Name: ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: למדו פרוטוקול לביות של תאים hematopoietic אל מח העצם באמצעות סימון תאים בצבע ומעקב אחרי הנדידה שלהם בחיות מקבלות. שיטה זו מאפשרת השוואת יעילות הביות בין אוכלוסיות תאים שונות ותורמת להבנת מנגנוני השתלת תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

פרוטוקול זה נבדק אופטימיזציה במעבדה של ד&quot;ר דוד Scadden. המימון ניתן על ידי מכון הסרטן דנה פרבר / החולים הכללי במסצ&#39;וסטס קלינית להמטולוגיה ואונקולוגיה תוכנית עמיתי.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מתחילים את הניסוי ביות על ידי מיצוי תאים שישמשו בניסוי. לצורך ניסוי זה הנוכחי אנו מעוניינים לגלות אם הביות של מוח העצם שלמה הגומחות בתוך העצמות הארוכות של חיות הנמען הוא שונה עבור תאים במח העצם המופק חיות WT כגון C57BL/6J (WT) לבין אלה מהונדס knockouts עבור קולטן Lysophosphatidic 1 (LPAR1) (KO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שנתחיל את הניסוי, אנו נאסוף את החומרים שאנו זקוקים לניסוי זה. במעבדה שלנו והניתוחים כל עכבר מתבצעות ברדס זרימה למינרית רקמות התרבות התאים במיוחד אם הם הולכים להיות הושתלו חיה הנמען במקום בשימוש לניתוח לשעבר vivo. אנחנו מתחילים על ידי הנחת יריעת כחול בתוך מכסה המנוע. אובייקטים אחרים הדרושים כוללים זוג מלקחיים וזוג מספריים חדים שהיו autoclaved, מטליות אזמל סטרילי ואלכוהול הפנויה. נצטרך PBS שונה וצלחת סטרילי 6 טוב, מרגמה, כחול העלי, 50cc עקף צינור חרוטי ומסנן הפנויה 70uM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מתחילים על ידי לקיחת אחד ואחד WT עכבר KO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים אלה מורדמים משאיפת CO 2 ואז טבול isopropranolol 70% למשך 5 שניות. פעולה זו מונעת זיהום של תאים בעלי עניין עם פרווה העכבר בידינו לא הוביל לכל פשרה בתשואה של תאים או תוצאות הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים הם גזור ואז בתורו בעזרת זוג מלקחיים ומספריים חדים. בדרך כלל אנו מתחילים עם העכבר WT כעניין של שגרה. חיתוך קטן נעשה עור הגחון של העכבר המכסה את הבטן ואת העור נמתח ואז באמצעות הידיים. העור מגיע מן הגפיים האחוריות בקלות. עצם הירך לבין השוקה המחולצים אז נזהר שלא לעקור את ראש עצם הירך כמו זה מכיל כמות גדולה של מח עצם. הגפיים העליונות מנותקים הגוף של החיה, פשוט על ידי הפעלת כוח משיכה אליהם תוך שמירה על הגוף נייח. זה מסיר את הגפיים העליונות כמקשה אחת. Humeri המחולצים אז מן הגפיים העליונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העצמות הוסרו ממוקמים שונה PBS אשר נוספה 6 צלחות היטב. השתנה PBS נעשית על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של סרום מומת חום שור עוברית ו 2 סמ&quot;ק של EDTA 0.5 M pH8. פתרון זה מסונן אז דרך 0.45 Nalgene UM לסנן יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה חיוני כדי התווית בארות בצלחת על מנת להיות מסוגל לזהות WT ועצמות KO כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פגרי העכבר יוסרו מסולק משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגיליון החדש ממוקם מכסה המנוע עצמות מנקים בעזרת אזמל חד פעמיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצמות לנקות ממוקמים עכבר אחת בכל פעם במכתש. שני מ&quot;ל שונה PBS מתווסף מרגמה ואת עצמות מרוסקות בעזרת העלי. חשוב שבר עצמות הראשון עם 10 קדימה ואחורה בתנועות של העלי ולאחר מכן לכתוש אותם עם תנועות סבובי מעגלית. בדרך כלל אני עושה 50 עם כיוון השעון, אז 50 תנועות נגד כיוון השעון וכך הלאה עד החומר שנשאר מרגמה הוא בצבע לבן ואת PBS שונה הוסיף החומר נשאר לבן או שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל סט של 50 תנועות מעגליות ריסוק, אנו מעבירים את הנוזל מתוך מרגמה אל UM 70 מסנן מונח על גבי צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. אל תשכחו להוסיף 2 מ&quot;ל PBS על המדוכה לאחר העברת כל לסינון. אתה לא רוצה לנסות לכתוש העצמות היבשות או להשאיר אותם להתייבש במשך פרק זמן כלשהו כמו זה יוביל אפופטוזיס של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החומר מרגמה הופך לבן, חומר במסנן מועבר מרגמה ואת ריסוק מתבצע שוב. הדבר מבטיח כי התאים לסנן אינם מבוזבזים. בדרך כלל זה לוקח אחת או שתי סדרות של תנועות סבובי חוזר שוב להכין את החומר הלבן מרגמה בצבע ובזמן החילוץ של תאים תושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון של צינור חרוטי הוא centrifuged עכשיו (יש לזכור לשמור את התאים מן WT וק.א. עכבר נפרדים. מכאן יהיה לך שני צינורות שונים (אחד עם תאים WT, שני תאים עם KO). צנטריפוגה בסל&quot;ד 1200 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant באמצעות טפטפות aspirator נפרד עבור כל צינור. הוסף 2 סמ&quot;ק של חיץ תמוגה ACK זה גלולה. זה חיץ תמוגה צריך להיות סטרילי. לדגור על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 סמ&quot;ק שונה של PBS על צינור אחד. קח 10 ul מהצינור כל טפטפת לתוך שתי בארות נפרד בצלחת 96 באר. מניחים את צינורות בצנטריפוגה ספין אותם 1200 סל&quot;ד במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם הצינורות הם ספינינג, להוסיף 30 ul של tryphan צבע כחול ו 60 ul שונה של PBS היטב בכל צלחת 96 היטב שנושאת את התאים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 ul מתערובת זו (נא ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה) כדי hemocytometer ולספור את התאים ארבעת הריבועים החיצוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תא מדגם לכל מ&quot;ל הוא מספר תאים נספר ובכך מחולק 4 ו multiplieד 100 על ידי 000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה תושלם, להסיר את הצינורות מן הצנטריפוגות ואת resuspend התאים PBS ללא מגנזיום, סידן, או גלוטמין L בריכוז של 20 מיליון תאים לכל מיליליטר. אתה צפוי להיות כ - 5 מ&quot;ל נפח של WT ו 5 מ&quot;ל של נפח עבור החיה KO. מכאן ואילך זה צעד אנחנו נהיה באמצעות PBS, לא שונה PBS עבור הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף צינור כל DiI, מכתים צבע התא, כדי להשיג ריכוז סופי של 5uM. וורטקס מיד למשך 10 שניות. לדגור על 37 מעלות למשך 10 דקות ו להימנע מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את צינורות עם PBS ואת הספין במשך 10 דקות ב 1200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התאים PBS ב 40 מיליון תאים לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען ul 500 1 לתוך מזרקים סמ&quot;ק עם מחט 27G (5 מזרקים עבור העכבר WT ו 5 מזרקים של עכברים KO). זה עשוי להיות נבון כדי להכין 6 מזרקים עבור כל קבוצה. לאחר אחד נוסף יכול לעזור כמו וריד הזנב זריקות שבו אנחנו הולכים לעשות עכשיו יכול להיות מסובך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את מזרקים בנייר על מנת לשמור על DiI מ מתפורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 500 UL של התערובת לתוך התא החי כל נמען; (5 עבור כל קבוצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים אלה צריכים להיות מוקרן עם 9 Gy הקרנה של 4-24 שעות לפני הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר ההזרקה, מח עצם הקציר מן הגפיים האחוריות של כל חיה הנמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך כפי שתואר לעיל עבור התורמים. Resuspend את התאים מן החי כל 1 סמ&quot;ק של PBS. השג לספור התא באמצעות hemacytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא cytometer LSR תזרים II מ BD או מכשיר מקביל. התוצאה יכולה להיות מבוטא באחוזים או המספר המוחלט של התאים במח העצם אשר ניתח חיובי DiI. </li></ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

ביות הוא תהליך שבו תאים במח העצם, כולל בתאי גזע, תאים ובתאים הבדיל, דרכם לתוך מח העצם, לאחר שהוחדר לתוך זרם הדם או מח עצם של עכברים חלל. כאשר ברור מן ההגדרה, מדען יכול לבחור ללמוד את הביות של בתאי גזע hematopoietic, ובתאים או תאים מובחנים שזוהו על ידי immunophenotyping ומבודדים על ידי מיון התא. בדרך כלל המדענים מזריקים תאים במח העצם מדולדל עבור סמנים השושלת והעשירו ומכאן עבור אבי ותאי גזע. המינון של התאים מוזרקים...

<table><tbody><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;rsquo;מלח פוספט רב-ערכי (PBS)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי של בקר סטרילי</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>EDTA בריכוז 0.5M (pH 8.0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Trypan Blue</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>בופר ליזיס ACK</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>איסוֹפְרוֹפְּרוֹלוֹל U.S.P.</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסה לסימון תאים Vybrant DiD</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Vybrant DiI לסומן תאים</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

ביות היא תופעה לפיה התאים המושתלים hematopoietic מסוגלים לנסוע ו נקלטים או להקים מגורים במח העצם. Chemomkines שונים הקולטנים מעורבים ביות של בתאי גזע hematopoietic. [1, 2] מאמר זה מתאר את פרוטוקול ביות הקלאסי שימוש במחקרים hematopoietic תא גזע. בדרך כלל זה כרוך לבודד את האוכלוסייה תא אשר הצרכים ביות להיחקר, מכתים אוכלוסייה זו עם צבע עניין הזרקת תאים אלה לתוך זרם הדם של חיה הנמען. החיה הנמען הקריב אז בזמן שנקבע מראש לאחר ההזרקה ואת מח העצם הערכה באחוז או מספר מוחלט של תאים אשר חיובי צבע של עניין. באחת תוכניות ניסיוניות הנפוצות ביותר, את היעילות ביות של תאים hematopoietic משתי חיות שונות גנטית (סוג חיה פרועה החוצה עקום המקביל) מושווה. מאמר זה מתאר את פרוטוקול תא hematopoietic ביות במסגרת כגון הניסוי.

מאמר זה מתאר פרוטוקול המשמש ללימוד ביות של תאים hematopoietic אל נישות שלהם במח העצם.

הומינג (Homing) הוא התופעה שבה תאים המטופויים מושתלים ומסוגלים לנדוד ולהשתקע או להקים מושבה במחול השריד (bone marrow). גורמים שונים...

הומינג (Homing) היא התופעה שבה תאי המטופואזיס מושתלים ומוצאים את דרכם אל מח העצם של המקבל. מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר ההומינג של תאי המטופואזיס לאזורים רלוונטיים במח העצם, באמצעות בידוד אוכלוסיית התאים הרצויה, צביעתה בצבע פלואורסצנטי והזרקתה למחזור הדם של חיית ניסוי מקבלת.לאחר פרק זמן מסוים, נקבע אחוז התאים החיוביים לצבע בבעל החיים. באמצעות שיטה זו, ניתן להשוות את יעילות ההגירה (homing efficiency) של תאים אלו משני בעלי חיים הנבדלים גנטית. שלום, שמי RHI Reen Yusef, ואני עמיתת פוסט-דוקטורט במעבדתו של ד"ר David Skadden במרכז לרפואה רגנרטיבית בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס ובמכון לתאי גזע של הרווארד.היום נדגים לכם פרוצדורה לבחינת ההגירה (homing) של תאי גזע המטופואטיים אל מחול לשוג הגרמי, המקום שבו הם שוכנים בדרך כלל. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדתנו כדי לבחון את ההבדלים בהגירה של תאי גזע המטופואטיים מעכברים שונים שעברו שינוי גנטי. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל את ניסוי ההומינג (homing), אנו מפיקים מח עצם הן מבעלי הטיפוס הפראי (WT) והן מבעלי נוק-אאוט (knockout) של קולטן חומצה ליזופוספטידית 1 או LPA R1. את כל שלבי הניתוח בעכברים יש לבצע תחת מcomme מזרים למינרי (laminar flow) בתא תרביות רקמה, במיוחד אם התאים מיועדים להשתלה בבעל חיים מקבל. לצורך הניתוח, הניחו תחילה מצע מגן בתחתית המזרים. לאחר מ

homing-of-hematopoietic-cells-to-the-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

שיטה ליצור ולחיות תמונות שונים מוח העצמות נישות בעכברים מוצג. בהתבסס על נישה תומכת שנוצרו על ידי תאים mesenchymal האדם, תוספת של תאים אנדותל האדם גורם להיווצרות של כלי אדם, ואילו תוספת של rhBMP-2 גורם להיווצרות של רקמת העצם של המוח האנושי.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

כאן אנו מתארים מערכת מיקרופיזיולוגית קלה ליישום, מתוקננת, המשקפת את המורכבות של מבנה ה-in vivo של מח העצם האנושי, ומספקת מודל רלוונטי לחקר עדין של מגוון רחב של אירועים נורמליים ופתולוגיים.

מודל תלת-ממדי של מח עצם אנושי לחקר הדינמיקה והאינטראקציות בין תאים מקומיים בהקשרים פיזיולוגיים או גידוליים

זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים במהלך ההתפתחות. מצאנו כי בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הן שנוצר הרחיב בשליה בתוך נישות microenvironmental ייחודי. כאן אנו מתארים ניסיוני בטכניקות נדרש בידוד להדמיה של HSCs את השליה העכבר.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

למדו פרוטוקול לביות של תאים hematopoietic אל מח העצם באמצעות סימון תאים בצבע ומעקב אחרי הנדידה שלהם בחיות מקבלות. שיטה זו מאפשרת השוואת יעילות הביות בין אוכלוסיות תאים שונות ותורמת להבנת מנגנוני השתלת תאים.

ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם

גלה סרטונים נוספים