ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה

נוהל זה מתחיל ברכישת ביומסה מיקרוביאלית ימית מדגימי מים באמצעות סינון מקדים דרך מסננים של 5 ו-3 מיקרומטר, ולאחריו איסוף על גבי מסנן של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, RNA כולל מופק מהאורגניזמים שנשארו על מסנן ה-0.22 מיקרומטר. ה-RNA שלנו מוסר מה-RNA הכולל באמצעות פירוק אנזימטי סלקטיבי והיברידיזציה תולעתית (subtractive hybridization), ו-Mr.N מועשר ומגבר באופן ליניארי באמצעות הוספת זנב polyA ותעתוק in vitro.

לאחר מכן, ה-RNA האנטי-סנס שהוגבר מומר ל-CD NA גדיליים באמצעות random hexamer. את ה-CD NA שהתקבל ניתן לשבט ולרצף או להעבירו ישירות לריצוף pyro. שלום, אני רייכל פרסקי מהמעבדה של ד"ר מריאן מוראן במחלקה למדעי הימים באוניברסיטת ג'ורג'יה.

היום נדגים לכם פרוצדורה לבחינת ביטוי גנים מדגימות סביבתיות, באמצעות מטא-טרנסקריפטומיקה סביבתית. סקוט גיפורד יראה לכם כיצד לעבד דגימות סביבתיות לצורך איסוף RNA.

אני אראה לכם כיצד להפיק RNA מהדגימות ולבצע RINs. AON תדגים את הסרת ה-RNA. לאחר מכן, מריה קוסטה תעבור על שלבי הגברת ה-RNA וסינתזת cDNA.

בואו נתחיל. כדי להתחיל באיסוף ה-RNA הסביבתי, נכין את מערכת קו הסינון על ידי הנחת קצה אחד של הפיתול לתוך המים בעומק הדגימה הרצוי, ונחבר את הקצה המנוגד למסנן של 3 µm בנפח גבוה, כאשר המשאבה ממוקמת בין שני קצות הפיתול. לאחר מכן, מסנן ה-3 µm מחובר למגדל מסננים של 0.22 µm, והזרימה מופנית ממגדל ה-0.22 µm אל תוך כלי מדידה מדורג.

העבירו מספר ליטרים של מים דרך המערכת כדי לשטוף אותה. בסיום, הוציאו את הצינור מהמים בזמן שהמשאבה פועלת כדי לרוקן את שארית המים מהקו. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח מסנן של 0.22 micrometer על מגדל המסננים וסגרו אותו.

החזירו את קצה הצינור אל תוך המים והפעילו את המשאבה. אפשרו לאוויר להתנקז משני המסננים ועקבו אחר נפח המים המסוננים באמצעות המד שעל המכל (carboy). לאחר סינון הנפח הרצוי, הוציאו את הצינור מהמים ונקזו את שארית המים מהמערכת.

ברגע שהמסנן יבש, הסירו במהירות את לוח המסנן העליון וקפלו את נייר המסנן. העבירו את המסנן ל-whirl pack והקפיאו אותו באופן מיידי בחנקן נוזלי. לפני תחילת הניסוי, חשוב לציין כי מכיוון ש-RNAs נמצאים בכל מקום ו-mRNAs מתפרקים במהירות, יש להקפיד על אמצעי הזהירות הסטנדרטיים לעבודה בסביבה נקייה מריבונוקליאז, כולל משטחי עבודה ופיפטות.

בהתחשב בכך, יש להרכיב כפפות נקיות בעת טיפול בכל החומרים המשמשים בהליך זה. כמו כן, יש לעבד את הדגימות בזמן קצר ככל האפשר. כדי להתחיל את מיצוי ה-RNA הכולל מהמסנן של 0.22 µm, נכין מבחנות עם חרוזי קרסול על ידי הוספה של 8 mL של RLT buffer בתוספת beta mercaptoethanol למבחנה קונית של 50 mL.

לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד עד שניים של חרוזי RNA מתוך ערכה למיצוי קרקע של mobile power. מוציאים במהירות את המסנן הקפוא מהמקפיא, כאשר הוא עדיין בתוך ה-world pack, ומנפצים אותו באמצעות פטיש.

הוסיפו את המסנן המרוסק למבחנה קונית של 50 מיליליטר שהוכנה מראש, אטמו את מכסה המבחנה בעזרת פאראפילם או סרט דביק למעבדה, ובצעו וורטקס למשך 10 דקות. לאחר מכן, סבבו את המבחנה של 50 מיליליטר ב centriuge במהירות של 5,000 RPM למשך דקה אחת. בטמפרטורת החדר, הסירו כמה שיותר מהליזאט והעבירו אותו למבחנה של 15 מיליליטר לפני סבוב נוסף במ centriuge למשך חמש דקות.

ב-5,000 ×g, העבירו את העליון למבחנה חדשה של 50 milliliter והוסיפו לנפח הליסאט נפח שווה של 100% ethanol. באמצעות מזרק של 10 milliliter, שאבו את הליסאט דרך מחט בכישור 18 עד 21 והחזירו אותו חמישה פעמים בקירוב. עבור שלבי ההפקה הבאים, השתמשו בערכה KaiGen R and easy mini בהתאם להוראות היצרן, תוך העברת הליסאט לעמודה המסופקת באמצעות סביבון ואקום או באמצעות צנטריפוגציה חוזרת.

כמת את ה-RNA הכולל באופן ספקטרופוטומטרי. לאחר קביעת תנובת ה-RNA הכוללת, נשתמש בערכה Ambien turbo DNA free לפי הנחיות היצרן כדי להסיר זיהומי DNA. כעת, לאחר שהסריקת ה-RNA הושלמה, אעביר את ה-RNA הכולל לג'והנה, שתבצע את השלבים הראשון והשני להסרת RRNA.

תודה רייצ'ל. כדי להתחיל בהסרת ה-RRNA, ערבבב בעדינות וסבב קצר בסנטריפוגה את תמיפת התגובה בריכוז 10x לפני השימוש; בתוך מבחנה סטרילית ללא RNA בנפח 0.5 מיליליטר, ערבב את הנפחים המתאימים של תמיפת תגובה 10x, מעכב RNA, דגימת RNA כולל ו-terminator exonuclease. בהתאם לפרוטוקול של epicenter, דגרי את התגובה בטמפרטורה של 30 °C למשך 60 דקות בטרמוסייקלר עם מכסה מחומם או במקלחית.

בשלב הבא, סורגו את התגובה באמצעות שקיעה בפנול ואתנול על ידי הוספה ראשונית של מים נקיים ל-RNA עד לנפח כולל של 200 µL, ולאחר מכן הוספת נפח אחד של תמיסת פנול-כלורופורם ביחס של 1:1 ל-mRNA הצנטריפוגי. אספו את הפאזה המימית ולאחר מכן השקיעו באמצעות 100% אתנול ומלח. זוהי נקודה פוטנציאלית לעצירה.

ניתן לאחסן RNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש בדגימה ביישומים המשכיים. לאחר השלמת העשרה הראשונה של mRNA, נשתמש בערכות Ambien microbe enrich ו-microbe express בהתאם להוראות היצרן כדי להסיר שאריות של RRNA מהדגימה. כדי להקל על הסרת RRNA איקריוטי, נשתמש בערכת microbe enrich.

כל הנפחים נקבעים על פי הוראות היצרן. לתחילת העבודה, העבירו בפיפטה 300 µL של תמיסת קישור (binding buffer) למבחנה בנפח 1.5 mL. הוסיפו 5 עד 100 µg של RNA כולל בנפח מקסימלי של 30 µL וערבבו במיקסר (vortex).

הוסיפו בעדינות 2 µL מתערובת האוליגו לתפיסה (capture oligo mix) עבור 5 µg RNA לתוך באפר הקישור (binding buffer) ונקשו בעדינות על המבחנה. סובבו את התערובת קצרות בצנטריפוגה. דנטורו את התערובת בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות לפני כן הניחו את התערובת בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.

במהלך דגירה זו, הכין את חרוזי ה-oligo mag על ידי שטיפתם פעם אחת במים נקיים מנוקליאז (nuclease free water) ופעם אחת בבופר קישור (binding buffer), תוך לכידת החרוזים על מעמד מגנטי בין השטיפות. אחסן את החרוזים על קרח וחמם אותם עד לטמפרטורת החדר. חמש דקות לפני השימוש, חמם את תמיסת השטיפה ל-37 °C בבלוק חימום.

הוסיפו את תערובת an RNA capture oligo לחרוזי המגנט (oligo mag beads) השטופים, ערבבו בעדינות את המבחנה וסובבו במכשיר צנטריפוגה. דגרו את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C. הניחו את המבחנה במעמד המגנטי והמתינו כமூג של שלוש דקות לפני שאיבת העלייה (supernatant) המכילה את ה-mRNA והעברתה למבחנה איסוף על קרח.

בשלב הבא, הוסיפו 100 µL של תמיסת שטיפה שחוממה מראש לחרוזים הלכודים. ערבבו בעדינות באמצעות וורטקס (vortex) ואספו את העליון. העבירו את העליון המכיל mRNA למבחנה המיועדת לאיסוף על קרח.

הנח מבחנה לאיסוף על קרח בזמן ההכנה להסרה של RRNA פרוקריוטי באמצעות ערכת ambi microbe express, אותה נשתמש כדי להסיר RRNA פרוקריוטי שאריתי. השתמש ב-bioanalyzer או ב-Experion כדי לבדוק זיהום של RRNA ואת איכות ה-MR.NA. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.

ניתן לאחסן RNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר הסרת ה-RRNA, נשתמש בערכה Ambien message AMP two bacteria בהתאם להוראות היצרן כדי להגביר את ה-mRNA שלנו. כעת, לאחר שיש לנו דגימה נקייה של mRNA, אעביר את הניסוי למריה, שתדריך אתכם בתהליכי הגברת mRNA וסינתזת CDNA.

תודה, חנה. לפני שנתחיל בהגברת ה-mRNA, חשבי את הנפחים של כל רכיב של תערובות המאסטר של ערכה ל-Ambien message AMP two bacteria באופן מקוון. נתחיל בפוליאדנילציה של ה-RNA התבנית על ידי העברה של עד 1000 nanograms של RNA סך הכל לתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה סטרילית נטולת RNA. השתמשי ב-6.5 microliters של דגימה וללא RNA free water בבופר הראשון כדי לסנתז RNA באמצעות תמלול חוץ-תאי (in vitro transcription).

מומלץ להשתמש בתנור היברידיזציה או באינקובטור בשל הטמפרטורה האחידה שלהם. ומכיוון שחשוב ביותר למנוע היווצרות עיבוי בתוך המבחנות, אנו ממליצים מאוד על דגירה של תגובת שעתוק in vitro למשך 14 שעות. כדי למקסם את תפוקת ה-RNA עבור תפוקת A RNA הגבוהה ביותר, בצע את ה-IBT בנפח תגובה סופי של 40 µL ואחסן את ה-A RNA בטמפרטורה של 80- °C באליקוטים של כ-10 µL.

לאחר הגברת ה-RNA, הגיע הזמן לסנתז את ה-cDNA המשלימה. ערכת ה-Promega universal ribot Clone cDNA synthesis system משמשת לסנתז cDNA מה-RNA. הערכה מספקת הנחיות להמרת שני מיקרוגרם RNA ל-cDNA. אנו ממליצים על קלט של 6 עד 10 מיקרוגרם RNA והתאמה של התגובות בהתאם.

יש לנקות את ה-CD NA באמצעות שיקוע אתנול או באמצעות מערכת ה-promega wizard DNA cleanup. בהתאם להוראות היצרן, יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80- °C. בשלב זה ניתן לבצע ריצוף ישיר של cDNA דו-גדילי. מ-10 liters של מי ים, חילצנו כ-10 micrograms של RNA סביבתי והגבלנו פי 20; באמצעות המרה של ה-MR.NA המוגבר ל-cDNA דו-גדילי, הופקו כמויות מספיקות של חומר לריצוף ולניתוח של תמלילים סביבתיים. הרגע הדגמנו כיצד להעריך ביטוי גנים של קהילות מיקרוביאליות ימיות באמצעות מטא-טרנסקריפטומיקה סביבתית.

זכרו תמיד כי בעת ביצוע פרוצדורה זו, ה-mRNA מתפרק במהירות ו-RNAs נמצאים בכל מקום. לכן, נקטו באמצעי זהירות סטנדרטיים לעבודה בסביבה נקייה מ-ribonuclease ועבדו עם הדגימות במהירות המרבית. זהו כל הפרוצדורה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.