Name: Microinjection של ביציות Xenopus Laevis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: למד מיקרו-הזרקה לביציות Xenopus laevis לחקר מנגנוני תחבורה גרעין-ציטופלזמה. שיטה זו משלבת מיקרוסקופיית אלקטרונים לדימוי מבנים תאיים ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים דוד Theilmann (פסיפיק Agri-Food Research Centre, Summerland, קולומביה הבריטית) למתן AcMNPV baculovirus ו לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), מייקל סמית הקרן לבריאות מחקר (MSFHR), ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) .

חלק 1: הכנת ביציות Xenopus עבור microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה קטנה (כ 2 ס&quot;מ) של השחלה laevis Xenopus לשפופרת 50 מ&quot;ל חרוטי המכיל 20 מ&quot;ל של תמיסת collagenase (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל collagenase בסידן ללא מלח שונה של בארת: mm 0.82 88 mM NaCl, 1 mM KCl, MgSO 4, 10 Hepes מ&quot;מ, pH 7.5). Collagenase משמש כדי להסיר את התאים זקיק אשר מקיפים את ביציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מצע שייקר ורוק אותו בעדינות (בכל סל&quot;ד 100) במשך שעה אחת. פעם זה משתנה עם המון שונים של collagenase. כך לאחר שעה אחת, לקחת דגימה קטנה של ביציות ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ לנתח. כראוי דה folliculated ביציות צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה, ועל זה צריך להיות קל להכניס מחט זכוכית לתוך הביצית. אם ביציות אינם מספיק דה folliculated, הם עזבו את הפתרון collagenase ובדק שוב כל חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ביציות שלוש פעמים (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mM MgSO 4, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 0.41 mM CaCl 2, 10 Hepes מ&quot;מ, pH 7.5) מלוחים שונה של בארת&#39;, ולהעבירם אל צלחת בקוטר 100 מ&quot;מ פטרי המכילות MBS פלוס 1% פניצילין / סטרפטומיצין. ביציות מוכנים כעת להיות microinjected. אם microinjection יבוצעו ביום אחר, בחנות ביציות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, בחר בוגרת השישי בשלב ביציות עבור microinjection. ביציות אלה הם גדולים, עם ניגודיות טובה בין האונה חיה שחורה האונה בצבע שמנת צמחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת VI ביציות בוגרות שלב לתוך צלחת microwell (Nunc, 10 נפח היטב μl). זה צריך להיעשות בזהירות, תוך שימוש pipettor 200 μl עם קצה פיפטה כי נחתך בסוף כדי לאפשר שאיבה של ביציות undisrupted. </li></ol> חלק 2: Microinjection של ביציות Xenopus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את המצע לייבא להיות microinjected ידי הוספת כמות קטנה של כחול bromphenol 1%, כדי לסייע להדמיה של microinjection. לדוגמה, נוסיף 1 μl של כחול bromphenol עד 10 μl של המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רצועה קטנה של Parafilm על צלחת בקוטר 100 מ&quot;מ פטרי, לוותר על ירידה של 5 μl של הפתרון להיות מוזרק על רצועת Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מחט הזריקה מכויל בעבר (מתקבל על ידי משיכת 6.6-μl micropipette דראמונד עם הזרק + פולר Matic) עם פתרון להיות מוזרק. לשם כך, microinjector מוגדר על מצב השאיפה. כדי לכייל את מחט הזריקה לעשות מסמן נקודה על המחט כל 0.5 מ&quot;מ, אשר מתאימות בהיקף של 50 nl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקה cytoplasmic, הכנס את קצה המחט לתוך הביצית בחצי הכדור צמחיים, קרוב מאוד בחצי הכדור החי, בזווית של כ 45 מעלות. הפעל את ההגדרה microinjector כדי microinject ו microinject כל הביצית עם 50 nl של המצע לייבא. מסמן נקודה על המחט משמשים כדי לפקח על כמות המצע כי כבר הזריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביציות מוזרק אל צלחת פטרי קטנה (35 מ&quot;מ קוטר) מלא MBS, ועל דגירה בטמפרטורת החדר למשך פרק הזמן הרצוי (נקודות זמן נבחרים כדי לאפשר תצפית של המצע לייבא הקשורים NPCs, זה קורה בין 10 ל 30 דקות חלבונים עבור וירוסים מועברים באופן פעיל לכיוון ה NPC, הפעם גם תלוי במקום ההזרקה ואת גודל של החלבון / וירוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדגירה תושלם, העברת ביציות כדי בקבוקון 4 מ&quot;ל כוס המכילה glutaraldehyde 2% MBS, ולתקן לילה בשעה 4 ° C. </li></ol> חלק 3: Dissection של ביציות Xenopus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את ביציות 3 פעמים עם MBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביציות כדי בצלחת פטרי קטן מלא חיץ מלח נמוכה (LSB: 1 mM KCl, 0.5 mM MgCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5). באמצעות מיקרוסקופ הניתוח, לנתח פינצטה, להסיר את מוט הצמחי מן הביצית כל אחד. זה שימושי כדי לייצב את הביצית להיות גזור עם זוג אחד פינצטה, בעוד זוג אחר משמש כמו מספריים כדי להסיר את מוט צמחיים. בשלב זה ניתן להעריך את ההצלחה של microinjection על ידי נוכחות של גוון כחול cytosol. הפרוטוקול הוא נמשך רק עבור ביציות שהיו microinjected בהצלחה. בנוסף, אם הדגימות הן להיות מוכן EM, שלב זה לנתיחה עושה את זה הרבה יותר קל למצוא את הגרעין כאשר זמירה ואת חתך את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את ביציות גזור שוב עם glutaraldehyde 2% LSB שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף את ביציות גזור שלוש פעמים עם LSB. </li></ol> חלק 4: הכנת הזריקה ביציות עבור Embedding ו-Thin חתך EM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביציות גזור לשקופית דיכאון. לשאוב כמה שיותר נוזלים כמו possible, ולאחר מכן במהירות (כך שהם לא לייבש) לכסות את ביציות גזור עם 2% נמוך ההיתוך agarose. בעוד agarose עדיין רך, להשתמש קצה פיפטה להפריד בין ביציות אחד מהשני, ועל מנת להבטיח כי כל הביצית היא עם הפנים כלפי מעלה או כלפי מטה (לא לצדדים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose כדי לחזק למשך כ -10 דקות. לאחר agarose מבצרת, השתמש סכין גילוח לחתוך את agarose לחתיכות קטנות, כל אחד המכיל ביצית גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את agarose-ביציות מוטבע בבקבוקון 4-ml זכוכית, שלאחר לתקן אותם עם 1% OSO 4 ב LSB שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם שלוש פעמים LSB. במידת הצורך, החנות מדגם ב 4 ° C במשך הלילה ולהמשיך את הפרוטוקול למחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברצף מייבשים את דגימות בסדרה עולה של אלכוהול (50, 70, ו 90% אתנול עבור 20 דקות כל אחד). זה ואחריו שני שינויים אתנול 100% במשך 15 דקות כל אחד. לבסוף מייבשים דגימות עם אצטון 100% במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדור דגימות בתערובת 01:01 של EPON (Fluka) ו אצטון למשך שעה אחת, ואחריה חדירה בתערובת 02:01 של EPON ו - אצטון במשך שעתיים, ולבסוף טהור EPON לפחות שש שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מקום תבניות הטבעה שטוח מלאים טריים טהור EPON. ביציות מכוונים בצורה כזאת שהצד של גרעין קרוב הזריקה - במקרה הזה את הצד של ביציות כי כבר גזור - יהיה מחולק הראשון. צעד זה מייעל את הסיכוי חזותי הייבוא ​​של המצע הנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לפלמר EPON יומיים בבית 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להמחיש את הדוגמאות, בלוקים הם גזוז מחולק מכן באמצעות ultramicrotome. מדורים מועברים על גבי רשתות EM, מוכתמים באמצעות הליך רגיל, ועל דמיינו עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. אנחנו לא יראה את החלק הזה של הפרוטוקול כפי שהוא הליך סטנדרטי EM. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: אם הפרוטוקול היה מוצלח, אז מעטפת הגרעין (NE) ו NPCs צריך להיות נראית בבירור EM micrographs. בהתאם הזריק את המצע ואת משך הזמן בין הזרקה קיבעון, המצע צריך להיות גלוי בפניו cytoplasmic של NPC, על NPC, או על הפנים הגרעינית של NPC. איור 1 מציג NE חתך עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרקו capsids של baculovirus AcMNPV, מודגרות ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות, ומעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. עגינה capsid בפניו cytoplasmic של NPC מצוין על ידי חץ לבן. לעומת זאת, איור 2 מראה NE חתך עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרק וירוס parvovirus דקה של עכברים (MVM), מודגרות בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות, מעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. באמצעות טכניקה זו, מצאנו כי MVM גורם לשיבושים של NE (כהן Panté, 2005). בסוגריים מצביעים על הפסקות NE. ראשי חץ הצבע על NPCs. Capsids MVM המשוערת הקשורים NE מסומנים על ידי חצים לבנים. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="איור 1" width="600" height="459" /> איור 1: מיקרוסקופ אלקטרונים של חתך-NE עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרקו capsids של baculovirus Ac MNPV, מודגרות ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות, ועובדו הטבעה וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. Capsids מסומנים על ידי חצים לבנים. בר קנה מידה: 100 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="איור 2" width="600" height="264" /> איור 2: מיקרוסקופ אלקטרונים של חתך-NE עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרק וירוס parvovirus דקה של עכברים (MVM), מודגרות בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות, מעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. בסוגריים מצביעים על הפסקות NE. Capsids MVM המשוערת הקשורים NE מסומנים על ידי חצים לבנים. בר קנה מידה: 100 ננומטר.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Microinjection של ביציות Xenopus בשילוב עם חתך דק EM הוא כלי יעיל לחקר התחבורה nucleocytoplasmic. מערכת זו נעשה שימוש כדי למפות שלבים ברורים של יבוא דרך NPC, עבור אינטראקציה דוגמה מצע לייבא גרעיני עם רכיבים מבניים של ה NPC כמו חוטים cytoplasmic וסל גרעיני (נבדקה על ידי Panté, 2006). הוא שימש גם כדי ללמוד את יבוא גרעיני של גרעיני שכפול וירוסים (Panté ו קאן, 2002; Rabe et al, 2003;. Panté כהן, 2005). <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt...

microinjection של ביציות xenopus laevis

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection של ביציות Xenopus laevis ואחריו במיקרוסקופ אלקטרונים חתך דק (EM) היא מערכת מצוינת לחקר התחבורה nucleocytoplasmic. בגלל גרעין גדול שלה צפיפות גבוהה של קומפלקסים נקבוביות הגרעין (NPCs), תחבורה גרעיני ניתן דמיינו בקלות הביצית Xenopus. תובנה הרבה לתוך המנגנונים של ייבוא, ייצוא גרעיני כבר צבר באמצעות השימוש במערכת זו (נבדקה על ידי Panté, 2006). בנוסף, השתמשנו microinjection של ביציות Xenopus לנתח את המסלולים לייבא גרעיני של וירוסים מספר לשכפל בגרעין המארח. כאן אנו מדגימים את microinjection cytoplasmic של ביציות Xenopus עם מצע לייבא גרעיני. אנחנו גם מראים הכנה של ביציות מוזרק להדמיה על ידי חתך דק EM, כולל לנתיחה, התייבשות, והטבעה של ביציות לתוך שרף אפוקסי הטבעה. לבסוף, אנו מספקים תוצאות נציג עבור ביציות, כי כבר microinjected עם capsid של nucleopolyhedrovirus baculovirus californica Autographa (AcMNPV) או דקה parvovirus וירוס של עכברים (MVM), ולדון יישומים פוטנציאליים של הטכניקה.

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ביציות עם מצע לייבא גרעיני, כמו גם הכנה של ביציות מוזרק להדמיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חתך דק.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

מיקרו-הזרקה לתאי ביضה של Xenopus laevis, ולאחריה מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) בשיטת חתכים דקים, מהווה מערכת מצוינת לחקר ה... נוקלאו-ציטופלזמי

מיקרו-הזרקה של ציטות (cytes) של Opus Lavu, ולאחריה מיקרוסקופיה אלקטרונית של חתכים דקים, מהווה מערכת מצוינת לחקר הטרנספורט הגרעין-ציטופלזמי. בניסוי זה, הציטות עוברות דפוליאציה באמצעות קולגנאז, וציטות בשלב 6 נבחרות ומונחות בצלחת עם מספר בארות. לאחר מכן, מזריקים לציטות במיקרו-הזרקה סובסטרט לייבוא גרעיני, לאחר דגירה של הציטות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לסובסטרט להיכנס לגרעין.התאים מקובעים ומופרדים. התאים המופרדים מוטמעים באגרוז נמוך התכה, מקובעים שוב באמצעות אוסמיום טטרוקסיד, מיובשים ומוטמעים שרף אפוקסי. הדגימות המוטמעות באפוקסי נחתכות באמצעות אולטרה-מיקרוטום, והחתכים מונחים על רשת דגימה של נחושת למיקרוסקופ אלקטרוני (EM).לאחר הצביעה, הפרוסות נבחנות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים חולף. היי, אני שרה כהן מהמעבדה של ד"ר נלי פאן במחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת בריטיש קולומביה. אני שלי או, גם אני ממעבדת פאן.היום נדגים לכם פרוצדורה להזרקה מיקרוסקופית (Microinjection) של Zenap Lavis Cytes. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור ייבוא גרעיני של מטענים כגון וירוסים. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל בניסוי, הניחו חתיכה קטנה של שחלה של Zenap Lavis, באורך של כ-שני סנטימטרים, לתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 20 מיליליטר של תמיסת קולגנאז. הקולגנאז מסיר את תאי הזקיק המקיפים את התאים, לאחר מכן הניחו את המבחנה על פלטפורמת ניעור ונערו בעדינות במהירות של 100 RPM למשך 30 דקות. זמן זה משתנה בהתאם לסדרות שונות של קולגנאז.לאחר שעה אחת, קחו דגימה קטנה של התאים ובחנו אותם תחת מיקרוסקופ סטריאו. תאים שעברו דפוליאציה בצורה תקינה צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה. הכניסו מחט זכוכית לתוך תא כדי לוודא שהיא מחליקה פנימה בקלות.אם התאים אינם מספיק דה-פוליאט (defoliated), השאירו אותם בתמיסת הקולגנאז ובדקו שוב מדי חמש דקות. ברגע שהתאים עברו דה-רגולציה מספקת, שטפו אותם שלוש פעמים במי מלח (saline) בשינוי, והעבירו אותם לצלח פטרי בקוטר 100 מילימטר המכיל MBS בתוספת 1% Penicillin streptomycin. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, בחרו תאים בשלב בגרות ששי עבור מיקרו-הזרקה.תאים אלו הם גדולים עם ניגודיות טובה בין ההמיספירה החיצונית (animal hemisphere) השחורה לבין ההמיספירה הצמחית (vegetal hemisphere) בעלת גוון קרמי. העבירו את התאים הבשלים משלב 6 לתוך צלחת ריבוי בארות. לשם כך, השתמשו בפיפטור של 200 microliter עם טיפ של פיפטה שקצווא חתוך כדי לאפשר שאיבה של התאים ללא הפרעה, והעבירו בזהירות את התאים אל תוך הצלחת.אנו משתמשים בצלחת ללא מיקרו-בארים עם נפח באר של 10 µL. אתרי ה-EO מוכנים כעת להזרקה מיקרוסקופית. הכין את תת-המצע להזרקה על ידי הוספת 1 µL של 1% brom phenol blue ל-10 µL של תת-המצע. צבע ה-brom phenol blue מאפשר ויזואליזציה של ההזרקה המיקרוסקופית.לאחר מכן, הניחו פס صغير של פאראפורם (paraform) על צלחת פטרי בעלת קוטר של 100 millimeter וטפטפו נטף של 5 µL מתמיס ההזרקה על פס הפאראפורם. כעת, הכינו מחט הזרקה על ידי משיכת מיקרו-פיפטה של Drummond בנפח של 6.6 µL באמצעות Matt Puller. כיילו את מחט ההזרקה על ידי סימון נקודות על המחט בכל 0.5 millimeters, מה שמתאים לנפח של 50 nanoliters. הגדירו את המיקרו-אינג'קטור למצב שאיבה (aspiration) ומלאו את המחט בתמיס ההזרקה להזרקה ציטופלזמית.החדירו את קצה המחט אל תוך cyte בהמיספירה הצמחית (vegetal hemisphere), קרוב מאוד להמיספירה החיי zwierית (animal hemisphere), בזווית של כ-45 מעלות. לאחר מכן, העבירו את הגדרת המיקרו-מזרק למצב הזרקה (micro inject) והזריקו לכל cyte‏ 50 nanoliters של תסבסב ייבוא (import substrate). עקבו אחר סימני הנקודות על המחט כדי לנטר את כמות התסבסב שהוזרקה עם השלמת ההזרקות.העבירו את התאים לצחנית פטרי בקוטר 35 מילימטר מלאה ב-MBS. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך פרק הזמן הרצוי. בחרו נקודות זמן המאפשרות תצפית על תסבסב הייבוא המקושר לקומפלקסים של נקבי הגרעין או NPCs.בדרך כלל אנו משתמשים בנקודות זמן שבין 10 ל-30 דקות עבור חלבונים ונגיפים המועברים באופן פעיל לעבר ה-NPC. נקודות זמן אלו תלויות גם באתר ההזרקה ובגודל החלבון או הנגיף. עם השלמת הדגירה, העבירו את התאים לבקבוק זכוכית של ארבעה מיליליטר המכיל 2% glutaraldehyde ב-MBS וקבעו אותם למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-MBS, וכעת ניתן להתחיל בביצוע הדיסקציה לתאים.העבירו את התאים לצלוחית פטרי קטנה מלאה בבופר בעל ריכוז מלח נמוך. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה ופינצטות דיסקציה, הסירו את הקוטב הצמחי (vegetable pole) מכל אוציט. מומלץ לייצב את האוציט עם זוג פינצטות אחד בזמן שזוג השני משמש כמיספריים להסרת הקוטב הצמחי; שלב דיסקציה זה מקל משמעותית על איתור הגרעין בעת קיצוץ וחיתוך הדגימות עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית.בשלב זה, נוכחות של גוון כחול בציטוסול מעידה על מיקרו-הזרקה מוצלחת; יש להשליך תאים שלא עברו מיקרו-הזרקה בהצלחה. לאחר מכן, קבעו שוב את התאים המפוצלים עם 2% glutaraldehyde ב-LSB למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים המפוצלים שלוש פעמים עם LSB. לאחר שטיפת התאים, ניתן להכין את התאים המוזרקים להטמעה ולחיתוך דקים ב-em.העבירו את הביציות המוחדרות לפסלדת שקועה (depression slide), שאבו כמה שיותר מהנוזל, ופעלו במהירות כדי למנוע מהן להתייבש. כסו את התאים המוחדרים באגרוז (agarose) בריכוז 2% בעל נקודת התכה נמוכה, בעוד האגרוז עדיין רך. השתמשו בקצה פפטה כדי להפריד בין התאים ולהבטיח שכל תא פונה כלפי מעלה או כלפי מטה, ולא הצידה.המתינו כ-10 דקות עד שהאגרוס (agros) יתגבש. לאחר שהאגרוס התגבש, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את הארוס (aros) לחתיכות קטנות, כאשר כל חתיכה מכילה תא (cyte) אחד מנותח. לאחר מכן, העבירו את התאים המוטמעים בארוס למבחנה מזכוכית בנפח ארבעה מיליליטר, ובאמצעות ערבב סיבובי, קבעו אותם עם 1% osmium tetroxide ב-LSB למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר קיבוע למשך שעה אחת, שטפו את הדגימה שלוש פעמים ב-LSB במידת הצורך. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה והמשיכו בפרוטוקול למחרת. בצעו דהידרטציה רצופית לדגימות בתוך אתנול בריכוזים של 50%, 70% ו-90% למשך 20 דקות בכל שלב, ולאחר מכן בצעו דהידרטציה פעמיים באתנול 100% למשך 15 דקות בכל פעם.לבסוף, ייבשו את הדגימות ב-100% acetone למשך 15 דקות. לאחר השלמת שלבי הייבוש, חדרהו את הדגימות בתערובת שווה של epon, flua ו-acetone למשך שעה אחת, לאחר מכן חדרהו בתערובת של epon ו-acetone ביחס של שתיים לאחת למשך שעתיים, ולבסוף ב-epon טהור למשך שש שעות לפחות. עם השלמת שלב החדירה האחרון, מקמו את הדגימות בתבניות הטמעה שטוחות מלאות ב-epon טהור וטרי.כוון את התאים כך שהצד של הגרעין הקרוב יותר לאתר ההזרקה ייחתך תחילה. במקרה זה, הצד של התאים שבו בוצע הדיסקציה ייחתך ראשון; שלב זה ממקסם את הסיכוי להדמיה של ייבוא הסובסטרט הנבחר.לאחר שהתאים מכוונים כראוי, פולמריזציה את ה-epon למשך יומיים ב-60 °C. לאחר שלב הפולמריזציה, השג חתכים בעובי 50 nanometer של הדגימות הטמיעות ב-epoxy באמצעות אולטרה-מיקרוטום. אסוף את החתכים על גבי רשת דגימה של נחושת ל-em, צבע את הדגימות ודמיין אותן תחת מיקרוסקופ אלקטרוני חודר (transmission electron microscope).אם הפרוטוקול הצליח, אזי המעטפת הגרעינית ו-NPCs צריכים להיות גלויים בבירור במיקרוגרפים של em. בהתאם לסובסטרט שהוזרק ולפרק הזמן שחלף בין ההזרקה לקיבוע, הסובסטרט צריך להיות גלוי בפני הציתופלזמי של ה-NPC ב-NPC או בפנים הגרעיני של ה-NPC. תוצאה מייצגת זו מראה חתך רוחבי של מעטפת גרעינית עם ציטופלזמה וגרעין סמוכים מתא zenap שהוזרקו לו קפסידים של נגיף vao.חצי-חיצים A-C-M-N-P-V מצביעים על NPCs, וחץ לבן מצביע על קפסיד הנעגן לפני הפנים הציטופלזמי של NPC. לעומת זאת, איור זה מציג חתך רוחבי של מעטפת הגרעין עם ציטופלזמה וגרעין סמוכים מאוציט zenap שהוזרק בו נגיף הפרוו של עכברים. באמצעות טכניקה זו, מצאנו כי MVM גורם להפרעות במעטפת הגרעין.סוגריים מציינים קרעים במעטפת הגרעין. חצי-חצים מצביעים על NPCs, וקפסידי MVM משוערים הקשורים למעטפת הגרעין מסומנים בחצים לבנים. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע מיקרו-הזרקה וניתוח של xap levu cytes.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי קיימים הבדלים בין סדרות שונות (lots) של קולגנאז. לכן, יש לבחון את הקולגנאז בקפידה כדי לקבוע את הזמן האופטימלי להסרת העלים (defoliation). כמו כן, לאחר שלב הסרת העלים ושטיפת ה-MBS, ניתן לשמור את התאים בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך עד שבוע לפני המיקרו-הזרקה.לבסוף, הקפידו תמיד להחזיק את הדגימות שלכם על קרח ואל תתנו להן להתייבש. הן חייבות להיות טבולות לחלוטין במהלך כל שלבי ההתייבשות והחדירה. וזהו.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

בקרת סינתזת חלבונים מתרחשת בעיקר בשלב התחלת התרגום, ליקויים בו קשורים להפרעות מגוונות. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה שלהם, תיארנו כאן פרוטוקול המשתמש בביציות Xenopus laevis המעריך את התרגום של תעתיק mos בנוכחות מוטציה של גורם התחלת התרגום eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במפות גורל ועוקבי שושלת כדי למקד זריקות לבלסטומרים בודדים המולידים כליה של עוברי Xenopus laevis.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

מתוארים נהלים אופטימליים לבידוד זקיקים בודדים, מיקרו-הזרקות RNA ציטופלזמיות, הסרת שכבות התאים הסובבות וביטוי חלבון בביציות Xenopus. בנוסף, מוצגת שיטה פשוטה לשינויי תמיסה מהירים בניסויים אלקטרופיזיולוגיים עם תעלות יונים מגודרות ליגנד.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

למד מיקרו-הזרקה לביציות Xenopus laevis לחקר מנגנוני תחבורה גרעין-ציטופלזמה. שיטה זו משלבת מיקרוסקופיית אלקטרונים לדימוי מבנים תאיים ברזולוציה גבוהה.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

גלה סרטונים נוספים