Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג'ין
9 במרץ 2009
וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.
דגי זברה זכרים ונקבות מושבעים בכלוב גידול שבו ביצי הפירייה נופלות לתחתית, שם ניתן לאסוף אותן בקלות. לאחר מכן, הביצים מסדרות לצד של שקף מיקרוסקופ בתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, קצה מחט ההזרקה הטעונה נגזז והגדרות ההזרקה מכווננות, כך שנפח ההזרקה (bolus) יהיה בגודל הרצוי כאשר הוא נמדד באמצעות מיקרומטר.
לבסוף, מזריקים את הביצים אחת אחת לאורך השורה. שלום, אני ג'ונתן רוזן ממעבדתו של ג'ון MA במחלקה לקרדיולוגיה בבית החולים לילדים בבוסטון. ואני מייקל סוויני, גם אני ממעבדת VY.
היום נדגים כיצד ניתן להזריק mRNA או morpholino לעוברים של דגי זב ocurrir. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של knockdown או ביטוי-יתר (overexpression) של תוצרי גנים ספציפיים. אז בואו נתחיל.
ראשית, נצטרך להכין את דגי השכסוכים ואת מיכלי הרבייה עם מחיצות במקומן בלילה שלפני ההזרקה, כדי להגדיל את סך ייצור הביצים. ניתן להגדיר את הדגים ביחס של שתי נקבות לזכר אחד, במידה ורצוי. למחרת בבוקר, לאחר הדלקת תאורת החדר, הוציאו את המחיצות ממספר מיכלים ואפשרו כ-20 דקות של זמן הזיווג ללא הפרעה. בעזרת מסננת, אספו את הביצים מכלובי הרבייה ושטפו אותן במי ביצים לפני מזיגתן לתוך צלחת פטרי.
באמצעות מים עם ביצים, ניתן לקבץ מחדש את הדגים במכלי תרבית גדולים יותר כדי להפיק סבבים נוספים של ביצים להזרקה. יש להתאים את תזמון איסוף הביצים כדי לאפשר הפקה של מספר הביצים המקסימלי, מבלי לתת להן לעבור את שלב התא הבודד. לבסוף, יש להניח זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ במכסה ההפוך של צלחת פטרי בנפח 100 מילימטר.
השתמשו בפיפטת העברה כדי לסדר את הביצים בצמוד לדופן השريחה כך שייווצר טור יחיד, ולאחר מכן הסירו את עודפי מי הביצים מהשريחה על ידי לחיצת נייר Kim wipe לצד הנגדי לביצים. כעת, נכין את מחטי המיקרו-הזרקה באמצעות מותח קפילרות (micro pipette puller). נמתח קפילרה מזכוכית בעלת קוטר חיצוני של 1 mm לשתי מחטים ונשמור מחטים אלו בצלחת פטרי בקוטר 150 mm. ניתן למתוח את המחטים מראש על ידי הנחתן על גבי רמפות של silly putty.
אנו משתמשים בהגדרות הבאות. Heat 6 45 pole 60 velocity 80. טענו את הקצה הרחב של המחט עם שלושה µL של חומר ההזרקה באמצעות פפיפט טעינה מיקרוסקופית (micro loader pipette).
נער את הבולוס לכיוון חוד המחט עד שיישארו מעט בועות או שלא יישארו בועות כלל. כעת, נפעיל את מקור האוויר ואת המיקרו-מזרק. הכנס את המחט לתוך המיקרו-מזרק וודא שהיא אטומה היטב בתוך המארז.
בדקו שהמיקרו-מניפולטור נמצא במיקום נכון המאפשר טווח רחב של תנועה וכיוונון. הביאו את קצה המחט למישור הראייה של המיקרוסקופ. הרימו אותה מעל הבמה ומקדו את המיקרוסקופ על האזור הדק ביותר של הקצה.
השתמשו בזוג פינצטות חדות כדי לקטום את המחט בנקודה שתשאיר את המחט צרה מספיק כדי לחדור את ה-chorion והחלמון, אך עדיין מסוגלת להשריץ טיפה בגודל עקבי. כדי לחשב את הנפח של כל הזרקה, נשתמש בטיפת שמן מינרלי על מיקרומטר, נחדיר את המחט אל השמן ונלחץ על דוושת הרגל כדי להזריק טיפה של תמיסה לתוך השמן. עקבו אחר גודל הטיפה תוך כדי קיטום המחט וכיוון לחץ ההזרקה במידת הצורך בעת ההזרקה לשמן.
חריץ בעל קוטר של 0.1 מילימטר מכיל 500 picoliters של חומר הזרקה. בדרך כלל נעשה שימוש בנפחי הזרקה של 500 picoliters או ננוליטר אחד. נפחי הזרקה אידיאליים ימלאו כ-10% מנפח הביצה.
איכות חוד המחט היא קריטית הן לנוחות ההזרקה והן לאיכות ולעקביות של התוצאות. כעת הגיע הזמן להזריק כדי להתחיל בהליך ההזרקה. ודאו שהעוברים לא התפתחו מעבר לשלב ארבעת התאים.
רצוי שהעובר יהיה בשלב התא הבודד. לאחר מכן, הרד את המחט לעבר עמודת הביצים, חדר את פני השכבה החיצונית של ה-corion והחדר אותה אל תוך החלמון בתנועה חלקה אחת תוך כדי צפייה. בכל מקרה של מעיכה או קרע של שק החלמון, הזרק את חומר ההזרקה אל תוך החלמון.
הימנעו מהזרקת בועות אוויר והיו ערניים לעוברים שנפגעו באופן גלוי מההזרקה לאורך השורה. התאימו את הלחץ במידת הצורך כדי לשמור על גודל חרוז עקבי, ובעזרת טיפ של פיפטה, הסירו ביצים שנראות כבלתי מופרות או כאלו שנהרסו במהלך תהליך ההזרקה. לאחר השלמת עמודה של ביצים, השתמשו בזרם עדין של מי ביצים כדי להעביר את הביצים המוזרקות לכלי Petri נקי וחזרו על הפעולה לפי הצורך.
שמרו מספר עוברים שלא הוזרקו כביקורת. מאוחר יותר במהלך היום הראשון, הסירו עוברים מתים ורשמו את מספר העוברים שהוזרקו. החליפו את מי הביצים בצלחת מדי פעם כדי להפחית את הסיכון לזיהום.
שימו לב כי בהתאם לחומר המוזרק, עשוי להיות שיעור הישרדות נמוך יותר של העוברים בהשוואה לאחיהם שלא הוזרקו. למרבה המזל, קל להזריק מספרים גדולים מאוד של עוברים, ולכן הדבר כמעט ואינו מהווה בעיה. כעת נציג מספר תוצאות מייצגות הן של הזרקת morpho והן של mRNA.
הבקרה שלא הוזרקה בנקודת זמן של 48 שעות לאחר ההפריה נראית תקינה כצפוי. עם זאת, עוברים שהוזרקו עם ה-morpho HG E three i three eeg FFR one, המדכא איזופורמים של HG המכילים את הראשון מבין שני החזרות דמויי EEG, מראים בצקת מוחית; הזרקה של mRNA של heart glass הובילה גם היא לפנוטיפ ברור ב-24 שעות לאחר ההפריה.
הראשים של בישקרי הביקורת שלא הוזרקו נראו נורמליים. לעומת זאת, חלק מהעוברים שהוזרקו ב-M NNA הראו אופיאס (opia). הרגע הצגנו בפניכם כיצד הזרקה של מורפולינוס או mRNA במהלך שלב התא הבודד יכולה להגביר או להפחית את הביטוי של גנים ספציפיים במהלך התפתחות מאוחרת יותר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שגם.
ריכוז גבוה של mRNA או של morpho עלול לגרום לתמותה לא ספציפית בעוברים עם ה-morpho. יש לבחון כל אחד מהם באופן אמפירי, אך בדרך כלל ריכוזים שבין 200 ל-500 micromolar גורמים להשתקה (knockdown) ספציפית של פעילות הגן מבלי לגרום לתמותה כללית. וזהו.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
סרטון זה מדגים הזרקה של morpholino או mRNA לעוברים של דגי זברה (zebrafish) בשלב התא הבודד, לצורך מניפולציה של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מניפולציה גנטית
רקע
- דגי זברה משמשים נפוצות כאורגניזם מודל בביולוגיה התפתחותית.
- טכניקות הזרקה מאפשרות את חקר התפקוד והוויסות של גנים.
- מניפולציה של ביטוי גנים יכולה לחשוף תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים.
- טיפול זהיר בעוברי הדגים הוא קריטי להצלחת הניסויים.
מטרת המחקר
- להדגמת הטכניקה של הזרקת mRNA או מורפולינו לעוברי דג zebrafish.
- לתצפית על השפעות של knockdown או ביטוי יתר (overexpression) של גנים על ההתפתחות.
- לספק פרוטוקול לחוקרים המעוניינים במניפולציה גנטית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכלאת דגי זברה ואיסוף ביצים מופרית.
- הכנת מחטי מיקרו-הזרקה ומילויין בחומר ההזרקה.
- הזרקה מדויקת של עוברים בשלב התא הבודד.
- ניטור התפתחות העוברים ותיעוד התוצאות.
תוצאות עיקריות
- עוברי מזריקים הראו פנוטיפים ספציפיים בהתאם לחומר שנעשה בו שימוש.
- עוברי ביקורת התפתחו באופן תקין, בעוד שעוברי מזריקים הראו תוצאות מגוונות.
- הזרקה של morpholino הובילה לבצקת מוחית ניכרת בחלק מהמקרים.
- הזרקות של mRNA גרמו לשינויים התפתחותיים מובחנים.
מסקנות
- הטכניקה משנה ביעילות את הביטוי הגני בעוברי zebrafish.
- אופטימיזציה קפדנית של פרמטרי ההזרקה חיונית להצלחה.
- התוצאות מדגישות את הפוטנציאל של שיטה זו לחקר תפקוד גנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיקרו-הזרקה לעוברים של דגי זברה מאפשרת מודולציה מהירה ובקנה מידה רחב של ביטוי גנים לצורך תיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. הטכניקה תומכת בסריקת פנוטיפים בתפוקה גבוהה על ידי מתן אפשרות להשתקה (knockdown) או ביטוי יתר (overexpression) מדויקים של גנים ספציפיים, כדי להעריך השלכות פונקציונליות במערכת של בעלי חוליות. גישה זו מספקת ערך של הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור הפרעה גנטית לפנוטיפים התפתחותיים ניתנים לצפייה, ובכך תורמת לביסוס הביטחון במטרה ולהחלטות לגבי תיעדוף תיק הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות באמצעות השתקה ממוקדת של גנים (knockdown) או ביטוי יתר כדי להבהיר את מעורבות המסלול.
- ערך תפעולי: תומך ביצירה מהירה של מודלים לאובדן תפקוד (loss-of-function) ולהגברת תפקוד (gain-of-function) כדי להפחית סיכונים במטרות לפני פיתוח הבדיקה.
- ערך חיזוי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי קישור בין מודולציה גנטית לתוצאות פנוטיפיות במערכת של חולייתנים הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר עוברים סטנדרטיים שעברו מודולציה גנטית, המתאימים לקריאות פנוטיפיות המשך במסעי סריקה.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה של מאות עוברים מוזרקים בשעה, ובכך תומך בפורמטי בדיקה ניתנים להרחבה ולשחזור.
- ערך תרגומי: יוצר פנוטיפים כמותיים ונצפים (למשל, שינויים מורפולוגיים) המשמשים כנקודות קצה איתנות לסריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק רצף מגילוי תפקוד גנים ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מידול של וריאנטים של גנים אנושיים בהקשר של חולייתנים.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מבוססות התאמת סיכונים על ידי זיהוי פנוטיפים המתאימים ליעילות של מודולציית המטרה או לרעילותה.
- ביטחון חיזוי: מסייע בתיעדוף מטרות על בסיס חומרת הפנוטיפ והספציפיות שנצפו לאחר ההזרקה, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות בזיהוי מובילים (leads).
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, תומכת בתיקוף המטרה באמצעות הפרעה גנטית ומאפשרת מעבר לסריקה פנוטיפית וזיהוי מובילים כאשר הדבר נתמך בתוצאות ניתנות לצפייה התלויות במינון.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת השערות על ידי מתן אפשרות לוויסות מדויק של ביטוי גנים, כדי להעריך את הנחיצות והמספיקות של מטרה במסלולים התפתחותיים.
- סריקה: מייצרת מערכות ביולוגיות מוכנות לבדיקה עם רקעים גנטיים סטנדרטיים להערכה עקבית של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת דירוג פנוטיפי כמותי (למשל, תדירות פגמים מורפולוגיים) להשוואת תנאים ולהערכת השפעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה גנטית לפנוטיפים התפתחותיים המדמים מנגנוני מחלה אנושיים, ובכך תומך בתיקוף המותאם לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לצורך בחינה איטרטיבית של מטרות על פני גנים ומסלולים מרובים בפרויקטים של פורטפוליו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות הפרעה גנטית ישירה במודל של חולייתנים.
- ערך תפעולי: מספק יכולת שחזור גבוהה ויכולת הרחבה (scalability), עם קיבולת להזרקה למאות עוברים בשעה באמצעות פרוטוקולי מיקרו-הזרקה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את תהליך קבלת ההחלטות לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) על ידי אספקת ראיות פנוטיפיות מוקדמות למודולציה של המטרה, ובכך מפחית השקעה במטרות שאינן ברות-ביצוע.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים על ידי קישור פנוטיפים ספציפיים לגנים לתוצאות התפתחותיות, מה שמסייע בהקצאת הון בבחירת מטרות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול דגי זברה, טיפול בעוברים ובטכניקת מיקרו-הזרקה כדי להבטיח חיוניות ועקביות.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מיקרו-מזרקים, מקורות אוויר, מיקרומטרים ומכשירים למשיכת מחטים לשליטה מדויקת בנפח.
- מחייב סטנדרטיזציה של נפח ההזרקה, איכות המחט ושלב ההתפתחות של העוברים בין מפעילים ואתרים שונים לצורך קבלת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה ברקעים גנטיים שונים או במודלים של מחלות כדי לשמור על הרלוונטיות הפנוטיפית.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות העוברים לטראומה מההזרקה והשפעות לא ספציפיות (off-target effects) התלויות בריכוז, הדורשות אופטימיזציה אמפירית לכל מטרה.
