Name: וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: למדו שיטה לכימות התנהגות תנועתית ב-Drosophila melanogaster באמצעות מערכת מעקב וידאו ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת ניתוח מפורט של תנועת הזבובים ללא הרדמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט R01 GM54408 הוענק LC גריפית. ברצוננו להודות פרד וולף על כל העזרה שלו בעיצוב חדר מרובע שלנו בהקמת assay שלנו, פרנק מלו בחנות אוניברסיטת ברנדייס מכונה לבניית החדר שלנו, דן ולנטה וטים Lebestky לשיחות מועילות בנושאים ניתוח.

חלק 1: האכלה וניהול של זבובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זבובים צריכים להיות בוגרים בבקבוקים המכילים שמרים ללא מדיה סטנדרטי. אתה צריך כמויות גדולות של זבובים, כך חוצה צריך להגדיר בהתאם. זבובים צריכים להיות מבוגר אור של 12 שעות: מחזור חשוך במהירות של 25 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זבובים יש לאסוף מיד לאחר eclosion (1-3 ימים). זבובים יכול להיות עבד עם בשלב זה באמצעות מפזר פחמן דו חמצני, ויש מיון לתוך מבחנות המכילות מדיה autoclaved או ללא שמרים. אנו משתמשים רק זכרים, לאחסן 10 עד מבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לפחות יום או יומיים לאחר שימוש של פחמן דו חמצני לפני הפעלת ניסויים התנהגותיים. אנחנו רצים זבובים assay התנהגותיים שלנו 3-5 ימים לאחר ECLOSION. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחני תמיד צריך להיעשות בתוך החלון שעה באותו 2-3 זמן בכל יום, כדי למנוע בעיות קצב היממה. </li></ol> חלק 2: הקמת מערכת מעקב בסביבה מבוקרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניסויים נעשים בחדר סביבה אשר שומרת על טמפרטורה קבועה של 25 º C עם לחות 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מצלמת וידאו דיגיטלית על פני השטח שיירשמו (המצלמה פונה כלפי מטה). מאז תוכנת מעקב שלנו היא בניגוד מבוסס, אנו משעים את המצלמה מעל תיבת האור. רשומות קטעי וידאו המצלמה ישירות למחשב באמצעות חיבור Dell firewire. אנו משתמשים במצלמה שארפ וידאו דיגיטלי, התחברה למחשב של Dell עם Windows MovieMaker (גרסת Vista) לרכישת וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולסים האוויר תנוהל בפרוטוקול זה, אז מקור זרימת האוויר חייב להיות נוכח בחדר. באמצעות צינור גומי, לחבר את מקור האוויר מסנן פחם לסינון אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צינור גומי יותר, לחבר את הצד השני של פחמן המסנן בקבוק Erlenmeyer באמצעות פקק גומי חלול, ולמלא את הבקבוק עם כחצי סנטימטר מים. זה יהיה ללחלח את האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבקבוק צריך להיות גם אקדח, אשר יתחבר שסתום Y בצורת באמצעות צינור גומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סניף אחד של שסתום ה-Y צריך להיות מחובר flowmeter. הסניף השני אמור לספק אוויר לתא תנועה בכיכר. </li></ol> חלק 3: אספקת זבובים לחדר תנועה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר תנועה בכיכר מבוסס על העיצוב של וולף et al. 2002 1, עם תוספת של מגשי טיפה קטנה כדי למנוע זבובים מעופפים בתוך החדר. החדר צריך להיות מפורק, וכל הרכיבים יש לנגב ביסודיות למטה עם 70% אתנול ו מיובש לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה מיד לפני ביצוע assay התנהגות עלולה לפגוע בביצועים. כדי למנוע זאת, זבובים הם דפק בעדינות לתוך תא באמצעות משפך עם שקע קטן. כדי להפוך את פורקן בגודל הנכון, לצרף טיפ כחול פיפטה (עבור P1000) לסוף משפך. השתמש במספריים לחתוך את הקצה מאוד של קצה פיפטה לעשות פתיחת מספיק גדול בשביל להטיס לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקו העליון של החדר שלנו היא פיסה קטנה של פרספקס מאובטח על ידי ברגים בקצוות. כאשר את הברגים מוסרים, החורים יכול לשמש כדי לספק זבובים לתוך החדר. המיקום העליון פרספקס כך חור הבורג יושב ישירות על החדר הפנימי, במקום שבו בורג בדרך כלל יושבת. קחו מבחנה המכילה את הזבובים במקום זה הפוך על המשפך, אשר אמור אז להיות ממוקם לתוך החור בורג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תזיז את המשפך, כמו זה יכול לפגוע או לגרום נזק זבובים. במקום זאת, בעדינות המפץ חדר שלם, משפך וכל, עד זבובים כולם בתוך החדר. לדפוק זה צריך להיעשות על משטח עכבר לספוג את ההלם של מכה זו. כאשר נמצאים בתוך זבובים, להסיר את המשפך, מחדש במיקום העליון פרספקס על מיטות בורג. אז מחדש בורג העליון פרספקס למקומו. </li></ol> חלק 4: הפעלת Assay של תנועה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זבובים נטענים כמו שצריך, לתת להם להסתגל בחדר במשך 30 דקות. תקופת ההסתגלות אמורה להתקיים בסביבה מבוקרת (25 מעלות צלזיוס, לחות 70%), ובית הנבחרים צריך להיות ממוקם על גבי תיבת אור (שאמור להיות מופעל). כבה את האורות בחדר אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הסתגלות, מתג ה-Y שסתום במערכת זרימת אוויר כזה באוויר רק לזרום flowmeter. הפעל באוויר, כבש את האוויר עד למהירות הרצויה (4.0-6.0 L / min). אנו משתמשים בדרך כלל 5.0-5.5 ליטר / דקה, אבל בכל מהירות בטווח זה יעבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המהירות הרצויה מושגת, להחליף את שסתום ה-Y, כך האוויר זורם אל חדר תנועה. זה זמן אוויר הדופק במשך 15 שניות, ואז פתאום להפוך את האוויר מעל. כפי שאתה להפוך את האוויר מעל, לעבור את המצלמה כדי להקליט במצב. (חלק זה לוקח בפועל לעשות הכל בבת אחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את ההקלטה לאחר זמן הרצוי ולשמור. אנו רושמים 30 ניסויים השני 10 מסגרות לשנייה (לפחות 8 משפטים לכל גנוטיפ). </li></ol> חלק 5: ניתוח סרטי וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשיםתמונה דינמית ניתוח מערכות (דיאס) 3.2 תוכנה עבור ההצעה מעקב 2. כדי להשתמש בתוכנה זו, אנחנו הראשונים להמיר קטעי וידאו שלנו בתבנית קובץ AVI עם Quicktime 7.5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר הזבובים על בסיס לעומת זאת, אנו משתמשים &quot;Autotrace ידי סף&quot; פונקציה. אנחנו מכן להשתמש &quot;הפוך מן הנתיב Trace&quot; פונקציה לספרת אלה עקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי התפוקה במהירויות מיידי של זבוב אחד, אנו משתמשים &quot;Compute פרמטרים&quot; פונקציה כדי להפיק קובץ מסד הנתונים (דיאס ספציפי). שימוש בפונקציה זו, אנו גם חלקה את הנתונים באמצעות &quot;5,15,60,15,5&quot; חלון טיוקי החלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מידע זה outputted כקובץ מסד נתונים, אותו ניתן לפתוח ב-Microsoft Excel. אנו משתמשים תסריט Matlab כדי לקמפל את מהירויות מיידי בתוך להצטיין לחשב פרמטרים נוספים הדרושים להבנת הדינמיקה התנועה מבנה התקף. </li></ol> נציג תוצאות: איור 1 מציג עקבות נציג אורגניזמים סוג קנטון S בר (איור 1, פאנל משמאל) זבובים null עבור הגן dCASK אשר נוצרו על ידי מעבר בשני מחיקות חופפים גדול (DF (3R) x307 ו DF (3R) x313) (איור 1 , נכון פאנל). זבובים dCASK null בעבר הראו בעיות של תנועה באמצעות פרדיגמה של Buridan 3, ועל הפרדיגמה שלנו, לעומת קנטון S, הם מראים ירידה מאוד תנועה. אנחנו תמיד לרוץ אורגניזמים סוג בר הראשון לוודא כי התנאים התנהגות בטווח התקין ביום נתון. ראינו סטיות תקן התגובות% פחות מ 5 ימים של בדיקות. הבדלים אלה בדרך כלל ניתן לייחס בעיות עם פרמטרים של סביבה מבוקרת שלנו. <img src="/files/ftp_upload/1096/figure_1.png" alt="" width="600" height="298" /> באיור 1. דיאס שנוצר עקבות של שני S קנטון זבובים בר סוג (לעיל, משמאל) של תנועה מחסר Null dCASK זבובים שנוצר מחיקות חופפים (למעלה, מימין). עקבות מייצגים מה לראות קטעי וידאו מוקלטים. שני contrain עקבות תמונות 8-10 זבובים לרוץ במשך 30 שניות ב assay מעקב וידאו הבאים הדופק אוויר. <img src="/files/ftp_upload/1096/figure_2.png" alt="" width="600" height="438" /> איור 2. זבובים מסוג Wild נוהלו assay של תנועה (לעיל) בעקבות דופק אוויר (ברים סגול) וללא דופק האוויר (כחול). בכל הפרמטרים מחושב על ידי תוכנית הניתוח, לא היו הבדלים משמעותיים בין שני תנאים (נקבע עם התלמיד שני זנב t-test). זה מדגים כי בעקבות דופק אוויר, זבובים locomote בדרך כלל ההתקנה שלנו.

<ol><li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Analysis+of+Ethanol-Induced+Locomotor+Stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila.</a> J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).</li>
<li>Soll, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+computers+in+understanding+how+animal+cells+crawl%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cytology%22%5BJournal%5D)">The use of computers in understanding how animal cells crawl.</a> International review of cytology. 163, 43-104 (1995).</li>
<li>Martin, J. R., Ollo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Drosophila+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+%28Caki%29+is+localized+in+the+central+nervous+system+and+implicated+in+walking+speed%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed.</a> The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).</li>
<li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+Circadian+Clock+by+Social+Experience+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster.</a> Science. 298, 2010-2012 (2002).</li>
</ol>

ב ההתקנה שלנו, דופק אוויר חזק בינוני transiently עוצר את התנועה לעוף. כאשר הדופק האוויר נגמר, הזבובים משתחררים ממצב זה נייחים locomote בדרך כלל, כפי שמוצג באיור 2. כי זה דופק האוויר ביעילות מסנכרן תנועה של האוכלוסייה, אנחנו משתמשים בו כדי להתחיל את הניסוי, כדי שנוכל ללמוד גם את תחילתה של התנועה בעקבות גירוי שבירת המומנטום. Assay עם זאת, ניתן לעשות זאת ללא דופק אוויר מאז פרמטרים של תנועה בעקבות חניכה אינם מושפעים על ידי הדופק האוויר (איור 2). <p class="jove_content" style=";tex...

<table><tbody><tr><td>תא מרובע</td><td>כלי</td><td>בית מלאכה</td><td>לא רלוונטי</td><td>עיצוב מתוך Wolf &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2002&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>מצלמה</td><td>Sharp</td><td>ViewcamZ VL-23</td><td></td></tr><tr><td>מד ספיקה</td><td>כלי</td><td>Cole-Parmer</td><td>SY-32003-12</td><td></td></tr><tr><td>תיבת תאורה</td><td>כלי</td><td>DNASTAR</td><td>Seq-Easy</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פחם</td><td>כלי</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-744-37</td><td></td></tr><tr><td>DIAS 3.2</td><td>תוכנה</td><td>Soll technologies</td><td>לא רלוונטי</td><td>www.solltechnologies.com</td></tr></tbody></table>

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

זבובים לספק מודל חשוב ללימוד התנהגות מורכבת בשל שפע של כלים גנטיים לרשות החוקרים בתחום זה. לימוד התנהגות של תנועה ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; נשענת על היכולת להיות מסוגל לכמת שינויים בתנועה במהלך או בתגובה משימה מסוימת. מסיבה זו, ברזולוציה גבוהה מערכת מעקב וידאו, כמו זה אנו מתארים במאמר זה, הוא כלי בעל ערך למדידת תנועה בזמן אמת. פרוטוקול שלנו כרוכה בשימוש הדופק אוויר הראשונית לשבור את המומנטום זבובים, ואחריה תקופת הצילומים לשלושים השני חדר מרובע. תוכנית המעקב לאחר מכן נעשה שימוש כדי לחשב את מהירות מיידית של כל לטוס בתוך תא ב 10 במרווחים msec. תוכנת ניתוח אז זה הידור נתונים, יציאות מגוון רחב של פרמטרים כמו מהירות ממוצעת, מהירות מקסימלית, משך הזמן בתנועה, האצה וכו &#39;פרוטוקול זה יעסוק האכלה לניהול תקין של זבובים למשימות התנהגותי, טיפול זבובים ללא הרדמה או immobilization , הקמת סביבה מבוקרת, ולהפעיל את assay מתחילתו ועד סופו.

המחקר של התנהגות של תנועה מורכבת<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; תלוי היכולת לכמת שינויים בתנועה לטוס נתן. מאמר זה מדגים כיצד לעשות זאת באמצעות מערכת מעקב ברזולוציה גבוהה.

זבובים מהווים מודל חשוב לחקר התנהגות מורכבת בשל שפע הכלים הגנטיים העומדים לרשות חוקרים בתחום זה. חקר...

בבדיקת המעקב בווידאו, יש להעביר את הזבובים לתא תצפית מרובע ללא שימוש באנסטזיה. לשם כך, יש להצמיד משפך קטן לחורי הברגים בתא, כדי להפיל את הזבובים לתוכו. לאחר מכן, באמצעות משפך זה, אוטמים את חורי התא בעזרת ברגים, ומועבר פולס אוויר דרך פתחי האוורור כדי לעורר תנועה.מצלמת וידאו התלויה מעל התא לוכדת את התנועה ושולחת אותה למחשב, שבו נתיבי הזבובים מועקבים ומנותחים. שלום, אני ג'סטין סלוסון (Justin Slawson) ממעבדת גריפית (Griffith Lab) כאן במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ברנדייס (Brandeis University). היום נראה לכם פרוטוקול למעקב וידאו ברזולוציה גבוהה אחר תנועה.נשתמש בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור התנהגות לוקומטורית בזבובים בוגרים. לכן, בואו נתחיל. כדי להתחיל בניסוי, גדלו זבובים בבקבוקים המכילים מצע סטנדרטי ללא שמרים.פרוטוקול זה דורש מספר רב של זבובים, לכן יש להקים את ההכלאות בהתאם. יש לגדל את הזבובים במחזור של 12 שעות אור וחושך בטמפרטורה של 25 degrees Celsius. אסוף את הזבובים יום עד שלושה ימים לאחר ה-Aus; השתמש במפיץ פחמן דו-חמצני (carbon dioxide diffuser) כדי למיין את הזבובים למבחנות המכילות מצע ללא שמרים; מיין 10 זכרים לכל מבחנה.המתינו לפחות יום או יומיים לאחר השימוש בפחמן דו-חמצני לפני ביצוע ניסויי ההתנהגות. לאחר איסוף הזבובים ומינויים, ניתן להעביREM אותם למערכת המעקב בווידאו. ניסויי המעקב בוו

high-resolution-video-tracking-locomotion-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר כיצד לעקוב אחר זבובים ההולכים בחופשיות כדי להעריך את יכולת התנועה הכללית שלהם. הפרוטוקול המוצג מדגים את הגדרת הבדיקה וניתוח הנתונים באמצעות תוכנת מעקב וידאו.

מעקב אחר זבובים מהלכים בחופשיות: שיטה להערכת תנועה בדרוזופילה

תסיסנית שימושית בלומדת מניפולציות גנטיות או סביבתיות המשפיעות על התנהגויות כמו פעילות של תנועה ספונטנית. כאן אנו מתארים פרוטוקול אשר מנצל צגים עם קרניים אינפרא אדומות ותוכנות לניתוח נתונים לכמת פעילות של תנועה ספונטנית.

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכוש וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגרים תסיסנית ופנוטיפים מוטציה זחל מנקודת מבט לרוחב.

רכישת באיכות גבוהה וידאו דיגיטלי של דרוזופילה Behaviors הזחל ומבוגרים מנקודת מבט רוחבי

Flywalk מערכת מעקב האוטומטי משמש לכימות ברזולוציה גבוהה של מודרך ריח התנהגות בmelanogaster תסיסנית.

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשימוש ב-FLLIT, שיטת למידה מלאה אוטומטית של מכונה למעקב אחר תנועות של הרגליים באמצעות הזזת דרוסופילה מלאנוגסטר וחרקים אחרים. ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה כדי לכמת את המהלכים הליכה עדינים בהליכה בתנועות מסוג פראי זבובים, מוטציה זבובים ומודלים לטוס של ניוון נוירוסטיות.

מעקב אוטומטי לחלוטין ברגל באופן חופשי חרקים נעים באמצעות לימוד הרגל למידה פילוח ומעקב (FLLIT)

פרוטוקול זה מתאר כיצד להפוך תא תצפית התנהגות Drosophila מבוגר פשוט, וכיצד לצלם בהבחנה גבוהה / קטעי וידאו של המורפולוגיה או התנהגות של סוגים שונים של זבובי פירות בתא התצפית באמצעות שיטות פשוטות יחסית ובמחיר סביר.

מערכת הדמיה מתכווננת בחדות גבוהה למחקרים התנהגותיים של מבוגרים Drosophila

הפרוטוקול הנוכחי מעריך את הפעילות המוטורית של דרוזופילה על ידי מעקב וניתוח תנועת הזבובים בזירה בעבודת יד באמצעות תוכנת קוד פתוח פיג'י, התואמת לתוספים לפלח פיקסלים של כל פריים בהתבסס על הקלטת וידאו בחדות גבוהה כדי לחשב פרמטרים של מהירות, מרחק וכו '.

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

כאן, מוצג פרוטוקול להדמיה חיה ארוכת טווח של רגל הדרוזופילה בשלב הגולם, הכולל הסרה מלאה של הגולם. ניתן ליישם פרוטוקול זה גם על רקמות אחרות.

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

גזים שנראים לא מזיקים בלחץ אטמוספרי יכולים לגרום להתנהגויות כמו נרקוזה בתנאי לחץ גבוה. תאי לחץ היפרבריים קונבנציונליים יקרים ודורשים עבודה אינטנסיבית. מחקר זה מציג שיטה פשוטה וזולה לבחינת השפעות הזנון על Drosophila melanogaster בלחצים בינוניים מתחת ל-4 אטמוספירה.

אימות מערכת לחץ היפרברי עם הרדמה קסנון עבור דרוזופילה מלנגסטר

למדו שיטה לכימות התנהגות תנועתית ב-Drosophila melanogaster באמצעות מערכת מעקב וידאו ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת ניתוח מפורט של תנועת הזבובים ללא הרדמה.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

גלה סרטונים נוספים