Name: Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: למד טכניקת מיקרו-הזרקה לביטוי יתר של mRNA ונוק-דאון גנים באמצעות אוליגונוקלאוטידים מורפולינו בעוברי דג הזברה Danio rerio. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד גנים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH ו PKD יסוד ZS. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי ייל מרכז משאבים בעלי חיים (YARC) ו Animal Care מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) הנחיות.

חלק 1: הכנת micropipettes, קאמרית צלחות microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק micropipettes ידי חימום ומושכים צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי (World Precision מכשירים, Inc, 1B100-4) במכשיר חולץ micropipette (סאטר מכשירים בע&quot;מ, Flaming / בראון P-97). חנות בצלחת פטרי על גבי כמות קטנה של חומר או דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים agarose 1.5% (אמריקאי Bioanlytical, Inc, AB00972-00500) ב 1x צלחות בינוני E3 יצוק עם בצורת טריז שקתות שישמש שיטה קלה לקיום עוברים במהלך הזריקה (כפי שמתואר בספר &quot;דג הזברה&quot;) 1. תנו קאמרית צלחות אגר לחזק לפני השימוש ולאחסן ב 4 º C. </li></ol> חלק 2: עריכת RNA גישה אחת חזקה ללימודי תפקוד הגן היא microinject ב-RNA במבחנה כתרים עיבד עוברי דג הזברה. RNA כתרים מתנהג בדומה mRNAs אוקריוטים מצאו in vivo בשל נוכחותם של אנלוגי CAP. החוקרים דג הזברה שגרתי לנצל בשיטה זו כדי overexpress או misexpress הגן העניין שלהם. בהפגנה זו, אנו microinject תמליל EGFP-tagged ולהשתמש לחיות כולו עובר GFP ביטוי כמו readout גלוי עבור זריקה מוצלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בתגובה במבחנה תעתיק הרנ&quot;א CAP על תמליל העניין שלך. במעבדה שלנו, אנחנו באופן קבוע להוסיף cDNA עניין לתוך וקטור pCS2 + ולבצע בתגובה סינתזה במבחנה של כמויות גדולות של RNA כתרים באמצעות mMachine mMessage SP6 Kit (Ambion, Inc, AM1340). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את דגימת רנ&quot;א ידי הפעלת אותו באמצעות ערכת מיני RNeasy (Qiagen, Inc, 74104) או על ידי פנול: מיצוי כלורופורם משקעים isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקבוע את הריכוז של הכנת RNA ולאחסן ב -80 º C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הזריקה, ההפשרה מערבולת, RNA מדגם קלות ספין למטה בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון לעבוד עם מים סטריליים וריכוז הסופי של 0.025 - 0.050% פנול אדום (סיגמא אולדריץ ושות&#39;, P0290). פנול אדום משמש כסמן גלוי עבור הזרקה של הפתרון לתוך העובר. במאמר זה, נכין פתרון העבודה של ה-mRNA ng / UL 100 EGFP עם פנול אדום 0.050%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מדגם עובדים על קרח מניות RNA לחזור -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חלק 4 כאשר מוכן להזרים מדגם זה. </li></ol> חלק 3: הכנת morpholino Morpholino מולקולות אנטיסנס הן בשימוש נרחב לשנות ביטוי גנים על ידי חסימת תרגום של חלבון ממוקד או על ידי שינוי טרום mRNA splicing 2,3. Morpholinos של דג הזברה משמשים כלי רב עוצמה גנטיקה הפוכה על ידי דריסה תפקוד הגן. במאמר זה, אנו microinject אוליגו morpholino ממוקדות לאתר החניכה translational של pkd2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &quot;). בהתבסס על העבודה שהוקמו קודם לכן, אנו מצפים העוברים מוזרק אל phenotypically לחקות pkd2 4 דגים מוטנטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו באופן שגרתי כדי 300 nmol של אוליגו morpholino שתוכננו במיוחד עבור הגן של עניין מתוך כלים ג&#39;ין, LLC (Philomath, OR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים סטריליים 100 UL לעשות 3 מניות פתרון מ&quot;מ. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הזריקה, חום הפתרון morpholino על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הצמד מגניב על קרח מיד ספין בקצרה. צעד זה denatures כל המבנים משני אוליגו ומבטיח כי הפתרון הוא solubilized לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד על ידי דילול פתרון morpholino במים סטריליים ריכוז סופי של 0.025 - 0.050% פנול אדום. בהפגנה זו, נהיה הכנת פתרון עבודה של 0.50 mM pkd2 morpholino עם פנול אדום 0.050%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לעבוד פתרון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חלק 4 כאשר מוכן להזרים מדגם זה .---- </li></ol> חלק 4: מילוי micropipette עם פתרון העבודה שלך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קצה דיסטלי של micropipette עם מלקחיים או ניתוח בסכין גילוח כדי ליצור הפתיחה כי הוא גלוי רק תחת מיקרוסקופ לנתח (ניקון מכשירים, Inc, SM2645) בהגדלה של 50X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 UL של פתרון העבודה שלך כמו ירידה על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את החלק האחורי של micropipette כדי מזרק 5 מ&quot;ל מצויד בצינור על מחט המזרק ואת מעט להטביע את קצה דיסטלי של micropipette לתוך ירידה של הפתרון שלך עובד. תשמרי על עצמך לא לשבור את קצה micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון עובד עד סוף דיסטלי של micropipette על ידי משיכת על הבוכנה של המזרק. </li></ol> חלק 5: כיול נפח הזרקה micropipette <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה של שמן מינרלי (American Bioanalytical, Inc, AB00921-00025) בשקופית מיקרומטר (Fiשר, 12-561-SM1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הכוח ואת אספקת אוויר בלחץ פעמו מיקרו מנגנון ההזרקה (World Precision מכשירים בע&quot;מ, PV830). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את micropipette לבעל micropipette המנגנון מיקרו ההזרקה. מזרק מיקרו הוא הלחץ מוסדר הפרשות מופעלים על ידי לחיצה על דוושת רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, לבדוק את עוצמת הזריקה באמצעות מזרק מיקרו למקום ירידה של פתרון העבודה שלך על הנפט מיקרומטר. מדוד את הקוטר של ירידה כפי שהוא מרחף כמו כדור על גבי השמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את משך הלחץ של זריקה כדי לכייל את עוצמת הקול בזהירות של זריקה. צעד זה מסייע שחזור הניסוי microinjection. בהפגנה זו, microinjections כל ייעשה בקוטר ירידה של 0.15 מ&quot;מ (כ 1.76 NL בנפח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע נפח הזרקה שלך כבר מכויל, השתמש כפתור &quot;החזק&quot; על מיקרו ההזרקה כדי למנוע דליפה של למלא את משבצות ו micropipette. </li></ol> חלק 6: הכנת עוברי דג הזברה מופרית עבור microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה רצון להזדווג באופן אקראי בשעות הראשונות של בוקר. איסוף עוברים בשלב 1-התא למקם אותם בינוני 1x E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet 3 מ&quot;ל ההעברה (בקטון דיקינסון labware, 357,524), לסדר את העוברים לאורך בצורת טריז שקתות של צלחות קאמרית microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום, כך עוברים הם שקועים שטחית ולא מוצף. צעד זה מסייע ליישוב עוברים לחלק התחתון של שקתות כמו גם חדירה של סיסית על ידי micropipette. </li></ol> חלק 7: Microinjection דרך סיסית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפעל את העוברים עם micropipette כך הציטופלסמה של העובר 1-תא הבמה גלוי מתחת למיקרוסקופ לנתח. תשמרי על עצמך לא לשבור את קצה micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור סיסית ולאחר מכן את החלמון עם micropipette כדי להזריק לתוך העובר. בהפגנה זו, נוכל להיות הראשון microinjecting בחלמון ישירות מתחת לתא, ולאפשר זרימת דיפוזיה cytoplasmic ולהביא את הפתרון עובד לתוך התא. תזרים זה גלוי עקב האדום פנול הוסיף הפתרון עובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו גם להפגין הזרקה ישירה לתוך הציטופלסמה של התא. Microinjection ישיר לתוך התא הוא חזק יותר אבל זמן רב כמו אוריינטציה העובר תקין טכניקה microinjection נדרשת. כאשר קרום התא הוא קפדני יותר קרום החלמון, היא לעתים קרובות יותר מהר להיכנס micropipette דרך החלמון להגיע אל הציטופלסמה התא. המכוונת את הקוטב חיה לעבר החלק התחתון של השוקת ועבודה עם ידיים יציבות עשוי לסייע שיטה זו של זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר microinjection, המקום עוברים לתוך צלחת פטרי עם המדיום E3 ו דגירה אותם 28.5 ° C להתפתחות נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כמה שעות, ימים של התפתחות העובר, להתבונן בעוברים פנוטיפים העניין שלך. </li></ol> חלק 8: תוצאות נציג EGFP overexpression mRNA: כדי לוודא את הצלחת microinjection, אנו תפקח את הביטוי של ה-GFP של עוברי בפיתוח תחילת בשלב מגן (~ hpf 6) על ידי במיקרוסקופ כולו עובר vivo פלואורסצנטי (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). הביטוי של הקמת חזקה ביותר במהלך האירועים המוקדמים של ההתפתחות העוברית לעיתים קרובות להפחית במהלך הפיתוח כמו רנ&quot;א כתרים מוזרק מתפרק בהדרגה תלוי ביציבות של החלבון לידי ביטוי. pkd2 translational חוסמות morpholino: בהתבסס על התוצאות שפורסמו בעבר, אנו מצפים pkd2 morphants לחקות את הגוף הגבי ציר העקמומיות כפי שנמצאו על כ 2 ב דג הזברה pkd2 מוטציה לבין ציסטות בכליות ההווה - 3 DPF 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="איור 1" /> איור 1: תוצאות נציגת microinjection של mRNA EGFP ו pkd2 אוגוסט morpholino. (א) היו עוברים TAB microinjected בשלב 1 תאים עם 0.17 ננוגרם של mRNA EGFP ו דמיינו ב DPF 1 עבור הביטוי GFP vivo. (ב, ג) היו עוברים TAB microinjected בשלב 1 תאים עם ~ 1.7 nl של pkd2 morpholino חסימת translational ב mM 0.50 ו הבקיע עבור עקמומיות הגוף הגבי ב DPF 4.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.++A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon. (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos%3A+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li>
<li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li>
<li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li>
<li>Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li>
<li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li>
<li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li>
<li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li>
<li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li>
</ol>

Microinjection לתוך עוברי דג הזברה היא טכניקה מבוססת היטב וחזק לחקור את תפקידו של גן מסוים בהתפתחות. היישומים כוללים overexpression, misexpression, מבחני מציאה של הגן העניין שלך, כמו גם ניתוח epistatic בין גנים רבים. Microinjection של דג הזברה כבר בשימוש נרחב עבור יצירת חיות טרנסגניות, מיפוי גורל תא עוברי מוקדם blastula 5,6,7,8,9. בנוסף, היישום של טכניקה זו משמשת צעד מפתח ביצירת נבט קו מפלצות על ידי השתלת שיטות תא 10. <p class="jove_content" style=";text-...

כל החומרים האחרים המופיעים בפרוטוקול.

microinjection של mrna ו oligonucleotides morpholino antisense עוברי דג הזברה.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

כלי הכרחי לחקירת תפקידו של הגן במהלך הפיתוח היא היכולת לבצע מציאה גן, overexpression, ומחקרים misexpression. בשנת דג הזברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Microinjection של רנ&quot;א, דנ&quot;א, חלבונים, מולקולות אנטיסנס ומולקולות קטנות אחרות לתוך העובר המתפתח מספק לחוקרים assay מהירה וחזקה לבחינת תפקוד הגן<em&gt; In vivo</em&gt;. במאמר-video זה, אנו מדגימים כיצד להכין microinject<em&gt; במבחנה</em&gt; מסונתז EGFP mRNA ו-translational חסימת morpholino אוליגו נגד<em&gt; Pkd2</em&gt;, גן הקשור למחלת כליה פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית (ADPKD), אל 1 תאים בשלב עוברי דג הזברה. נמשיך לנתח את ההצלחה של ה-mRNA ו microinjections morpholino ידי אימות ביטוי של GFP וניתוח פנוטיפ. יישומים רחב של טכניקה זו כוללות יצירת חיות טרנסגניות ונבט קו מפלצות, התא גורל מיפוי וסינון גן. בזאת אנו מתארים פרוטוקול עבור overexpression של EGFP ו מציאה של<em&gt; Pkd2</em&gt; על ידי ה-mRNA הזרקת morpholino oligonucleotide.

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

כלי חיוני לחקירת תפקידו של גן במהלך ההתפתחות הוא היכולת לבצע השתקה גנטית (knockdown), ביטוי יתר (overexpression) וביטוי שגוי (misexpression)...

הליך זה מתחיל בהכנת morpho ו-mRNA עם cap ששוכפל in vitro. ממלאים מיקרופיפטה באמצעות שאיבת התמיסה המכילה את ה-morpho, ולאחר מכן מכיילים את נפח ההזרקה באמצעות במה של תא בודד עם מיקרומטר. לאחר מכן אוספים עוברים של Zebrafish ומסדרים אותם בתא מיקרו-הזרקה להזרקות לתוך החלמון.מזריקים את תמיסת העבודה לחלמון, ממש מתחת לתא, ומשתמשים בתנועות הציטופלזמה כדי להעביר את התמיסה להזרקות מיקרוסקוپیות לתא. לאחר ההזרקות, מזריקים את התמיסה לציטופלזמה של התא. מדגירים את העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C בתווך E3 ובודקים את הפנוטיפים הרלוונטיים בשלבים הבאים.שלום, אני שיילו יואן מהמעבדה, בנו של ד"ר סשה וממחלקת הגנטיקה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת יאל. היום נדגים טכניקת מיקרו-הזרקה חסונה לביצוע מחקרי ביטוי-יתר של mRNA והשתקה גנטית באמצעות מורפו-אוליגו-נוקלאוטידים בדגי zebrafish. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקידו של ה-Cilium במחלות כליות ציסטיות.אם כן, בואו נתחיל. גישה עוצמתית אחת למחקרי תפקוד גנים היא הזרקה מיקרוסקופית של RNA עם כיסוי (capped RNA) שתומלל במבחנה (in vitro) לעוברי דגי זהב. בהדגמה זו, נבצע הזרקה מיקרוסקופית של תמליל המסומן ב-EGFP ונשתמש בביטוי GFP בעוברי שלמים חיים כקריאה נראית לעין להזרקה מוצלחת.ראשית, נבצע תגובת תמלול in vitro של RNA עם כיפה (cap) עבור התמליל הרצוי. במעבדה שלנו, אנו מחדירים באופן שגרתי cDNA רצוי לתוך וקטור pCS2+, ומבצעים תגובת סינתזה in vitro של כמויות גדולות של RNA עם כיפה באמצעות ערכת Mmessage mMachine SP6. לאחר מכן, נטהר את דגימת ה-RNA על ידי הרצה בערכת RNeasy Mini או באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם והשקעה באיזופרופנול.קבעו בקפידה את ריכוז תכשיר ה-RNA ואחסנו אותו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש ביום ההזרקה. הפשיתו את דגימת ה-RNA, ערבבו קלות ב-vortex וסובבו בקיצור בנצנטריפוגה (spin down). כעת הכינו תמיסת עבודה עם מים סטריליים בריכוז סופי של 0.025% עד 0.05% phenol red; ה-phenol red משמש כסמן נראה להזרקת התמיסה אל העובר.כאן נכין תמיסת עבודה של 100 nanograms per microliter של EGFP mRNA עם 0.05% phenol red. לבסוף, יש לשמור את דגימת העבודה על קרח ולהחזיר את מלאי ה-RNA למינוס 80 degrees Celsius. יש לעבור להכנת ה-morpho כאשר הדגימה תהיה מוכנה להזרקה.אוליגוניוקלאוטידים אנטי-סנס מסוג מורפינו משמשים באופן נרחב לשינוי ביטוי גנים על ידי חסימת התרגום של חלבון מטרה או על ידי שינוי שחור של pre-mRNA. מורפלינו המשפיעים על שחור RNA בדגי zebrafish משמשים ככלי רב עוצמה לגנטיקה הפוכה באמצעות השתקת תפקוד גני. כאן נבצע הזרקה מיקרוסקופית של מורפו-אוליגו המכוון לאתר תחילת התרגום של pkd2. אנו משתמשים באופן שגרתי ב-300 M של מורפו-אוליגו, שתוכנן במיוחד עבור הגן הרלוונטי ונרכש מ-Gene Tools LLC.לאחר מכן נוסיף 100 µL מים סטריליים כדי להכין תמיסת מלאי בריכוז 3 mM, ולאחר מכן נחלק את התמיסה לאליקוטים ונשמור אותם בטמפרטורה של 20°C- עד ליום ההזרקה. נחמם את תמיסת ה-morino בטמפרטורה של 65°C למשך חמש דקות. לאחר מכן נקרר את התמיסה באופן מהיר על קרח ונבצע ספינט קצר; שלב זה דנטוריрует מבנים שניוניים באוליגו ומבטיח שהתמיסה מומסת לחלוטין.בשלב הבא, נכין תמיסת עבודה על ידי דילול תמיסת ה-Morpho במים סטריליים ובריכוז סופי של 0.025 עד 0.05% phenol red. בהדגמה זו, נכין תמיסת עבודה של 0.5 millimolar PKD two morino עם 0.05% phenol red. יש לשמור את תמיסת העבודה בטמפרטורת החדר ולגשת למילוי המיקרופיפט כאשר תהיו מוכנים להזרקת הדגימה זו.כדי להתחיל, נצטרך להכין מיקרו-פיפטות שישמשו להזרקות. הדבר נעשה על ידי חימום ומתיחה של צינורות נימיים מזכוכית סיליקט BOS במכשיר מתיחה של מיקרו-פיפטות. לאחר מתיחת המחטים, הן נשמרות בצלחת פטרי על גבי כמות קטנה של חימר או סרט דביק.בשלב הבא, נכין פלטות עבור תא מיקרו-הזרקה על ידי מזיגת agarose בריכוז 1.5% לתוך שלוש פלטות מדיום מסוג XE המעוצבות עם תעלות בצורת טריז. הדבר ישמש כשיטה פשוטה להחזקת העוברים במהלך ההזרקה. לאחר מכן, נותיר את פלטות תא ה-agarose להתמצק ונאחסן אותן בטמפרטורה של 4°C עד למועד השימוש בהן.כדי להתחיל במילוי המיקרו-פיפט, חתכו את הקצה הדיסטלי באמצעות פינצטה או להב תספורת כירורגי כדי ליצור פתח הגלוי בקושי תחת מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה של 50x. לאחר מכן, הניחו שני µL מתמיסת העבודה שלכם.הנח טיפה על לבישת כיסוי, חבר את החלק האחורי של מיקרופיפט למזרק של 5 mL המצויד בצינורית על מחט תת-עורית, וטבול קלות את הקצה הדיסטלי של המיקרופיפט בתוך טיפת תמיסת העבודה. הקפד לא לשבור את קצה המיקרופיפט. שאב את תמיסת העבודה דרך הקצה הדיסטלי של המיקרופיפט על ידי משיכת בוכנת המזרק.בשלב הבא, נבצע כיול לנפח ההזרקה של המיקרופיפט. הניחו טיפה של שמן מינרלי על סלייד מיקרומטרי והפעילו את אספקת החשמל והאוויר למכשיר המיקרו-מזרק בעל דחפי לחץ (pressure pulse micro injector). לאחר מכן, חברו את המיקרופיפט למחזיק המיקרופיפטים של מכשיר המיקרו-מזרק.המיקרו-מזרק מופעל באמצעות בקרת לחץ וההזרקות מופעלות על ידי לחיצה על דוושת הרגל מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. בדקו את נפח ההזרקה באמצעות המיקרו-מזרק על ידי הנחת טיפה מהתמיסה העובדת שלכם על שמן המיקרומטר. מדדו את קוטרה של הטיפה בעודה צפה כספירה על גבי השמן.כוון את משך הזמן ואת לחץ ההזרקה כדי לכייל במדויק את נפח ההזרקה. שלב זה מסייע בהשחזרות של ניסוי המיקרו-הזרקה. בהדגמה זו, כל המיקרו-הזרקות יבוצעו עם קוטר טיפה של 0.15 millimeters.לבסוף, לאחר כיולי נפח ההזרקה, השתמשו בכפתור העצירה (hold knob) של המיקרו-מזרק כדי למנוע מילוי חוזר ודליפה מהמיקרו-פיפט. כעת הגיע הזמן להכין את עוברי דג הזברה. דגי זברה מזדווגים באופן אקראי בשעות הבוקר המוקדמות; כדי להתחיל בהכנה, אספו עוברי דג זברה בשלב התא הבודד והניחו אותם בתוכ medium XE3.בעזרת פיפט העברה של 3 ml, סדרו את העוברים לאורך התעלות בצורת טריז בלוחיות תא המיקרו-הזרקה. הסירו את המדיום כך שהעוברים יהיו טבולים באופן רדוד ולא מוצפים. שלב זה מסייע בהשקעת העוברים לתחתית התעלות וכן בחדירת המיקרו-פיפט דרך הקוריון.כעת נתחיל בהזרקות. ראשית, נמניפולה את העוברים באמצעות המיקרו-פיפטה כך שציטופלזמה של עובר בשלב תא אחד תהיה גלויה תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. יש להיזהר לא לשבור את קצה המיקרו-פיפטה; חדרו דרך הכוריון ולאחר מכן דרך החלמון עם המיקרו-פיפטה כדי להזריק אל תוך העובר.בהדגמה זו, נבצע תחילה מיקרו-הזרקה לחלמון ישירות מתחת לתא, ונאפשר לציטופלזמה ולדיפוזיה להחדיר את תמיסת העבודה אל תוך התא. זרימה זו נראית לעין הודות לפנול אדום (phenol red) שהתווסף לתמיסת העבודה. מכיוון שמדובר בעובר של תא בודד, ניתן לבצע את ההזרקה ביד חופשית או באמצעות מניפולטור.נדגים גם הזרקה ישירה לציטופלזמה של התא. מיקרו-הזרקה ישירה לתא היא שיטה יציבה יותר, אך היא גוזלת זמן רב מכיוון שהיא דורשת התניית אוריינטציה נכונה של העובר וטכניקת מיקרו-הזרקה מדויקת. כיוון שקרומי התא עמידים יותר מקרומי החלמון, לעיתים קרובות מהיר יותר להחדיר את המיקרו-פיפט דרך החלמון כדי להגיע לתא.הכוונת הציטופלזמה כך שהקטב החייתי יפנה לתחתית התעלה ועבודה בידיים יציבות עשויות לסייע בשיטת הזרקה זו. לאחר המיקרו-הזרקה, העבירו את העוברים לצלוחית פטרי עם תווך E three והדגירו אותם בטמפרטורה של 28.5 °C להתפתחות תקינה. במהלך השעות והימים הבאים של התפתחות העוברים, עקבו אחר העוברים כדי לזהות את הפנוטיפים המבוקשים.כדי לוודא את הצלחת המיקרו-הזרקה, ננטר את ביטוי ה-GFP בעוברים המתפתחים החל משלב המגן (shield stage) באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של עוברי שלמים in vivo; ביטוי הקונסטרוקט הוא החזק ביותר במהלך האירועים המוקדמים של ההתפתחות העוברית ולעיתים קרובות פוחת במהלך ההתפתחות. הדבר קורה ככל שה-capped RNA המוזרק מתפרק בהדרגה, ותלוי ביציבות החלבון המבטא. בהתבסס על תוצאות שפורסמו בעבר, אנו מצפים ש-PKD two morphine יחקה את העקמומיות של ציר הגוף הגבי, כפי שנמצא בדגי זהב מוטנטיים מסוג PKD two, ויציג ציסטות בכליות בערך שניים עד שלושה ימים לאחר ההפריה.הדגמנו עבורכם טכניקת מיקרו-הזרקה חסונה לביצוע מחקרי ביטוי-יתר של mRNA והשתקה גנטית באמצעות מורפו-אוליגונוקלאוטידים בדגי zebrafish. בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו שזהו שלב חשוב: הזרקו ביד יציבה. זהו כל השלב.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

שיטה כדי לספק morpholinos ישירות otocyst דג הזברה ב 24hpf פותחה. שימוש microinjection של morpholinos לתוך לומן של שלפוחית ​​otic ו electroporation אפקט חדירה, הצלחנו לעקוף את ההשפעה של morpholinos על המוח ולקבל השפעות ספציפיות באוזן הפנימית.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

הפרוטוקול מתאר הפלה ממוקדת של ביטוי גנים בדגי זברה על ידי הזרקת מורפולינו בזנב.

הזרקת מורפולינו: שיטה להפיל ביטוי גנים במטרה לחקור תפקוד בדגי זברה

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה למניפולציה של ביטוי גנים בתאי חדריות של telencephalon דג הזברה המבוגר באמצעות oligonucleotides morpholino antisense. אנו מציגים שיטה זו כפרוטוקול יעיל ומהיר שיכול לשמש למחקרים תפקודיים במוח החולייתנים המבוגר.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

בסרטון הזה, Nijole Jasinskiene ממחישה את המתודולוגיה מועסק כדי ליצור מהונדס Aedes aegypti היתושים, אשר הם וקטורים עבור קדחת דנגה. טכניקות נכונה עבור הכנת מחטים microinjection, dessicating עוברים, וביצוע microinjection הם הפגינו.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

למד טכניקת מיקרו-הזרקה לביטוי יתר של mRNA ונוק-דאון גנים באמצעות אוליגונוקלאוטידים מורפולינו בעוברי דג הזברה Danio rerio. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד גנים בביולוגיה התפתחותית.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

גלה סרטונים נוספים