Name: ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: למדו שיטה לניתוח ביטוי גנים בקהילות מיקרוביאליות ימיות באמצעות transcriptomics סביבתי. השיטה כוללת הסרת rRNA, הגברת mRNA וסינתזת cDNA לריצוף ואנוטציה ביואינפורמטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המימון ניתן על ידי גורדון ובטי מור קרן מענקי הקרן הלאומית למדע מענק MCB-0702125.

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

החקירה של ביטוי גנים על ידי קהילות מיקרוביאלי טבעי הפך נפוץ בשנים האחרונות כאמצעי לחקור את התפקידים האקולוגיים פונקציות של מיקרואורגניזמים. בשילוב עם זיהוי, כימות, ואפיון של מיקרואורגניזמים ימיים, ניתוח של ביטוי גנים ניתן להשתמש כדי לקשר תולדות הגזע לתפקד קהילות מיקרוביאלי טבעי. טכניקות רבות עבור מיקוד ביטוי גנים פונקציונליים להסתמך על בדיקות ספציפיות או קבוצות פריימר מיועד הגנים של רצף ידוע. לעומת זאת, transcriptomics סביבתיים יכולים לשמש לבדיקת ביטוי גנים ללא מגבלות שהוטלו על יד...

<table><tbody><tr><td>PowerSoil Bead Tubes</td><td>ערכה</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>ערכה</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>ערכה</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לבידוד mRNA פרוקריוטי mRNA-ONLY</td><td>ערכה</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>ערכה להעשרה של mRNA חיידקי MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt;</td><td>ערכה</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>ערכת MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt;</td><td>ערכה</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הגברה של RNA לחיידקים MessageAmp II-Bacteria</td><td>ערכה</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Universal RiboClone לסנתזת cDNA</td><td>ערכה</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Wizard לניקוי DNA</td><td>ערכה</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות transcriptomics הסביבה

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

מקביל metagenomics, transcriptomics סביבתיים (metatranscriptomics) מאחזר רצפים mRNAs סביבתיים מתוך מכלול של חיידקים ללא ידיעה מוקדמת של מה הגנים הקהילה יכול להיות להביע. כך הוא מספק את הפרספקטיבה משוחדת ביותר על ביטוי גנים הקהילה<em&gt; באתרו</em&gt;. הסביבה פרוטוקולי transcriptomics קשה מבחינה טכנית מאז mRNAs פרוקריוטים בדרך כלל חוסר poly (A) זנבות שהופכים הבידוד של הודעות אוקריוטים פשוטה יחסית<sup&gt; 1</sup&gt; ובגלל מחצית חיים קצר יחסית mRNAs<sup&gt; 2</sup&gt;. בנוסף, mRNAs הרבה פחות בשפע מאשר rRNAs בסך הכל תמציות RNA, ובכך רקע rRNA לעתים קרובות גוברת אותות ה-mRNA. עם זאת, טכניקות להתגבר על חלק מן הקשיים הללו לאחרונה פותחו. הליך לניתוח transcriptomes הסביבה על ידי יצירת ספריות שיבוט באמצעות primers אקראי הפוכה לתמלל ולהגביר mRNAs הסביבה תוארה לאחרונה הצליחה בשתי סביבות טבעיות שונות, אבל התוצאות היו מוטים על ידי בחירה אקראית של primers משמשות ליצירת סינתזה cDNA<sup&gt; 3</sup&gt;. ההתקדמות הגברה ליניארית של mRNA לייתר את הצורך primers אקראי בשלב הגברה מאפשרים להשתמש בחומר המוצא פחות להקטין את זמן העיבוד איסוף של דגימות ובכך למזער RNA השפלה<sup&gt; 4</sup&gt;.<em&gt; במבחנה</em&gt; שיטות תעתיק של mRNA הגברה לערב polyadenylating ה-mRNA, בשילוב מקדם T7 אל הקצה 3 של התמליל. RNA Amplified (ארנה) אז יכול להיות מומר כפול cDNA תקועים באמצעות hexamers אקראי רצף ישירות על ידי pyrosequencing<sup&gt; 5</sup&gt;. השימוש הראשון בשיטה זו בתחנת אלוהה הפגינו השירות שלה לאפיון חיידקים ביטוי הגן הקהילה<sup&gt; 6</sup&gt;.

אנו מציגים שיטה להפקת cDNA מ-mRNA הסביבה. באופן כללי, הכולל RNA נאסף הראשון הסביבה, rRNA מוסר סלקטיבי, mRNA מוגבר באופן סלקטיבי, ועל cDNA מסונתז ממאגר mRNA מועשר הוא רצף. רצפים ששוחזרו ניתן להוסיף הערות באמצעות תקן טכניקות ביואינפורמטיקה כדי לזהות את הגנים לידי ביטוי.

ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה

בדומה למטגנומיקה, טרנסקריפטומיקה סביבתית (מטה-טרנסקריפטומיקה) שולפת ומרצפה mRNA סביבתי מתוך אשכול מיקרוביאלי...

נוהל זה מתחיל בהשגת ביומסה מיקרוביאלית ימית מדגימות מים על ידי סינון מקדים דרך מסננים של 5 ו-3 מיקרומטר, ולאחריו איסוף על מסנן של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן מופק total RNA מהאורגניזמים שנלכדו על מסנן ה-0.22 מיקרומטר. ה-rRNA מוסר מה-total RNA באמצעות דגרדציה אנזימטית סלקטיבית והיברידיזציה סובטרקטיבית, ו-Mr.N מועשר ומוגבר ליניארית באמצעות polyA tailing ותעתוק in vitro.ה-RNA נוגד-הsense המוגבר מומר לאחר מכן ל-CD NA דו-גדילי באמצעות random hexamer. ניתן לשבט ולרצף את ה-CD NA שהתקבל, או לבצע עבורו pyro sequencing באופן ישיר. שלום, אני רייצ'ל פרסקי מהמעבדה של ד"ר מריאן מוראן במחלקה למדעי הימים של אוניברסיטת ג'ורג'יה.היום נדגים לכם פרוצדורה לבחינת ביטוי גנים מדגימות סביבתיות, באמצעות מטא-טרנסקריפטומיקה סביבתית. סקוט גיפורד יראה לכם כיצד לעבד דגימות סביבתיות לצורך איסוף RNA.אראה לכם כיצד להפיק RNA מהדגימות ולבצע בדיקות RIN. AON תדגים את הסרת ה-RNA. לאחר מכן, מאריה קוסטה תעבור על שלבי הגברת ה-RNA וסינתזת cDNA.אם כן, נתחיל. כדי להתחיל באיסוף ה-RNA הסביבתי, נכין את מערכת קו הסינון על ידי הנחת קצה אחד של הצינור במים בעומק הדגימה הרצוי, ונחבר את הקצה השני למסנן 3 µm לנפח גבוה, כאשר המשאבה ממוקמת בין שני קצות הצינור. לאחר מכן, מסנן ה-3 µm מחובר למגדל סינונים של 0.22 µm, והזרימה מופנית ממגדל ה-0.22

analyzing-gene-expression-from-marine-microbial-communities-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

בניה של ספריה fosmid עם הדנ"א הגנומי הסביבה מבודדים רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות מתואר. הספרייה שיבוט המתקבל הוא הרים את 384 גם צלחות בארכיון עבור סידור במורד וסינון תפקודית על ידי יישום של מערכת המושבה אוטומטיות קטיף.

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.

ריכוז מטבוליטים של צפיפות נמוכה עבור קהילות Planktonic metabolomics הסביבה באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף להערכת זמינות החומרים המזינים האורגניים והאנאורגניים ואת השפע והמבנה של קהילות מיקרוביאליות וויראליות בסביבות ימיות מרוחקות.

להתיר את השחקנים הנעלמת באוקיינוס ​​- מדריך שדה לכימיה מים והימי מיקרוביולוגיה

כתב יד זה מתאר את השימוש בטכנולוגיה חדישה המסופקת על ידי מיקרו-מערכי DNA. מיקרו-מערכים מספקים סקירה כללית של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים שנגרמו בתנאי מסוים. יתר על כן, אנו מדגישים את הקלות שבה ניתן לנתח כמויות גדולות של נתונים באמצעות חבילות תוכנה נוחות שפותחו בבית.

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

פרוטוקול זה מיועד למיצוי וריכוז של חלבון ו-DNA מביומסה מיקרוביאלית שנאספה ממי ים, ולאחר מכן יצירת פפטידים טריפטיים המתאימים לניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה טנדם.

Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

פיתחנו פרוטוקול מהיר, רגיש וניתן לשחזור לפרופיל ביטוי גנים פתוגני במהלך זיהום.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

מסופק פרוטוקול לכימות גנים ותעתיקים של חיידקים 16S rRNA ממשקעי חוף באמצעות PCR בזמן אמת. המתודולוגיה כוללת מיצוי משותף של DNA ו-RNA; הכנת RNA נטול DNA; וכימות גן rRNA 16S וכימות תעתיק באמצעות RT-q-PCR, כולל בניית עקומה סטנדרטית.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעות של שבירה הידראולית על נחלים סמוכים על ידי ניתוח קהילות המים והמשקעים שלהם.

הערכת ההשפעה של שבירה הידראולית על נחלים באמצעות חתימות מולקולריות מיקרוביאליות

הפרוטוקול מזהה גנים מרכזיים של מחזור מתאן בביצות החוף של דרום טקסס ומדמיין את התפוצה המרחבית שלהם כדי לשפר את ההבנה של ויסות המתאן והשפעותיו הסביבתיות במערכות אקולוגיות דינמיות אלה.

הדמיה של דינמיקה מיקרוביאלית של מחזור מתאן בביצות חוף

למדו שיטה לניתוח ביטוי גנים בקהילות מיקרוביאליות ימיות באמצעות transcriptomics סביבתי. השיטה כוללת הסרת rRNA, הגברת mRNA וסינתזת cDNA לריצוף ואנוטציה ביואינפורמטית.

ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה

גלה סרטונים נוספים