Name: בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: למדו את שיטת בידוד איי לבלב אנושיים באמצעות עיכול אוטומטי של רקמת הלבלב. שיטה זו מאפשרת קבלת איי לבלב באיכות גבוהה להשתלה קלינית מוצלחת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמכים על ידי מימון מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, כמו גם משאבים איילט Cell מרכז NIH מענק (RFA-RR 05-003), קרן כריסטופר, קרן Efroymson, וקרן Tellabs.

1. מתקן התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד איון אדם היא הליך רגיש הזמן הכרוך בעבודת צוות, ומכאן, ארבעה בני אדם יש צורך לנהל הליך זה. הקבוצה היא להוביל על ידי המנתח, אשר מנתח ו cannulates את הלבלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבידוד איון מתחיל ברגע הצוות נכנס למתקן UIC בידוד איון. חברי הצוות להבטיח כי כל המכשור הדרוש, כמו צנטריפוגה, הוא בדק מופעלת. הם גם דואגים לטהר את כל ברדסים ומשטחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני אנשים יהיה להגדיר את הטבלה cannulation, מכונת ברד, מעגל העיכול, יחידת זלוף, מכונת טיהור COBE, ושולחנות כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, שני חברי צוות אחרים יכין התקשורת כי יש צורך במהלך הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, צינורות בקטריולוגיה (בקבוקים, צינור, הטופס שקית), צינורות דגימה (טרום מלא לשטוף), צינורות הערכה וצלחות מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הצינור טיהור להגדיר כדלקמן: 1 שפופרת ריק מסומן ב 150 מ&quot;ל, צינורות 2-12 מלא 200 מ&quot;ל של M199 התקשורת בתוספת (פתרון לשטוף) אלבומין אנושי ומסומן ב 230 מ&quot;ל, ולבסוף אחד 50 מ&quot;ל צינור חרוטי מלאות 50 מ&quot;ל של תמיסת לשטוף. לאחר השלבים הושלמו ההכנות אנחנו מוכנים להתחיל בהכנת המרוססת את הלבלב. </li></ol> 2. לבלב הכנה זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל הכנה זלוף של הלבלב, מפעיל מסיר את איבר מן האריזה באמצעות טכניקה סטרילית. המנתח תעביר את הלבלב לשולחן טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנתח יהיה למלא את אחד 60 מ&quot;ל מזרק עם הפתרון המקורי שימור הלבלב לעומת זאת למפעיל, מי יהיה להשתמש בו כדי למלא מוכן &quot;רכש&quot; בקבוקים בקטריולוגיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בדיקה ויזואלית כדי לקבוע אם איבר מתאים בידוד איון (אם הלבלב נפגע במהלך הרכש או חריג מבחינה אנטומית, זה לא יכול לשמש לבידוד איון), המנתח יבקש מפעיל להכין collagenase. זכרו כי הזמן מחדש ההשעיה משתנה בין המותגים אנזים והרבה שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המנתח מוכן, להביא את פתרונות טיהור (בבטאדין, Fungizone / Cefazolin ו HBSS) לשולחן טיהור ויוצקים אותם לתוך המכולות המתאימות. המנתח מבצע טיהור הלבלב כביסה לרגע את הלבלב בכל פתרון טיהור. הלבלב ממוקם אז בצנצנת סטרילית קטן שבו יהיה שקל. לאחר משקל ברשומה אצווה, הלבלב ממוקם במחבת cannulation עם פתרון כמה לשימור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנתח יחשוף באופן חלקי לחתוך את צינור הראשי cannulate כל חצי של הלבלב עם הצינורית. הצינורית יהיה מאובטח על ידי תפר. כדי perfuse הלבלב, תחילה להעביר אותו ליחידה זלוף ויוצקים את הפתרון האנזים לתוך הכיור. זמן זלוף סה&quot;כ כ 10 דקות, 80 מ&quot;מ כספית במשך 5 דקות, ולאחר מכן ב 180 מ&quot;מ כספית במשך 5 דקות. לבלב נפוחה לאחר זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הלבלב perfused לסיר cannulation, שבו רקמת שומן חיתוך מהלבלב בזהירות. ואז לחתוך את הלבלב לתוך 10-12 חתיכות להעביר Ricordi לשכת לעיכול. </li></ol> 3. הלבלב לעיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל צעד העיכול, להעביר את הלבלב אל לשכת Ricordi ריקה, להוסיף 2.5 מ&quot;ל בבקבוקון של Pulmozyme, לשים על המסך (למנוע נתח גדול של גוש הרקמה קאמרית), לסגור את החדר, ולמלא את המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל שאיבה הפתרון במשך 5 דקות. בעדינות את הסלע קאמרית כדי לפזר באופן שווה פתרון חמים לאורך כל הדרך. אחרי חמש דקות, בעדינות לנער את החדר עבור השלב העיכול כולו. שמירה על טמפרטורה ב 37 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסלע קאמרית בעדינות עד הטמפרטורה מגיעה ל 37 מעלות, ואז ללחוץ את החדר. קח דוגמה כל שתי דקות לזהות אם איים חינם נמצאים תחת היקף. תעדו את המידע הערכה איון בטבלה העיכול של הרשומה אצווה. המשך לעקוב אחר אחוז עד איים יש 50% מהם צף חופשי מבודד הפתרון. </li></ol> 4. רקמות אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 50% איים נמצאים חופשי בדגימות, עיכול הוא נעצר על ידי הוספת קר פתרון RPMI דילול במעגל. רקמות נאסף 500 מ&quot;ל צינורות חרוטי טרום מלא 30 מ&quot;ל אלבומין אדם. לאחר הצינורות הם הסתחררו, היניקה את supernatant לשטוף את הכדור עם פתרון לשטוף קר. ספין צינורות חרוטי ב 1100 סל&quot;ד (סיבובים לדקה) עבור 1 דקה, 4 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל צינורות האיסוף תלוי עם רקמת לבלב מעוכל לתוך יחידה 500 מ&quot;ל חרוטי. כאשר צינור מלא של רקמות שטף, ספין לחזור על התהליך עד שכל רקמת כביסה נחפף מספר פעמים. ספין זה צינור העברת רקמות לתוך צינור אחד מ&quot;ל 250 חרוטי. תביאו את נפח של עד 250 מ&quot;ל עםM199 פתרון כביסה בתוספת HA ולהתכונן הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דוגמה 1 מ&quot;ל עם טפטפת ולהוסיף צינור מ&quot;ל 15 חרוטי מראש מלא 9 מ&quot;ל של תמיסת לשטוף. ואז לערבב ידי צינור חרוטי היפוך בעדינות 15 מ&quot;ל ומתוך זה, מתוך מדגם 1ml ישירות לתוך צלחת רשת סופר. ספירת תאים, לחשב את מספר הסלולרי באמצעות גורם לדילול של 2500 (10x250). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הצינור 250 מ&quot;ל חרוטי ולהוסיף 150 מ&quot;ל של UW (אוניברסיטת ויסקונסין) פתרון שבדרך כלל להשתמש לשימור איברים. כאשר UW הוא הוסיף, לערבב את ההשעיה התא ביסודיות בעזרת פיפטה. שיא ולתקשר למפעיל טיהור הזמן להתחיל UW. השאירו את הצינור (ים) על הקרח מערבולת מדי פעם. עכשיו איים ניתן מטוהרים נוספת. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

ישנם מגוון גורמים המשפיעים על התוצאה בידוד 9,10. ביניהם, עיכול של רקמת הלבלב תפקיד בולט. בהתבסס על הניסיון שלנו איון אדם בבידוד, סיכמנו הבאים נקודות קריטיות, אשר עלול להשפיע על איכות תשואה איון ו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן עיכול שונה, כאשר סוגים שונים של אנזימים מנוצלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע 40-50% של איים המופרדים לגמרי מן הרקמה acinar, העיכול יש להפסיק באופן מיידי על ידי הוספ...

<table><tbody><tr><td>מכונת קרח גרוס (Ice Slush Machine)</td><td>ציוד</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>הכנת קרח סטרילי</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ציוד</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1</td><td>ציוד</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים עם רשת של 2 mm</td><td>ציוד</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>ספירת איים (islets)</td></tr><tr><td>אמבט מים דיגיטלי EX7</td><td>ציוד</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>מד חום</td><td>ציוד</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>מאזניים MonoBloc Balance AB 104-S</td><td>ציוד</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>מדידת משקל הלבלב</td></tr><tr><td>בקר מהירות MasterFlex II Speed Controller</td><td>ציוד</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>כיוון מהירות הזרימה במהלך העיכול</td></tr><tr><td>מערכת תצפית דיגיטלית Digital Sight DS L1</td><td>ציוד</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>יחידת פרפוזיה</td><td>ציוד</td><td>Custom Made</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>קירור ליחידת הפרפוזיה</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>תא ריקורדי (Ricordi Chamber)</td><td>ציוד</td><td>University of Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת דילול RPMI</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אוניברסיטת ויסকনסין (UW)</td><td>ריאגנט</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלחים עם בופר של Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין אנושי 25%</td><td>ריאגנט</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>מדיום M199 (תמיסת שטיפה)</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase NB1 בדרגת GMP</td><td>ריאגנט</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Protease NB1 בדרגת GMP</td><td>ריאגנט</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>בטאדין (Betadine)</td><td>ריאגנט</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>צפזולין (Cefazolin)</td><td>ריאגנט</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>דיתיזון (Dithizone)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

ניהול של סוכרת מסוג 1 היא מעיקה, הן הפרט והחברה, עולה מעל 100 מיליארד דולר בשנה. למרות השימוש הנרחב של ניטור גלוקוז אינסולין ניסוחים חדשים, אנשים רבים עדיין לפתח סיבוכים משניים הרסנית. איון השתלת הלבלב יכול לשחזר ליד בקרת גלוקוז נורמלי אצל חולי סוכרת<sup&gt; 1</sup&gt;, בלי הסיכון של התקפי היפוגליקמיה חמורים הקשורים בטיפול אינטנסיבי באינסולין. מתן המוני איון מספיק חשוב איון השתלה מוצלחת. עם זאת, מאפיין התורם, רכש איברים ושימור להשפיע על התוצאה בידוד<sup&gt; 2</sup&gt;. באוניברסיטת אילינוי בשיקגו (UIC) פיתחנו פרוטוקול בידוד מוצלח עם שיפוע טיהור משופרת<sup&gt; 3</sup&gt;. התוכנית החלה בינואר 2004, ויותר מ -300 isolations בוצעו עד נובמבר 2008. Pancreata נשלחו בקור פתרונות שימור (UW, אוניברסיטת ויסקונסין או HTK, היסטידין-טריפטופן Ketoglutarate)<sup&gt; 4-7</sup&gt; אל המעבדה תא בידוד בבית UIC לבידוד איון. איי הלבלב בודדו בשיטת UIC, שהיא גירסה שונה של השיטה המתוארת במקור על ידי Ricordi<em&gt; ואח&#39;</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. בקצרה, לאחר ניקוי הלבלב מן הרקמה הסובבת, זה היה perfused עם פתרון אנזים (Serva collagenase + ניטרלי פרוטאז או סיגמא האנזים V). הלבלב נפוחה ואז הועברה לתא העיכול Ricordi, המחובר שונה, מערכת הדם בצינור סגור, וחיממה עד 37 ° C. במהלך העיכול, החדר היה מזועזע בעדינות. דוגמאות נלקחו ברציפות כדי לפקח על התקדמות העיכול. לאחר איים חינם התגלו מתחת למיקרוסקופ, את מערכת העיכול נעצר על ידי שטיפה קר (4 ° C) RPMI פתרון הדילול (Mediatech, הרנדון, VA) לתוך מערכת הדם לדלל את האנזים. לאחר שנאספו לרחוץ M199 התקשורת בתוספת אלבומין אדם, רקמת נדגמה עבור לספור טיהור טרום מודגרות עם פתרון UW לפני הטיהור. תהליך טיהור שיפורט בחלק ב &#39;: טיהור והתרבות של איי האדם.

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון האדם הלבלב (אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב) בשיטה אוטומטית שונה.

ניהול של סוכרת מסוג 1 הוא מעמסה, הן עבור הפרט והן עבור החברה, ועלותו עולה על 100 מיליארד דולרים בשנה. למרות השימוש הנרחב ב...

נוהל זה מתחיל בהשגת רקמת לבלב מתורם בריא. לאחר שלב קיצור קצר, הלבלב המורחב נחתך לחלקים שווים ומועבר לתא העיכול. הלבלב עובר קנולציה, ותמיסת קולגנאז מוזרקת דרך הקנולה באמצעות מכונת פרפוזיה אוטומטית.לבסוף, רקמת הלבלב נאספת למבחנות קוניות בנפח גדול, ובסופו של דבר מטוهرة עוד יותר לצורך השתלת איים, דבר שיוצג בסרטון הבא. שלום, אני American Chief מהמעבדה של תוכנית האיים האנושיים במחלקה לסקר באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. שלום, שמי ברברה ברברו ואני גם חלק מתוכנית האיים האנושיים.היום נציג בפניכם הליך לבידוד איים מהלבלב האנושי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להפיק איים אנושיים באיכות גבוהה לשימוש קליני. בואו נתחיל.בידוד איים של לנגר (eyelet) אנושי הוא הליך רגיש לזמן הדורש עבודת צוות, ולכן נדרשים ארבעה אנשים לביצועו. את הצוות מוביל המנתח, המבצע את הניתוח ואת הקניולציה של הלבלב. בידוד האיים מתחיל ברגע שהצוות נכנס למתקן לבידוד איים של UIC.חברי הצוות מוודאים שכל המכשור הדרוש, כגון הסנטריפוגה, נבדק והופעל. כמו כן, הם דואגים לחיטוי כל המנדפים והמשטחים. שני אנשים יכינו את שולחן הקנולציה, מכונת העיכול של השלג (slush machine), את מעגל הפרפוזיה, את מכונת טיהור היחידה (unit cope purification machine) ואת שולחנות הניתוח.במקביל, שני חברי צוות נוספים יכינו את המצעים הדרושים במהלך הבידוד. לאחר מכן, מוכנים מבחנות בקטריולוגיה, מבחנות דגימה ומבחנות ופלטות להערכה. הכינו את סט מבחנות הטיהר לפי הסדר הבא: המבחנה הראשונה ריקה ומסומנת ב-150 milliliters.מבחנות 2 עד 12 מולאו ב-200 milliliters של M1 99. מצע מועשר באלבומין אנושי או בתמיסת שטיפה שסומן ב-230 milliliters. ולבסוף, מבחנה קונוית אחת של 50 milliliter מולאה ב-50 milliliters של תמיסת שטיפה.לאחר השלמת שלבי הכנה אלו, ניתן להתחיל בהכנה ובפרפוזיה של הלבלב. כדי להתחיל בהכנה ובפרפוזיה של הלבלב, המפעיל מוציא את האיבר מהאריזה. תוך שימוש בטכניקה סטרילית, המנתח יעביר את הלבלב לשולחן הדקונטמינציה.המנתח ימלא מזרק אחד של 60 cc בתמיסת שימור הלבלב המקורית וימסור אותו למפעיל, אשר ישתמש בה כדי למלא בקבוק Bacteriology מוכנים לדגימה. לאחר בדיקה חזותית כדי לקבוע אם האיבר מתאים לבידוד איים, המנתח יבקש מהמפעיל להכין קולגנז (collagenase) כיום. הכנה היא תהליך שגרתי.אם הלבלב נפגע במהלך ההשגה או אם הוא חריג מבחינה אנטומית, לא ניתן להשתמש בו לבידוד איים. זכרו שזמן ההשהייה בתמיסת ה-Resus משתנה בין מותגים ואצוות שונות של אנזימים. כאשר המנתח מוכן, הביאו את תמיסות הדה-קונטמינציה לשולחן הדה-קונטמינציה ומזגו אותן למכלים המתאימים.המנתח יבצע דה-קונטמינציה של הלבלב על ידי שטיפת הלבלב למשך דקה אחת. לאחר מכן, בכל אחד מתמיסות הדה-קונטמינציה, יוצב הלבלב בתוך צנצנת סטרילית קטנה שבה הוא יישקל. לאחר הזנת המשקל לרשומת האצווה, יונח הלבלב במגש הקנולציה.באמצעות תמיסת שימור מסוימת, המנתח יחשוף ויבצע חתך חלקי בתעלה הראשית, ויבצע קניולציה של כל חצי של הלבלב באמצעות קניולה המאובטחת בתפר כדי לבצע פרפוזיה ללבלב. ראשית, העבירו אותו ליחידת הפרפוזיה ושפכו את תמיסת האנזימים לאגן. זמן הפרפוזיה הכולל הוא כ-10 דקות, כאשר למשך חמש דקות הלחץ הוא 80 millimeters of mercury.לאחר מכן, בלחץ של 180 מילימטרים של כספית למשך חמש דקות, הלבלב ייראה מתוח. לאחר הפרפוזיה, העבירו את הלבלב שעבר פרפוזיה לאגנית הקנולציה, שם יש להסיר בזהירות את הרקמה השומנית מהלבלב. לאחר מכן, חתכו את הלבלב ל-10 עד 12 חלקים והעבירו אותם לתא ההקלטה לצורך עיכול.כדי להתחיל את שלב העיכול, העבירו את הלבלב לתא הרישום הריק. הוסיפו בקבוקון של 2.5 מיליליטר של Pulmozyme המוצב על המסך, תוך הקפדה להימנע מחסימת התא, סגרו את התא ומלאו את המערכת. התחילו בשאיבת התמיסה למשך חמש דקות.נענעו בעדינות את התא כדי לפזר את התמיסה החמימה באופן שווה. לאחר חמש דקות, נערנו בעדינות את התא לאורך כל שלב העיכול. שמרו על הטמפרטורה ב-37 degrees Celsius.יש לקחת דגימה בכל שתי דקות ולבדוק תחת המיקרוסקופ אם נמצאו עין-עכביש (eyelets) חופשיות; יש לתעד את נתוני הערכת ה-eyelets בטבלת העיכול של רשומת הסדרה (batch record). המשך לנטר את אחוז ה-eyelets עד ש-50% מהם צפים באופן חופשי ומבודד בתמיסה. ברגע שנמצאו 50% מה-eyelets חופשיים בדגימות, יש להפסיק את העיכול על ידי הוספת תמיסת דילול RPMI קרה.את רקמת המעגל אוספים לתוך מבחנות קוניות בנפח 500 מיליליטר הממולאות מראש ב-30 מיליליטר Human albumin. סובב את המבחנות הקוניות במהירות של 1100 RPM למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר סבב הצנטריפוגה של המבחנות, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את המשקע. באמצעות תמיסת שטיפה קרה, רכזו את כל מבחנות האיסוף המכילות רקמת לבלב שעברה עיכול אל תוך מבחנה קונית אחת בנפח 500 milliliters. כאשר מבחנה מתמלאת ברקמה שטופה, סובבו אותה בצנטריפוגה וחזרו על תהליך השטיפה עד שכל הרקמה תשטף מספר פעמים.סובב את המבחנה והעבר את הרקמה למבחנה קונית אחת בנפח 250 milliliters. השלם את הנפח ל-250 milliliters באמצעות תמיסת שטיפה M1 99, המועשרת באלבומין אנושי, והכן לדגימה. קח דגימה של one milliliter באמצעות פיפטה והוסף אותה למבחנה קונית בנפח 15 milliliters הממולאת מראש ב-nine milliliters של תמיסת שטיפה.לאחר מכן ערבבו על ידי הפיכה עדינה של מבחנה קונית בנפח 15 milliliter. מתוך דגימה זו העבירו one milliliter ישירות לצלחת ספירה עם סריג. ספרו את התאים וחשבו את מספר התאים.בשימוש במקדם דילול של 2,500, סובבו את המבחנה הקונית בנפח 250 מיליליטר והוסיפו 150 מיליליטר של תמיסת uw. University of Wisconsin. עם הוספת ה-UW, ערבבו היטב את תגלוסול התאים באמצעות הפיפטה, רשמו והודיעו למפעיל הניקוי.זמן ההתחלה ב-uw. השאירו את המבחנות על קרח וסובבו אותן מדי פעם. כעת ניתן לטהר את האיקלטים (eyelets) עוד יותר בשלב זה, ונדגיר דגימה מרקמה לבלבית שאינה מטהרת לצורך ספירה.כאשר מוסיפים תמיסת dione לדגימה, רק אוכלוסיית האיים תצבע באדום. לאחר מכן ניתן להעריך את איכותם וכמותם. הדגמנו כעת פרוצדורה לבידוד מספר גבוה של איים לבלב אנושיים באיכות גבוהה, דבר החשוב להצלחת השתלת איים.בהתבסס על ניסיוננו, ברגע ש-40 עד 50% מהאיליטים (eyelets) האנושיים משוחררים מהרקמה הפנימית המקיפה אותם, עלינו להפסיק את העיכול במהירות האפשרית על ידי דילול וקירור של תערובת העיכול. חשוב להוביל את הרקמה בעדינות במהלך האיסוף, השטיפה והערבוב. אנו ממליצים להשתמש בשיטת הטיהור של אוניברסיטת שיקגו, המניבה התאוששות מעולה של איליטים אנושיים בדרגת טוהר גבוהה.שיטה זו קיצרה באופן משמעותי גם את זמן הבידוד, מה שימזער את הפגיעה כתוצאה מאיסכמיה באיי הלבלב. זהו כל הפרוטוקול. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

human-pancreatic-islet-isolation-part-i-digestion-collection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון הלבלב האנושי (חלק II: טיהור והתרבות של איים אדם) באמצעות שיטה אוטומטית שונה.

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

אספקת 2 איים סוכרת סוג למחקר אינה מספיקה. כאן אנו חולקים פרוטוקול שלנו לבידוד איים של חולים שעברו pancreatectomy חלקית. גישה זו מהווה מקום מפגש ייחודי לקבלת איים של סוכרת מסוג 2 שאינם מתאימים קלינית סוכרת הנושאים במספרים נאותה מחקרים בסיסיים וקליניים.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

איי הלבלב, המכונים גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצר הורמונים לוויסות גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. פרוטוקול זה מסביר שיטה לבידוד איי הלבלב על ידי החדרת קולגנאז תחילה דרך אמפולה של Vater כדי לעכל את רקמת הלבלב האקסוקרינית וצנטריפוגה הדרגתית צפיפות פשוטה כדי לטהר את האיים מעכברים.

בידוד איי הלבלב באמצעות זילוח Collagenase: שיטה אנזימטית לבידוד תאי איון הלבלב

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

תאים מטאפלסטיים של הלבלב הם מבשרי תאים ממאירים המעוררים גידולים בלבלב. עם זאת, בידוד תאי לבלב שלמים הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לדיסוציאציה של רקמת הלבלב. התאים יכולים לשמש לריצוף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) או לתרבית משותפת דו-ממדית או תלת-ממדית.

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור גרדיאנט צפיפות של איי הלבלב של עכברוש לואיס, המאפשר הכנות בעלות תפוקה גבוהה וטוהר לשימוש ישיר בהשתלות או במחקרים במבחנה .

בידוד וטיהור איי הלבלב מחולדות לואיס באמצעות עיכול אנזימטי והפרדה בין צפיפות לגרדיאנט

למדו את שיטת בידוד איי לבלב אנושיים באמצעות עיכול אוטומטי של רקמת הלבלב. שיטה זו מאפשרת קבלת איי לבלב באיכות גבוהה להשתלה קלינית מוצלחת.

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

גלה סרטונים נוספים