Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

הליך זה מתחיל בהכנת מורפו ו-mRNA כובע מתומלל במבחנה. מיקרו פיפטה ממולאת על ידי סיפון התמיסה המכילה מורפו ולאחר מכן נפח ההזרקה מכויל באמצעות מיקרומטר שלב תא אחד. לאחר מכן נאספים עוברי דג הזברה ומסודרים בתא מיקרו-הזרקה להזרקות מיקרו חלמון.

תמיסת עבודה מוזרקת לחלמון ממש מתחת לתא ותנועות ציטופלזמיות משמשות לנשיאת התמיסה להזרקות מיקרו תאים. יש להזריק את התמיסה לציטופלזמה של התא לאחר הזריקות. לדגור על העוברים ב-28.5 מעלות צלזיוס ב-E שלוש מדיום ולתת ציון לפנוטיפים מעניינים בשלבים הבאים.

היי, אני שילה יואן מהמעבדה, הבן של ד"ר סשה והמחלקה לגנטיקה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל. היום נדגים טכניקת מיקרו-הזרקה חזקה לביצוע ביטוי יתר של mRNA ומחקרי נוקלאוטידים של מורפו אוליגו בדג זברה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקידו של S cilium במחלות כליה ציסטיות.

אז בואו נתחיל. גישה רבת עוצמה אחת למחקרי תפקוד גנים היא הזרקת מיקרו במבחנה RNA מכוסה בעוברי דגי זברה. בהדגמה זו, נזריק מיקרו תעתיק מתויג EGFP ונשתמש בביטוי GFP חי של עובר שלם כקריאה גלויה להזרקה מוצלחת.

ראשית, נבצע תגובת שעתוק RNA בכובע מבחנה בתמליל המעניין שלך. במעבדה שלנו, אנו מכניסים באופן שגרתי A-C-D-N-A מעניין למחשב אישי שני פלוס וקטור ומבצעים תגובת סינתזה במבחנה של כמויות גדולות של RNA מכוסה באמצעות ערכת M message M Machine SP Six. לאחר מכן, נטהר את דגימת ה-RNA על ידי העברתה דרך ערכת המיני הקלה של RN או על ידי מיצוי פנול כלורופורם ומשקעי איזופרופנול.

קבעו בזהירות את ריכוז תכשיר ה-RNA ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש ביום ההזרקה. הפשירו קלות את מערבולת דגימת ה-RNA וסובבו לזמן קצר. כעת הכינו תמיסת עבודה עם מים סטריליים וריכוז סופי של 0.025 עד 0.05% פנול אדום, פנול אדום משמש כסמן גלוי להזרקת התמיסה לעובר.

כאן נכין פיתרון עבודה של 100 ננוגרם למיקרוליטר EGFP mRNA עם 0.05% פנול אדום. לבסוף, שמור את דגימת העבודה על קרח והחזיר את מלאי ה-RNA למינוס 80 מעלות צלזיוס. המשך להכנת המורפו כשהוא מוכן להזריק דגימה זו.

אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס של מורינו נמצאים בשימוש נרחב לשינוי ביטוי גנים על ידי חסימת תרגום של חלבון ממוקד או על ידי שינוי prem NA. שחבור מורפוס בדגי הזברה משמש ככלי גנטי הפוך רב עוצמה על ידי הפלת תפקוד הגנים. כאן נזריק מיקרו אוליגו מורף המכוון לאתר ההתחלה התרגומי של pkd two. אנו משתמשים באופן שגרתי ב-300 M של אוליגו מורף, שתוכנן במיוחד עבור גן מעניין המתקבל מ-gene tools LLC.

לאחר מכן אנו מוסיפים 100 מיקרוליטר מים סטריליים כדי ליצור תמיסת מלאי של שלושה מילי-מולרים ולאחר מכן מחסנים את התמיסה ומאחסנים במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לשימוש ביום ההזרקה. אנו מחממים את תמיסת המורינו בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן אנו מצננים את התמיסה על קרח מיד ומסתובבים בקצרהשלב שלב זה מנטרל את כל המבנים המשניים באוליגו ומבטיח שהתמיסה מסיסה לחלוטין.

לאחר מכן, נכין תמיסת עבודה על ידי דילול תמיסת המורפו במים סטריליים וריכוז סופי של 0.025 עד 0.05% אדום פינאלי. בהדגמה זו, נכין פתרון עבודה של 0.5 מילי-מולרי PKD שני מורינו עם 0.05% פנול אדום. שמור את תמיסת העבודה בטמפרטורת החדר והמשך למילוי מיקרו פיפטה כאשר אתה מוכן להזריק דגימה זו.

כדי להתחיל, נצטרך לייצר מיקרו פיפטות שישמשו להזרקות. זה נעשה על ידי חימום ומשיכה של צינורות נימי זכוכית סיליקט BOS במכשיר קוטבי מיקרו פיפטה. לאחר משיכת המחטים, הן נשמרות בצלחת פטרי על גבי כמות קטנה של חימר או סרט דבק.

לאחר מכן, נכין צלחות תא מיקרו-הזרקה על ידי יציקת 1.5%aros ב-XE אחד שלוש צלחות בינוניות יצוקות בשקתות בצורת טריז. זה ישמש כשיטה קלה להחזקת העוברים במהלך ההזרקה. לאחר מכן נותנים ללוחות תא האגרו להתמצק ומאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לשימוש.

כדי להתחיל למלא את המיקרו פיפטה. חתכו את הקצה הדיסטלי בעזרת מלקחיים או סכין גילוח כירורגי כדי ליצור פתח שנראה רק תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 50. לאחר מכן, הניחו שני מיקרוליטר של תמיסת העבודה שלכם.

כטיפה על החלקת כיסוי, חבר את החלק האחורי של מיקרו פיפטה למזרק של חמישה מיליליטר המצויד בצינורות על מחט היפודרמית וטבל מעט את הקצה הדיסטלי של המיקרו פיפטה לתוך טיפת תמיסת העבודה שלך. הקפד לא לשבור את קצה המיקרו פיפטה. שאב את תמיסת העבודה דרך הקצה הדיסטלי של המיקרו פיפטה על ידי משיכת הבוכנה של המזרק.

לאחר מכן, נכייל את נפח הזרקת המיקרו פיפטה. הנח טיפת שמן מינרלי על שקופית מיקרומטר והפעל את אספקת החשמל והאוויר למנגנון מזרק המיקרו דופק הלחץ. לאחר מכן, חבר את המיקרו פיפטה למחזיק המיקרו פיפטה של מנגנון המיקרו מזרק.

מזרק המיקרו מווסת לחץ והפריקה מופעלת על ידי לחיצה על דוושת כף הרגל מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. בדוק את נפח ההזרקה באמצעות מזרק המיקרו כדי להניח טיפה של תמיסת העבודה שלך על שמן המיקרומטר. מדוד את קוטר הטיפה כשהיא צפה ככדור על גבי השמן.

התאם את משך ולחץ ההזרקה כדי לכייל בזהירות את נפח ההזרקה שלך. שלב זה מסייע בשחזור ניסוי הזרקת המיקרו. בהדגמה זו, כל הזרקות המיקרו יבוצעו בקוטר טיפה של 0.15 מילימטרים.

לבסוף, לאחר כיול נפח ההזרקה שלך, השתמש בכפתור האחיזה במזרק המיקרו כדי למנוע מילוי אחורי ודליפה של המיקרו פיפט. עכשיו הגיע הזמן להכין את עוברי דג הזברה. דג הזברה יזדווג באופן אקראי, בשעות הראשונות של כל בוקר כדי להתחיל את ההכנה, יאסוף עוברים בשלב התא האחד ויניח אותם במדיום XE אחד שלושה.

בעזרת פיפטת העברה של שלושה מיליליטר, סדרו את העוברים לאורך השקתות בצורת טריז בלוחות תא המיקרו-הזרקה. הסר את המדיום כך שהעוברים יהיו רדודים, שקועים ולא מוצפים. שלב זה מסייע ביישוב העוברים לתחתית השקתות וכן בחדירת הקוריון על ידי המיקרו פיפטה.

עכשיו נתחיל בזריקות. ראשית, נבצע מניפולציות על העוברים עם המיקרו-פיפטה כך שהציטופלזמה של העובר בשלב התא האחד תהיה גלויה תחת המיקרוסקופ המנתח. הקפד לא לשבור את קצה המיקרו פיפטה, לחדור לקוריון ולאחר מכן לחלמון עם המיקרו פיפטה על מנת להזריק לעובר.

בהדגמה זו, נזריק תחילה מיקרו לחלמון ישירות מתחת לתא ונאפשר לציטופלזמה ולדיפוזיה להביא את תמיסת העבודה לתא. זרימה זו נראית לעין בגלל הפנול האדום שנוסף לתמיסת העבודה. מכיוון שמדובר בעובר חד תאי, ניתן להזריק אותו ביד חופשית או עם מניפולטור.

נדגים גם הזרקה ישירה לציטופלזמה של התא. מיקרו-הזרקה ישירה לתא היא חזקה יותר, אך גוזלת זמן מכיוון שנדרשים אוריינטציה נכונה של העובר וטכניקת מיקרו-הזרקה. מכיוון שקרום התא קפדני יותר מקרום החלמון, לעתים קרובות מהיר יותר להיכנס למיקרו פיפטה דרך החלמון כדי להגיע לתא.

ציטופלזמה המכוונת את מוט החיה לתחתית השוקת ועבודה בידיים יציבות עשויה לסייע בשיטת הזרקה זו. לאחר הזרקת מיקרו, הכניסו את העוברים לצלחת פטרי עם E 3 מדיום ודגרו אותם בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס להתפתחות תקינה. במהלך השעות והימים הבאים של התפתחות העובר, התבונן בעוברים עבור הפנוטיפים המעניינים שלך.

כדי לאמת את הצלחת המיקרו-הזרקה, נעקוב אחר ביטוי ה-GFP בעוברים המתפתחים החל משלב המגן על ידי ביטוי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של עובר שלם in vivo של המבנה חזק ביותר במהלך האירועים המוקדמים של התפתחות העובר ולעתים קרובות יפחת במהלך ההתפתחות. מכיוון שה-RNA המוזרק מתפרק בהדרגה ותלוי ביציבות החלבון המתבטא. בהתבסס על תוצאות שפורסמו בעבר, אנו מצפים שה-PKD שני מורפיום יחקה את עקמומיות ציר הגוף הגבי כפי שנמצא ב-PKD שני דגי זברה מוטנטיים ומציג ציסטות בכליות כיומיים עד שלושה לאחר ההפריה.

זה עתה הראינו לך טכניקת מיקרו-הזרקה חזקה לביצוע ביטוי יתר של mRNA ומחקרי הפלת גן מורפו אוליגונוקלאוטידים בדגי זברה בעת ביצוע הליך זה, זכור שזה חשוב. יש להזריק ביד יציבה. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.