Name: Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה גין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למדו טכניקת מיקרו-הזרקה לעוברי דג זברה בשלב התא הבודד לחקר פונקציית גנים. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות של knockdown או overexpression על התפתחות עוברית ב-Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים אנשי המעבדה Mably ו Narie סטורר לקבלת סיוע טכני שלהם, איגוד הלב האמריקני (NCRP המדען פיתוח גרנט 0635363N) לבין הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (גרנט SCCOR HL02 RFA-027) למימון.

חלק 1: ייצור ביצה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלילה לפני זריקה, להגדיר את הדגים רבייה טנקים עם חוצצים במקום. כדי להגדיל את הייצור הכולל ביצה, דגים ניתן להגדיר יחס של שתי נקבות על זכר אחד אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, אחרי האורות בחדר נדלק, למשוך את חוצצים מטנקים מספר ולאפשר כ 20 דקות של זמן הזיווג באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מסננת, לאסוף את הביצים מן הכלובים לגידול ולשטוף אותם במים ביצה. יוצקים את הביצים לתוך צלחת פטרי עם מים ביצה מופרית להסיר ביצים ופסולת עם פיפטה העברה. דגים יכולים להיות נערכו מחדש במיכלים גדולים כדי לייצר סיבובים נוספים של ביצים להזרקה. התאם את העיתוי של איסוף ביצים כדי לאפשר מספרים המרבי של ביצים להיות מיוצר מבלי לאפשר להם לעבור את השלב תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות מיקרוסקופ במכסה הפוכה של צלחת פטרי 100mm. השתמש פיפטה להעביר בשורה את הביצים על הצד של המגלשה להרכיב עמודה בודדת. הסרה של עודפי מים ביצה משקופית על ידי לחיצה Kimwipe נגד הצד הנגדי הביצים. (איור 1A) </li></ol> חלק 2: משיכת המחט, טעינה, והכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם חולץ micropipette, למשוך כוס 1.0mm OD נימי לשתי מחטים חנות בצלחת פטרי 150mm ידי הנחת מעל רמפות מרק טיפשי. מחטים יכול להיות משך מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט Backload עם μL 3 של חומר ההזרקה באמצעות פיפטה microloader. נער את בולוס לעבר קצה המחט עד כמה יש בועות או לא הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור האוויר microinjector. הכנס את המחט לתוך microinjector ולהבטיח חותם חזק בתוך הדיור. בדוק micromanipulator נמצא במצב תקין כדי לאפשר מגוון רחב של תנועה והסתגלות. תביאו את קצה מחט לתוך מטוס המבט של מיקרוסקופ, גבוה מעל הבמה, להתמקד באזור הדק של קצה. השתמש זוג מלקחיים חדה לצבוט את מחט בנקודה אשר משאיר המחט צר מספיק כדי לחדור את סיסית וחלמון אבל עדיין מסוגל לספק גודל חרוז עקבי. טיפה של שמן מינרלי על מיקרומטר ניתן להשתמש כדי לחשב את עוצמת הקול של כל הזרקה. כאשר מוזרק לתוך השמן, חרוז בקוטר של 0.1 מ&quot;מ מכיל 500 PL של חומר ההזרקה (1B דמות); כרכים הזרקה של 500 PL או 1nL משמשים בדרך כלל. לדכא את דוושת רגל ולנטר את גודל חרוז בעוד זמירה את המחט והתאמת לחץ ההזרקה לפי הצורך. כרכים הזרקת אידיאלי תמלא כ 10% מנפח הביצה. איכות קצה מחט הוא חיוני כדי להקל על שניהם הזרקת ואת איכות ועקביות של התוצאות. </li></ol> חלק 3: הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא העוברים לא התפתחו מעבר לשלב ארבע התא. באופן אידיאלי, עוברים צריך להיות בשלב אחד התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את המחט לכיוון הטור של ביצים, מחזיק את המנה במקום עם היד מול שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס את פני השטח של סיסית והזן את החלמון במכה אחת חלקה תוך כדי צפייה לכל ריסוק או קריעה של שק החלמון. להזריק את חומר הזרקה לתוך החלמון (דמות 1C). הימנע הזרקת בועות אוויר או מתיחת חלמון כמו גם יכול להיות קטלני לעובר. עבודה לאורך הקו, להתאים את הלחץ הדרוש כדי לשמור על גודל חרוז עקבית, באמצעות קצה פיפטה, להסיר ביצים שנראים מופרית או נהרסים בתהליך הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת עמודה של ביצים, להשתמש בזרם עדין של מים ביצה להעביר את הביצים מוזרק לתוך צלחת פטרי נקי. חזור על פי הצורך. שמור עוברים uninjected מספר כביקורת. בסוף של יום אחד, להסיר עוברים מתים להקליט את מספר העוברים מוזרק. החלף את המים ביצה בצלחת מעת לעת כדי להקטין את הסיכוי לזיהום. </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג תלוי מה זה להיות מוזרק, העוברים עשויים לשרוד בקצב נמוך יותר מאשר אחים uninjected שלהם. למרבה המזל, קל להזריק מספרים עצומים של אותם, אז זה רק לעתים נדירות בעיה. זה נורמלי morphants להציג הפיתוח מתעכב מעט. כדי להמחיש את התוצאות של microinjection, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לתפעל את רמות החלבון הלב של זכוכית (Heg). Heg הוא חלבון הטרנסממברני הדרושים לפיתוח לב נורמלי. בהעדר שלה, עוברים לפתח לבבות עם קטעי יבוא ענק ותאי 1. אנו מזריקים two morpholinos מתואר בעבר נגד heg, heg_e3i3_egfr1 ו heg_e4i4_egfr2, בריכוז של 500 מיקרומטר. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, שולט אח uninjected נראים תקינים, כצפוי (2A דמות ו-B). עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח (דמות 2C). למרות ליבם של רוב morphants אלה שינו את המורפולוגיה, חדרי שלהם הם בגודל רגיל (דמות 2D). עוברים מוזרקעם heg_e4i4_egfr2 מומים בלב התערוכה משתנה. חלקם נראים תקינים, בעוד אחרים יש שטחים גדולים יבוא אטריה מוגדל בינוני (2E דמות ו-F). מוטציה heg, כפי שדווח בעבר 1, יש דרכי יבוא מוגדל עצומה ו אטריום (דמות 2G ו-H). אנחנו גם עוברים wildtype מוזרק עם mRNA 400 ng / μL עיבד מ heg באורך מלא cDNA. אמנם שולטת uninjected להתפתח בצורה תקינה (איור 3A ו-B), עוברים הזריקו heg mRNA בתערוכה מגוון של פנוטיפים החל המראה wildtype כדי cyclopia חמור, קיצור של ציר הגוף העיקרי, נמק של הראש והגוף, ועל ליקויים קו האמצע (דמות 3C ו-D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> באיור 1. לעוברים להיות מוזרק הם נעמדו מול המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי (A). נפח הזרקה נקבעת על ידי הזרקה לתוך שמן מינרלי דגש על מיקרומטר. נפח הזרקה של 500 PL, אשר נמצא בשימוש נפוץ, בעל קוטר של 0.1 מ&quot;מ (B). מיד לאחר ההזרקה, morpholino או mRNA נראה כמו מקום להדגיש את החלמון (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> איור 2. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, עוברים uninjected אין פגמים ברוטו (א) או הפנוטיפ לב (B). עוברים מוזרק עם heg_e3i3_egfr1 morpholino יש בצקת במוח (C, חץ) אבל חדרי הלב בגודל רגיל (D). כמה עוברי מוזרק עם heg_e4i4_egfr2 morpholino יש קטעי זרימה מוגדלים אטריה (E, F). מוטנטים heg יש קטעי יבוא מוגדל קשה אטריה (G, H). (א), (ג), (E), ו - (G) הם תמונות DIC 4x, (ב), (ד), (F) (H) הם 20x תמונות DIC. אטריום = זה = בדרכי יבוא. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> איור 3. הפריה בגיל 24 שעות לכתוב, uninjected עוברי יש גוף ארוך, ישר, ללא פגמים או נמק קו האמצע (א) ושתי עיניים מוגדרים בבירור עם צינור עצביים ביניהם (B). כמה עוברי הזריקו mRNA heg, לעומת זאת, התערוכה ציר הגוף מקוצר, נמק, somites מעוותות (ג), ו cyclopia (ד &#39;). (א) ו - (ג) הם תמונות DIC 4x, (ב) ו - (ד) הם 20x תמונות DIC.

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

אחד היתרונות של מערכת מודל דג הזברה הוא הקלות בה מוצרי גן מסוים ניתן להוסיף או לבטל מן העובר על ידי microinjection. כדי בכל מקום בגוף overexpress חלבון מסוים, קידוד ה-mRNA הוא מוזרק לתוך החלמון בשלב 1-התא. במהלך הפיתוח הבאים של העובר, RNA מופץ ברחבי האורגניזם ותורגם. לעומת זאת, כדי למנוע חלבון מסוים, morpholinos משמשים. Morpholinos הם oligonucleotides סינתטי נועד עם ההשלמה antisense כדי RNAs ספציפיים. כמו mRNAs, morpholinos מוזרקים לתוך החלמון בשלב 1-התא. בתוך העובר הם נקשרים RNAs היעד שלהם, למנוע תרגום. השינוי העיקרי צריך להיעשות עבור כל morpholino או mRNA הוא הריכוז של החומר המוזרק. גבוה מדי ריכוז או morpholino או mRNA עלול לגרום אי - רעילות ספציפיים, בעוד כל morpholino חייבים להיבדק אמפירית כדי לקבוע ריכוז אופטימלי שלה, בדרך כלל ריכוזי morpholino בין 200 מיקרומטר ו 500 מיקרומטר להפיל פעילות הגן ביעילות מבלי לגרום אי - פגמים ספציפיים. גודלו המדויק של פתיחת מחט זה לא קריטי. בתוך במגוון גדלים מחט, בלחץ הזרקה וזמן הזרקה ניתן להתאים לייצר בולוס נפח הנכון. Morpholinos יש יישומים רבים, כולל לנתיחה התפקודית של תחומים בתוך החלבון. כאשר תוכנן יעד ספציפי, אקסון אינטרון צמתים, morpholinos תמנע שחבור התרחשות שם. בדקנו את ההשפעה של שתי morpholinos אשר נקלטות אקסון אינטרון צמתים ב-mRNA מראש של heg. Heg_e3i3_egfr1 morpholino נקשר הצומת בין אקסון אינטרון 3 ו 3, מניעת מכונות שחבור מתוך שילוב של אקסון 3 לתוך תמלילי בוגרת. Heg_e4i4_egfr2 morpholino דומה מסיר אקסון 4. שני אקסונים 3 ו -4 לקודד תחומים המכיל EGF כמו חוזר. עוברים כמה הזריקו heg_e4i4_egfr2 בינוני phenocopy מוטציה; ניסויים נוספים יידרשו להבין את התפקיד של Heg אקסון 4 בהתפתחות הלב. באופן מפתיע, עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח, תכונה לא ראיתי מוטציות heg. זה יכול להיות בגלל היכולת של morpholinos להיקשר תמלילי אימהית זה יהיה מעושה מוטנטים zygotic.

<table><tbody><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>כלי</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td>כלי</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מחטים</td><td>כלי</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית</td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות למילוי מיקרו-מזרקים</td><td>כלי</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

אחד היתרונות של דג הזברה לומד הוא הקלות והמהירות של מניפולציה רמות החלבון בעובר. Morpholinos, אשר oligonucleotides סינתטי עם ההשלמה antisense כדי RNAs היעד, ניתן להוסיף את העובר כדי לצמצם את הביטוי של גן מסוים המוצר. לעומת זאת, ה-mRNA מעובד ניתן להוסיף העובר להגדיל את רמות של המוצר גן. הרכב להוספת או mRNA או morpholino לעובר הוא microinjection. Microinjection יעילה ומהירה, המאפשרת הזרקה של מאות עוברים לשעה. וידאו זה מציג את כל השלבים הכרוכים microinjection. בקצרה, ביצים נאספים מיד אחרי שהרימו אותו בשורה נגד המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי. בשלב הבא, מחט קנס שקצהו עמוסה חומר הזרקה מחובר microinjector ומקור אוויר, שולט microinjector מותאמים לייצר נפח הזרקה רצוי. לבסוף, המחט הוא צלל לתוך החלמון של העובר ואת morpholino או mRNA הוא גורש.

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

אחד היתרונות של חקר דגי הזברה הוא הקלות והמהירות שבהן ניתן לתמרן את רמות החלבון בעובר. מורפולינוס, שהם סינתטיים...

דגי זברה זכרים ונקבות מושבעים בכלוב גידול שבו ביצי הפירייה נופלות לתחתית, שם ניתן לאסוף אותן בקלות. לאחר מכן, הביצים מסדרות לצד של שקף מיקרוסקופ בתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, קצה מחט ההזרקה הטעונה נגזז והגדרות ההזרקה מכווננות, כך שנפח ההזרקה (bolus) יהיה בגודל הרצוי כאשר הוא נמדד באמצעות מיקרומטר.לבסוף, מזריקים את הביצים אחת אחת לאורך השורה. שלום, אני ג'ונתן רוזן ממעבדתו של ג'ון MA במחלקה לקרדיולוגיה בבית החולים לילדים בבוסטון. ואני מייקל סוויני, גם אני ממעבדת VY.היום נדגים כיצד ניתן להזריק mRNA או morpholino לעוברים של דגי זב ocurrir. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של knockdown או ביטוי-יתר (overexpression) של תוצרי גנים ספציפיים. אז בואו נתחיל.ראשית, נצטרך להכין את דגי השכסוכים ואת מיכלי הרבייה עם מחיצות במקומן בלילה שלפני ההזרקה, כדי להגדיל את סך ייצור הביצים. ניתן להגדיר את הדגים ביחס של שתי נקבות לזכר אחד, במידה ורצוי. למחרת בבוקר, לאחר הדלקת תאורת החדר, הוציאו את המחיצות ממספר מיכלים ואפשרו כ-20 דקות של זמן הזיווג ללא הפרעה. בעזרת מסננת, אספו את הביצים מכלובי הרבייה ושטפו אותן במי ביצים לפני מזיגתן לתוך צלחת פטרי.באמצעות מים עם ביצים, ניתן לקבץ מחדש את הדגים במכלי תרבית גדולים יותר כדי להפיק סבבים נוספים של ביצים להזרקה. יש להתאים את תזמון איסוף הביצים כדי לאפשר הפקה של מספר הביצים המקסימלי, מבלי לתת להן לעבור את שלב התא הבודד. לבסוף, יש להניח זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ במכסה ההפוך של צלחת פטרי בנפח 100 מילימטר.השתמשו בפיפטת העברה כדי לסדר את הביצים בצמוד לדופן השريחה כך שייווצר טור יחיד, ולאחר מכן הסירו את עודפי מי הביצים מהשريחה על ידי לחיצת נייר Kim wipe לצד הנגדי לביצים. כעת, נכין את מחטי המיקרו-הזרקה באמצעות מותח קפילרות (micro pipette puller). נמתח קפילרה מזכוכית בעלת קוטר חיצוני של 1 mm לשתי מחטים ונשמור מחטים אלו בצלחת פטרי בקוטר 150 mm. ניתן למתוח את המחטים מראש על ידי הנחתן על גבי רמפות של silly putty.אנו משתמשים בהגדרות הבאות. Heat 6 45 pole 60 velocity 80. טענו את הקצה הרחב של המחט עם שלושה µL של חומר ההזרקה באמצעות פפיפט טעינה מיקרוסקופית (micro loader pipette).נער את הבולוס לכיוון חוד המחט עד שיישארו מעט בועות או שלא יישארו בועות כלל. כעת, נפעיל את מקור האוויר ואת המיקרו-מזרק. הכנס את המחט לתוך המיקרו-מזרק וודא שהיא אטומה היטב בתוך המארז.בדקו שהמיקרו-מניפולטור נמצא במיקום נכון המאפשר טווח רחב של תנועה וכיוונון. הביאו את קצה המחט למישור הראייה של המיקרוסקופ. הרימו אותה מעל הבמה ומקדו את המיקרוסקופ על האזור הדק ביותר של הקצה.השתמשו בזוג פינצטות חדות כדי לקטום את המחט בנקודה שתשאיר את המחט צרה מספיק כדי לחדור את ה-chorion והחלמון, אך עדיין מסוגלת להשריץ טיפה בגודל עקבי. כדי לחשב את הנפח של כל הזרקה, נשתמש בטיפת שמן מינרלי על מיקרומטר, נחדיר את המחט אל השמן ונלחץ על דוושת הרגל כדי להזריק טיפה של תמיסה לתוך השמן. עקבו אחר גודל הטיפה תוך כדי קיטום המחט וכיוון לחץ ההזרקה במידת הצורך בעת ההזרקה לשמן.חריץ בעל קוטר של 0.1 מילימטר מכיל 500 picoliters של חומר הזרקה. בדרך כלל נעשה שימוש בנפחי הזרקה של 500 picoliters או ננוליטר אחד. נפחי הזרקה אידיאליים ימלאו כ-10% מנפח הביצה.איכות חוד המחט היא קריטית הן לנוחות ההזרקה והן לאיכות ולעקביות של התוצאות. כעת הגיע הזמן להזריק כדי להתחיל בהליך ההזרקה. ודאו שהעוברים לא התפתחו מעבר לשלב ארבעת התאים.רצוי שהעובר יהיה בשלב התא הבודד. לאחר מכן, הרד את המחט לעבר עמודת הביצים, חדר את פני השכבה החיצונית של ה-corion והחדר אותה אל תוך החלמון בתנועה חלקה אחת תוך כדי צפייה. בכל מקרה של מעיכה או קרע של שק החלמון, הזרק את חומר ההזרקה אל תוך החלמון.הימנעו מהזרקת בועות אוויר והיו ערניים לעוברים שנפגעו באופן גלוי מההזרקה לאורך השורה. התאימו את הלחץ במידת הצורך כדי לשמור על גודל חרוז עקבי, ובעזרת טיפ של פיפטה, הסירו ביצים שנראות כבלתי מופרות או כאלו שנהרסו במהלך תהליך ההזרקה. לאחר השלמת עמודה של ביצים, השתמשו בזרם עדין של מי ביצים כדי להעביר את הביצים המוזרקות לכלי Petri נקי וחזרו על הפעולה לפי הצורך.שמרו מספר עוברים שלא הוזרקו כביקורת. מאוחר יותר במהלך היום הראשון, הסירו עוברים מתים ורשמו את מספר העוברים שהוזרקו. החליפו את מי הביצים בצלחת מדי פעם כדי להפחית את הסיכון לזיהום.שימו לב כי בהתאם לחומר המוזרק, עשוי להיות שיעור הישרדות נמוך יותר של העוברים בהשוואה לאחיהם שלא הוזרקו. למרבה המזל, קל להזריק מספרים גדולים מאוד של עוברים, ולכן הדבר כמעט ואינו מהווה בעיה. כעת נציג מספר תוצאות מייצגות הן של הזרקת morpho והן של mRNA.הבקרה שלא הוזרקה בנקודת זמן של 48 שעות לאחר ההפריה נראית תקינה כצפוי. עם זאת, עוברים שהוזרקו עם ה-morpho HG E three i three eeg FFR one, המדכא איזופורמים של HG המכילים את הראשון מבין שני החזרות דמויי EEG, מראים בצקת מוחית; הזרקה של mRNA של heart glass הובילה גם היא לפנוטיפ ברור ב-24 שעות לאחר ההפריה.הראשים של בישקרי הביקורת שלא הוזרקו נראו נורמליים. לעומת זאת, חלק מהעוברים שהוזרקו ב-M NNA הראו אופיאס (opia). הרגע הצגנו בפניכם כיצד הזרקה של מורפולינוס או mRNA במהלך שלב התא הבודד יכולה להגביר או להפחית את הביטוי של גנים ספציפיים במהלך התפתחות מאוחרת יותר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שגם.ריכוז גבוה של mRNA או של morpho עלול לגרום לתמותה לא ספציפית בעוברים עם ה-morpho. יש לבחון כל אחד מהם באופן אמפירי, אך בדרך כלל ריכוזים שבין 200 ל-500 micromolar גורמים להשתקה (knockdown) ספציפית של פעילות הגן מבלי לגרום לתמותה כללית. וזהו.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

תאים מתים נמתחים מרקמות אפיתל על ידי התכווצות מתואמת של תאים שכנים מבלי לשבש תפקוד מחסום. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטות לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל ברזולוציה הסלולר.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה למניפולציה של ביטוי גנים בתאי חדריות של telencephalon דג הזברה המבוגר באמצעות oligonucleotides morpholino antisense. אנו מציגים שיטה זו כפרוטוקול יעיל ומהיר שיכול לשמש למחקרים תפקודיים במוח החולייתנים המבוגר.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

מניפולציה אופטוגנטית של מסלולי איתות יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לחקור כיצד איתות מפוענח בהתפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש במפעילי איתות מסוג Nodal וחלבון מורפוגני עצם (BMP) מבוססי חישת אור-חמצן בעובר המוקדם של דגי הזברה.

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

בסרטון הזה, Nijole Jasinskiene ממחישה את המתודולוגיה מועסק כדי ליצור מהונדס Aedes aegypti היתושים, אשר הם וקטורים עבור קדחת דנגה. טכניקות נכונה עבור הכנת מחטים microinjection, dessicating עוברים, וביצוע microinjection הם הפגינו.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

למדו טכניקת מיקרו-הזרקה לעוברי דג זברה בשלב התא הבודד לחקר פונקציית גנים. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות של knockdown או overexpression על התפתחות עוברית ב-Danio rerio.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג'ין

גלה סרטונים נוספים