקע
- ביומסה מיקרוביאלית ימית היא חיונית להבנת תהליכים סביבתיים.
- ייצור cDNA הוא חיוני לחקר ביטוי גנים.
- הגברה סלקטיבית של mRNA משפרת את איכות נתוני הרצף.
- טכניקות ביואינופורמטיקה משמשות לביאור גנים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה ליצירת cDNA מדגימות סביבתיות.
- לשפר את ההבנה של ביטוי גנים במיקרובים ימיים.
- להקל על רצף וביאור של גנים מבוטאים.
שיטות ששימשו
- השגת ביומסה מיקרוביאלית ימית באמצעות סינון.
- חילוץ RNA כולל מאורגניזמים שנשארו.
- פירוק אנזימטי סלקטיבי להסרת rRNA.
- הגברת mRNA באמצעות זנב polyA ותעתיק in vitro.
תוצאות עיקריות
- סינתזה מוצלחת של cDNA מבריכי mRNA מועשרים.
- רצפים באיכות גבוהה שהושגו לניתוח נוסף.
- ביאור יעיל של גנים מבוטאים באמצעות ביואינופורמטיקה.
- הוכחת פוטנציאל לחקר קהילות מיקרוביאליות ימיות.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חזקה לסינתזת cDNA מ-mRNA סביבתי.
- משפרת את ההבנה של ביטוי גנים במערכות אקולוגיות ימיות.
- מציעה כלי חשוב למחקר עתידי במיקרוביולוגיה סביבתית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Environmental transcriptomics enables unbiased profiling of gene expression in complex marine microbial communities, providing critical insight into ecosystem function and microbial dynamics. For biopharma R&D, these workflows support the discovery of novel genes, pathways, and potential bioactive targets from environmental sources. Integrating robust transcriptomic analysis at the early discovery stage enhances predictive confidence and informs portfolio decisions for natural product and microbiome-based innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of gene expression in native microbial consortia.
- Supports functional target validation by capturing active transcripts without prior gene knowledge.
- Facilitates biological de-risking by revealing real-time community responses to environmental stimuli.
- Improves predictive confidence for selecting candidate genes or pathways for downstream screening.
Screening & Assay Development
- Generates validated cDNA libraries for high-throughput screening of environmental gene products.
- Standardizes mRNA enrichment and amplification, ensuring reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable preparation of sequencing-ready material for platform-based discovery.
- Provides reliable input for functional assays targeting novel enzymes or metabolites.
Translational & Preclinical Research
- Aligns environmental gene expression data with translational biomarker discovery when relevant.
- Supports continuity from environmental sampling to preclinical validation of microbial-derived candidates.
- De-risks advancement by confirming activity and expression of targets in situ.
- Enables risk-adjusted decisions for progressing environmental leads into preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This transcriptomics workflow bridges environmental sampling and molecular analysis, positioning it at the interface of early discovery and lead identification for biopharma pipelines.
- Discovery Biology: Provides unbiased gene expression profiles to clarify pathways and validate functional targets in environmental samples.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cDNA libraries suitable for downstream screening and functional assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of transcript abundance, supporting comparative analyses across conditions or time points.
- Translational Research: Offers continuity for advancing environmental gene candidates into preclinical evaluation when supported by expression data.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for environmental transcriptomics applicable to diverse sample types and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection from environmental sources.
- Operational Value: Standardizes RNA extraction, rRNA removal, and amplification for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient triage of environmental discovery programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of novel microbial-derived assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, enzymatic rRNA removal, and nucleic acid amplification.
- Demands access to filtration, extraction, and sequencing instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to minimize RNA degradation and contamination.
- May require adaptation for different environmental matrices or microbial community compositions.
- Sample processing speed and RNA stability are critical practical limitations highlighted in the protocol.
