ניטור הורמונים צמחיים במהלך התגובות מתח

הליך זה מתחיל בהומוגנציה של חומר צמחי באמצעות חרו지를 קרמיקה ולאחר מכן במיצוי בדיכלורומתאן כדי להשיג את הפאזה האורגנית. לאחר סבוב בצנטריפוגה, הדגימות מיובשות באוויר ומוכנות למיצוי בפאזת האדים. לאחר שטיפה (elution) ממסנני מיצוי פאזת האדים, ניתן להמשיך לאנליזה של הורמוני צמחים באמצעות ספקטרומטריית מסות וכרומטוגרפיה של גזים.

שלום, אני מארי אנגלברג ממעבדת ג'ו אנגלברג במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת טקסס כאן בסן אנטוניו, ואני ג'ו אנגלברג. היום נראה לכם פרוצדורה פשוטה לכימות סימולטני של הורמונים חשובים בצמחים. אנו משתמשים בשיטה זו באופן שגרתי כדי לעקוב אחר שינויים בהורמונים אלו בצמחים תחת השפעת נגיסות חרקים.

אנו יכולים גם לנטר שינויים בהרכב החומצות השומניות. לכן, בואו נתחיל. לצורך המיצוי, עליכם להכין תחילה מבחנות עם פקק הברגה בנפח של שני מיליליטרים.

כדי לבצע זאת, הוסיפו למבחנה 400 microliters של תמיסת מיצוי ו-10 microliters של התקן הפנימי המתאים בריכוז של 10 nanograms per microliter. לאחר מכן, הקפיאו את המבחנות בחנקן נוזלי. לאחר ההקפאה, הוסיפו למבחנות את חרוזי הקרמיקה.

בעוד שהמבחנות עדיין ממוקמות בחנקן נוזלי, הוסיפו בין 50 ל-200 מיליגרם של חומר צמחי. יש לזכור כי יש להעריך את משקל החומר הצמחי שהוסף לפני המשך העיבוד כדי לאפשר כימות מדויק מאוחר יותר, המבוסס על המשקל הרענן. ודאו שכל החנקן הנוזלי התאדה לפני סגירת המבחנה היטב עם פקק.

וודאו שלמכסה יש אטם גומי למניעת דליפה של ממסים ותרכובות מופקות במהלך ההומוגניזציה. בצעו הומוגניזציה לרקמה במטחנת חרוזי FastPrep או PSU. עבור מכשיר PSU, הפעילו את ההומוגניזטור במהירות של 6,000 למשך 30 שניות.

לאחר ההומוגניזציה, הוצא את המבחנות מההומוגנייזר באופן פרטני ופתח בזהירות את המכסה כדי להוסיף מיליליטר אחד של di chloral methane לכל דגימה, סגור שוב את המבחנות היטב ובצע הומוגניזציה למשך 10 עד 15 שניות במהירות של 6,000. לאחר ההומוגניזציה, העבר את המבחנות לצנטריפוגה שולחנית והפרד את הפאזה האורגנית מהפאזה המימית במהירות של 10,000 ×g למשך 60 שניות. לאחר הפרדת הפאזות, העבר את השכבה הירוקה התחתונה מהמבחנות הפרטניות למבחנה זכוכית נקייה בנפח של ארבעה מיליליטר.

זהו השלב האורגני המכיל את ההורמונים ואת התקנים הפנימיים. כדי למנוע העברה של מים או של השלב העליון, השתמשו באוויר דרך סבב (manifold) כדי לה 날אט את הממס למשך כ-10 עד 25 דקות. משך הזמן יהיה תלוי בדגימה.

בדקו בעזרת קצה של זרימת אוויר (airflow tip) בודד כדי לראות בזהירות אם הדגימות יבשות. הקפידו לא לייבש את הדגימות יותר מדי, שכן הדבר עלול לגרום לאובדן של תרכובות. לאחר שהדגימות יובשו, ניתן להתחיל במתילציה של התרכובות המכילות חומצה קרבוקסילית בדגימות שלנו.

ראשית, הוסיפו לכל מבחנה 100 microliters של תערובת D ethyl ether ומתנול ביחס נפחי של תשעה לאחד. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה microliters של תמיסה ריכוזה שניים molar של trimethyl Cyl Diaz methane בתוך hexane. סגרו מיד את המבחנות עם פקק הברגה פתוח המצויד במחיצת סיליקון מצופה Teflon, נערה את המבחנות בעדינות והדגירה בטמפרטורת החדר למשך 25 עד 30 דקות.

הפעילו בלוק חימום וכוון אותו לטמפרטורת האיסוף הרצויה. נדיפותם של התרכובות הממותילתן תשתנה בהתאם לגודלן ולמספר הקבוצות הפולריות שבהן. הטמפרטורות יכולות לנוע בין 80 ל-200 מעלות. לאחר דגירה של 30 דקות, הפסיקו את תגובת המתילציה על ידי הוספה של ארבעה µL של תמיסת חומצה אצטית ריכוז 2 M ב-hexane לכל מבחנה.

פעולה זו מבוצעת כדי למנוע תגובה משנית לא רצויה. המסננים המשמשים למיצוי פאזת האדים הם בעבודת יד. הם עשויים מצינורות טפלון.

מצד אחד, מוכנסת צינורית זכוכית המותאמת היטב באורך של כארבעה סנטימטרים. ניתן לראות את שתי הדיסקיות של רשת פלדת אל-חלד, המחזיקות כ-20 עד 30 מיליגרם של חומר סופח. שטפו את המסננים שישמשו לאיסוף ההורמונים הצמחיים הממתילתיים והנשאלים באמצעות 200 µL של מתנול.

בשלב הבא, שטפו את המסננים פעמיים עם 200 µL של dichloromethane. ייבשו כל מסנן באוויר כדי להסיר את השאריות של הממס. כעת ניתן להשתמש במסננים ללכידת הורמונים נתיפים באמצעות חילוץ משלב האדים.

לאחר 30 דקות של דגירה של הדגימות, נחתכים ספטא הגומי של מכסי המבחנות בנפח ארבעה מיליליטר באמצעות סכין מנתח. כעת החומר המופק מוכן לאיסוף של ההורמונים הצמחיים באמצעות מיצוי פאזה של אדי. המסננים הנקיים מחוברים לקווי ואקום נפרדים בקצב זרימה של כ-800 milliliters per minute.

לאחר מכן, מכניסים את המסננים לתוך הבקבוקון דרך המחיצות הגזורות. מכניסים גם קצה של פיפטה קטנה שישמש ככניסת אוויר. במהלך חלק זה של הפרוצדורה, יש להחזיק את הבקבוקונים עם המסננים המוחדרים במצב אנכי, כדי למנוע מכל נוזל בתוך הבקבוקון לבוא במגע עם קצה המסנן, דבר שיגרום לזיהום של המסנן.

ולבסוף, החזיקו את המבחנות עבור ה-GCMS ביד עד שכל הנוזל יתאדה דרך המסנן. לאחר מכן, הניחו את המבחנות עם המסננים המחוברים על גבי בלוק חימום, ואספו את התרכובות שהתאדו בחימום למשך שלוש דקות. לאחר שלב זה של מיצוי פאזה גזית סופי, הניחו את המבחנות כשהמסננים עדיין מחוברים אליהן על מעמד והמתינו שיתקררו.

הכינו מבחנות GC בנפח 1.5 מיליליטר המצוידות ב inserts כאשר המסננים הגיעו לטמפרטורת החדר. שוב, העבירו לולאה עם 150 מיקרוליטר של dichloromethane אל תוך המבחנות. לאחר נישוף שארית הממס מהמסנן, סגרו את המבחנות במכסה וכעת ניתן לנתח אותן באמצעות כרומטוגרפיית גז עם ספקטרומטריית מסות (GC-MS).

לצורך הניתוח, השתמשו בכרומטוגרף גזי המצויד במזרק עם מחלק (split injector) המחובר לספקטרומטר מסות הפועל במצב יינון כימי; לאחר ההזרקה, התרכובים מופרדים בעמודת HP-5MS ששומרה בטמפרטורה של 40 °C למשך דקה אחת. הטמפרטורה מתוכננת לעלייה של 15 °C לדקה עד ל-250 °C למשך 10 דקות, כאשר ההליום משמש כגז נשא בזרימה קבועה של 0.7 mL/min. עבור הניתוח מבוסס ה-MS, ניתן להשתמש בספקטרומטר מסות המבוסס על קוואדרופול או על מלכודת יונים כגז CI.

ניתן להשתמש באיזובוטאן או במתנול. עם זאת, בכל מקרה, יש לבדוק את השברים של תגובת היינון לפני יצירת תוכניות ספירת היונים הנבחרות. אנו משתמשים במערכת גז כרומטוגרף variant GC 3, 900 המחוברת לספקטרומטר מסות Saturn MS 2200, ובמתנול כריאגנט ל-CI.

אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב שלנו לתיאור התוכנית. ודאו שכל התרכובות מזוהות על ידי השוואה לסטנדרטים מסחריים אותנטיים הזמינים בשוק. כימות של JA SA ו-A BA מבוצע על ידי מתאם בין שטח הפסגה של היונים שהופרדו לבין שטח הפסגה של היונים שהופרדו של הסטנדרט הפנימי המתאים, והוא מבוסס גם על המשקל הרטוב של החומר הצמחי שנעשה בו שימוש.

לאחר חילוץ הנתונים מקובצי ה-GCM S וביצוע מספר חישובים, מצאנו כי האתין הוביל להצטברויות משמעותיות של חומצה סליצילית, חומצה מוניקה וכן חומצה אביקה בהשוואה לבקרה שלא טופלה. הנתונים עבור כל הורמון בודד נלקחו מהרצה אחת, והם מדגימים את יכולתה של שיטה זו לניתוח הורמונלי מרובה (multiplex). הצגנו בפניכם הליך פשוט אך יעיל לחילוץ ולכימות של הורמוני צמחים חשובים ותרכובים מאותתים אחרים.

התהליך קל לביצוע וניתן להכין בקלות את רוב הכלים שראיתם מחומרים סטנדרטיים של מעבדה. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.