Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג'ין
March 9th, 2009
וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.
דגי זברה זכרים ונקבות מזדווגים בכלוב רבייה שבו ביצים מופרות נופלות לקרקעית, שם ניתן לאסוף אותן בקלות. לאחר מכן הביצים מסודרות על מגלשת מיקרוסקופ בצלחת פטרי. לאחר מכן, מחט ההזרקה הטעונה נחתכת והגדרות ההזרקה עוברות מניפולציה, כך שבולוס ההזרקה הוא בגודל הרצוי כאשר הוא נמדד במיקרומטר.
לבסוף, ביציות מוזרקות אחת בכל פעם בהמשך הדרך. היי, אני ג'ונתן רוזן מהמעבדה של ג'ון MA במחלקה לקרדיולוגיה בבית החולים לילדים בבוסטון. ואני מייקל סוויני, גם הוא במעבדת VY.
היום אנו הולכים להדגים כיצד ניתן להזריק mRNA או מורף פלו לעוברים של דג זברה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של הפלה או ביטוי יתר של תוצרי גנים מסוימים. אז בואו נתחיל.
כדי להתחיל, נצטרך להקים את מיכלי הדגים והרבייה עם מחיצות בלילה שלפני ההזרקה כדי להגדיל את ייצור הביצים הכולל. ניתן להקים דגים ביחס של שתי נקבות לזכר אחד אם רוצים. למחרת בבוקר לאחר הדלקת אורות החדר, משוך את המחיצות מכמה מיכלים ואפשר כ-20 דקות של זמן הזדווגות ללא הפרעה בעזרת מסננת, אסוף את הביצים מכלובי הרבייה ושטוף אותן במי ביצים לפני ששופכים אותן לצלחת פטרי.
עם מי ביצים, ניתן לקבץ מחדש דגים במיכלים גדולים יותר כדי לייצר סיבובים נוספים של ביצים להזרקה. התאם את תזמון איסוף הביציות כדי לאפשר לייצר את המספר המרבי של ביציות מבלי לתת להן לעבור את שלב התא הבודד. לבסוף, הנח שקופית מיקרוסקופ במכסה ההפוך של צלחת פטרי 100 מילימטר.
השתמש בפיפטה להעברה כדי ליישר את הביצים כנגד צד המגלשה וליצור עמודה אחת, ולאחר מכן הסר עודפי מי ביצים מהמגלשה על ידי לחיצה על מגבון קים על הצד שממול לביצים. לאחר מכן, נכין את מחטי הזרקת המיקרו באמצעות מיקרו פיפטה קוטבית. נמשוך נימי זכוכית בקוטר חיצוני של מילימטר אחד לשתי מחטים ונאחסן את המחטים הללו בצלחת פטרי של 150 מילימטר על ידי הנחתם על רמפות שפכטל מטופשות, ניתן למשוך מחטים מראש.
אנו משתמשים בהגדרות הבאות. חום 6 45 מוט 60 מהירות 80. טען את הקצה הרחב של המחט בשלושה מיקרוליטר של חומר הזרקה באמצעות פיפטה מיקרו מעמיס.
נענע את הבולוס לכיוון קצה המחט עד שנותרו כמה בועות או לא נשארו כלל. לאחר מכן, נפעיל את מקור האוויר ואת מזרק המיקרו. הכנס את המחט למזרק המיקרו והקפד על אטימה הדוקה בתוך המארז.
בדוק שהמיקרו מניפולטור נמצא במצב מתאים כדי לאפשר מגוון רחב של תנועה והתאמה. הכניסו את קצה המחט למישור הראייה של המיקרוסקופ. גבוה מהבמה והתמקד באזור הדק ביותר של הקצה.
השתמש בזוג מלקחיים חדים כדי לצבוט את המחט בנקודה שמשאירה את המחט צרה מספיק כדי לנקב את הקורי וחלמון, אך עדיין מסוגלת לספק גודל חרוז עקבי. כדי לחשב את נפח כל הזרקה, נשתמש בטיפה של שמן מינרלי על מיקרומטר, נכניס את המחט לשמן ונלחץ על דוושת הרגל כדי להזריק חרוז תמיסה לשמן. עקוב אחר גודל החרוז תוך כדי חיתוך המחט והתאמת לחץ ההזרקה בעת הזרקה לשמן.
חרוז בקוטר 0.1 מילימטר מכיל 500 פיקוליטר של חומר הזרקה. בדרך כלל משתמשים בנפחי הזרקה של 500 פיקוליטר או ננוליטר אחד. נפחי הזרקה אידיאליים ימלאו כ-10% מנפח הביצית.
איכות קצה המחט היא קריטית הן לקלות ההזרקה והן לאיכות ועקביות התוצאות. עכשיו הגיע הזמן להזריק כדי להתחיל בהליך ההזרקה. ודא שהעוברים לא התפתחו מעבר לשלב ארבעת התאים.
באופן אידיאלי, העובר צריך להיות בשלב התא האחד. לאחר מכן, הורידו את המחט לכיוון עמוד הביצים, חודרים את פני הקוריון ומכניסים לחלמון במכה חלקה אחת תוך כדי צפייה. לכל ריסוק או קריעה של שק החלמון, הזרקו את חומר ההזרקה לחלמון.
הימנעו מהזרקת בועות אוויר והיזהרו מעוברים שנפגעו באופן ניכר מהזריקה שעובדת בהמשך הדרך. יש צורך בהתאמת הלחץ כדי לשמור על גודל חרוז עקבי ובאמצעות קצה פיפטה, הסר ביצים שנראות לא מופרות או נהרסות במהלך תהליך ההזרקה. לאחר השלמת עמודת ביצים, השתמש בזרם עדין של מי ביצים כדי להעביר את הביצים המוזרקות לצלחת פטרי נקייה ולחזור על הפעולה לפי הצורך.
שמור מספר עוברים שלא הוזרקו כביקורת. מאוחר יותר במהלך היום הראשון, הסר עוברים מתים ורשום את מספר העוברים המוזרקים. החלף את מי הביצים בכלי מעת לעת כדי להפחית את הסיכוי לזיהום.
שימו לב שבהתאם למה שמוזרק, עוברים עשויים לשרוד בשיעור נמוך יותר מאחיהם שלא הוזרקו. למרבה המזל, קל להזריק כמויות עצומות מהם, כך שלעתים רחוקות זו בעיה. כעת נציג כמה תוצאות מייצגות הן של הזרקת מורפו והן של mRNA.
הביקורת המוזרקת 48 שעות לאחר ההפריה נראית תקינה כצפוי. עם זאת, עוברים שהוזרקו עם המורפו HG E שלוש i שלוש EEG FFR אחד, אשר מפיל איזופורמים של HG המכילים את הראשון מבין שני מופעי חזרות דמויי EEG, בצקת מוחית, הזרקת זכוכית לב. Mr.NA גם ייצר פנוטיפ ברור 24 שעות לאחר ההפריה.
ראשי הבקרים שהוזרקו נראו נורמליים. לעומת זאת, חלק מהעוברים שהוזרקו עם M NNA מציגים אופיה, זה עתה הראינו לכם כיצד הזרקת מורפוס או mRNA בשלב התא האחד יכולה להגביר או להקטין את הביטוי של גנים ספציפיים במהלך ההתפתחות המאוחרת יותר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור גם את זה.
ריכוז גבוה של mRNA או מורפו יכול לגרום לקטלניות לא ספציפית בעוברים עם המורפו. כל אחד מהם צריך להיבדק באופן אמפירי, אך בדרך כלל ריכוזים של בין 200 ל-500 פעילות גן נוקדאון מיקרו-מולרי במיוחד מבלי לגרום לקטלניות כוללת. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה
הסרטון הזה מדגים את ההזרקה של מורפולינו או mRNA לעוברים של דג זברה בשלב התא היחיד על מנת לתמרן את ביטוי הגנים במהלך ההתפתחות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מניפולציה גנטית
רקע
- דגי זברה משמשים בדרך כלל כאורגניזם מודל בביולוגיה התפתחותית.
- טכניקות הזרקה מאפשרות מחקר של תפקוד ורגולציה של גנים.
- מניפולציה של ביטוי הגנים יכולה לחשוף תובנות לגבי תהליכי התפתחות.
- טיפול זהיר בעוברים הוא קריטי לניסויים מוצלחים.
מטרת המחקר
- להדגים את הטכניקה של הזרקת mRNA או מורפולינו לעוברי דג זברה.
- להתבונן בהשפעות של ירידת ביטוי גנים או ביטויים יתר על התפתחות.
- לספק פרוטוקול לחוקרים המתעניינים במניפולציה גנטית.
שיטות ששימשו
- גידול דגי זברה ואיסוף ביצים מופרות.
- הכנת מחטי מיקרו-הזרקה וטעינתן בחומר ההזרקה.
- הזרקת עוברים בשלב התא היחיד בדיוק.
- מעקב אחר התפתחות העובר ורישום התוצאות.
תוצאות עיקריות
- העוברים שהוזרקו הפגינו פנוטיפים ספציפיים בהתאם לחומר ששימש.
- עוברים בקרה התפתחו באופן תקין, בעוד שהמוזרקים הראו תוצאות שונות.
- הזרקת מורפולינו הובילה לבצקת מוחית ניתנת לצפייה במקרים מסוימים.
- הזרקות mRNA הביאו לשינויים התפתחותיים מובחנים.
מסקנות
- הטכניקה משנה ביעילות את ביטוי הגנים בעוברי דג זברה.
- אופטימיזציה זהירה של פרמטרי ההזרקה חיונית להצלחה.
- התוצאות מדגישות את הפוטנציאל של שיטה זו לחקר תפקוד הגנים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Zebrafish embryo microinjection enables rapid, scalable modulation of gene expression for early-stage target validation in drug discovery. The technique supports high-throughput phenotypic screening by allowing precise knockdown or overexpression of specific genes to assess functional consequences in a vertebrate system. This approach provides mechanistic de-risking value by linking genetic perturbation to observable developmental phenotypes, informing target confidence and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through targeted gene knockdown or overexpression to clarify pathway involvement.
- Operational Value: Supports rapid generation of loss-of-function and gain-of-function models to de-risk targets before assay development.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by connecting genetic modulation to phenotypic outcomes in a disease-relevant vertebrate system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, genetically modulated embryos suitable for downstream phenotypic readouts in screening campaigns.
- Operational Value: Enables preparation of hundreds of injected embryos per hour, supporting scalable and reproducible assay formats.
- Translational Value: Generates quantitative, observable phenotypes (e.g., morphological changes) that serve as robust endpoints for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides continuity from gene function discovery to preclinical validation by modeling human gene variants in a vertebrate context.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying phenotypes that correlate with target modulation efficacy or toxicity.
- Predictive Confidence: Helps prioritize targets based on phenotypic severity and specificity observed post-injection, reducing false positives in lead identification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through genetic perturbation and enabling transition to phenotypic screening and lead identification when supported by observable, dose-responsive outcomes.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing precise modulation of gene expression to assess target necessity and sufficiency in developmental pathways.
- Screening: Generates assay-ready biological systems with standardized genetic backgrounds for consistent compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative phenotypic scoring (e.g., morphological defect frequency) to compare conditions and assess genetic or pharmacological effects.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to developmental phenotypes that model human disease mechanisms, supporting biomarker-aligned validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target interrogation across multiple genes and pathways in portfolio projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct genetic perturbation in a vertebrate model.
- Operational Value: Delivers high reproducibility and scalability, with capacity to inject hundreds of embryos per hour using standardized microinjection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early phenotypic evidence of target modulation, reducing investment in non-viable targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking gene-specific phenotypes to developmental outcomes, informing capital allocation in target selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, embryo handling, and microinjection technique to ensure viability and consistency.
- Depends on specialized instrumentation including microinjectors, air sources, micrometers, and needle pullers for precise volume control.
- Necessitates standardization of injection volume, needle quality, and embryo staging across operators and sites for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method across different genetic backgrounds or disease models to maintain phenotypic relevance.
- Includes practical limitations such as embryo sensitivity to injection trauma and concentration-dependent off-target effects, requiring empirical optimization per target.
