Name: המצאה של Myogenic בונה רקמות מהונדסות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: למדו כיצד ליצור רקמות מהונדסות מיוגניות מבוססות קולגן עם תאי מיובלסט שלדיים לתיקון חסימת לב מלאה. השיטה מדגימה יצירת מוליך חשמלי דרכי לב לשימוש בחיות מודל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר מן המכון הלאומי לבריאות (HL068915; HL088206), פרס ניו חוקר מהקרן לחקר Thrasher, ותרומות לקרן הולכה לב בבית החולים לילדים בבוסטון.

חלק 1: להרכיב לבנות תבניות יציקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח לקצץ בחצי את צינורות סיליקון (VWR) ופצע אותו לתוך חתיכות 3 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של השתל כיתה RTV סיליקון דבק (Rhodia) על החלק הפנימי של צד של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום במהירות חתיכה קטנה (1 ס&quot;מ X 1 ס&quot;מ) של רשת פוליאסטר (מקמאסטר-קאר) על טיפת דבק סיליקון ליישר אותו עם סוף בצינור. זה יספק משטח מורם מעט ושטוח על הקובץ המצורף לבנות. חזור על הפעולה עבור הקצה השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לעצב את לייבוש בטמפרטורת החדר במשך 3 ימים. זה מועיל כדי להפוך 2-30 תבניות בו זמנית, כמו אלה הם חד פעמי במהותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דבק יבש לחלוטין, חנות אלה תבניות בכוס מלא אתנול 70% עד שהם נחוצים. צעד זה יעזור לעקר את תבניות המוצר המוגמר מוצג באיור 1. </li></ol> חלק 2: הכנה בידוד תא myoblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 1 מ&quot;ג Laminin (Sigma) ב 250 מ&quot;ל 0.22 מיקרומטר פילטר מעוקרים פוספט בופר סליין (PBS) המכילה 1% פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen) ו Fungizone 1% (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 מ&quot;מ רקמת סמל תרבות צלחות (BD Falcon) עם 4 מ&quot;ל של הפתרון Laminin בדילול משלב 1.1 ו דגירה ב-C º 37 במשך 4 שעות לפחות לפני ציפוי myoblasts השלד הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המדיום myoblast ידי ערבוב F-10 של הם תערובת מזין (סיגמא) עם FBS 20% (אטלנטה הביולוגיים), 5 ng / L פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (Promega), 1% פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen), ו Fungizone 1% ( Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון העיכול שריר השלד ידי המסת 1 גרם של ~ 295 U / מ&quot;ג collagenase 2 (וורטינגטון) ב 100 מ&quot;ל 2.4 U / mL Dispase-2 (Roche). הוסף 0.037 גרם CaCl 2 ומערבבים היטב. סנן לעקר את החיץ העיכול באמצעות דיסק 0.2 מיקרומטר לסנן מצויד על מזרק 10 מ&quot;ל ו aliquots חנות ב -20 ° C. מניחים את הסכום הדרוש לעיכול רקמת בשעה 37 ° C יחד עם התקשורת myoblast. </li></ol> חלק 3: בידוד Myoblast של שריר השלד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ומספריים קטנים, להסיר את השרירים paraspinal מן היילודים עכברושים מתים לואיס על ידי חיתוך לאורך הגב לאורך עמוד השדרה, לקלף את העור ואת השכבות fascia ואז מוציא את השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה, מקום השרירים נכרת בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל (BD פלקון) מלאות 40 מ&quot;ל הפתרון הנקס סולט 1X מאוזן (HBSS) (Invitrogen) על קרח. אפשר רצועות שריר להתיישב אל החלק התחתון של הצינור בזהירות להסיר את רוב שרידי נוזל הדם על ידי שאיבה עם ואקום סטרילית פיפטה פסטר במנדף תרבות (בייקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פיסות שריר שנקטפו על צלחת תרבות 150 מ&quot;מ להסיר כמה שיותר נוזלים הנותרים ככל האפשר עם יניקה. שימוש 2 יחיד פיפיות סכיני גילוח לקצץ את הרקמה להדביק עבה. יוצקים מראש חימם פתרון העיכול על להדביק את ולהעביר את התערובת צינור טרי 50 מ&quot;ל בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל. במהלך עיכול אנזימטי, הרקמה triturated מדי פעם (ללא מבעבע) עם פיפטה 10 מ&quot;ל מצויד על אלחוטי פיפטה-Aid (דראמונד). שוב, לאפשר לרקמות להתיישב ולהסיר את נוזל עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על פלטפורמת נדנדה ולעכל ב-C º 37 דקות בערך 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השריר נוזלי, להעביר את הפתרון דרך מסננת תא 70 מיקרומטר (BD Falcon) ו צנטריפוגות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 600 XG (Beckman GP). בעזרת פיפטה פסטר יניקה, להסיר כמה שיותר הנוזל ככל האפשר resuspend גלולה עם 10 מ&quot;ל של מדיום myoblast חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צלחת התאים על צלחת ציפוי 150 ברקמת התרבות מ&quot;מ במשך 15 דקות כדי לסייע להסיר fibroblasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לא מחוברים עדיין cultureware laminin מצופים ו לדלל כך יש אחד על כל צלחת 1-2 גורי חולדה. מניחים את הצלחת להגדיר חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol> חלק 4: יציקה בונה רקמות מהונדסות (5 מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1-2 ימים, להסיר 10 של 150 מ&quot;מ myoblast רקמות צלחות תרבות מן האינקובטור, לשטוף אותם פעמיים עם 37 ° C 1X PBS, ולהוסיף 4 מ&quot;ל של חם 0.05% טריפסין-EDTA על כל צלחת. החזר את הצלחות אל האינקובטור דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר myoblasts מנותקת צלחות למכסה המנוע תרבות לאסוף את הנוזל בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל (BD פלקון). השתמש 10 מ&quot;ל של מדיום myoblast לשטוף את כל הצלחות לשלב הזה עם התאים בצינור צנטריפוגות. גלולה התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 600 XG (Beckman GP) ולהסיר נוזל עודף כפי שמתואר בשלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים myoblast ב 1.6 מ&quot;ל של מדיום myoblast ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר בזהירות 4 תבניות לבנות משלב 1.5 ולשטוף אותם פעמיים עם 1X PBS. אבק שאיבה את כל עקבות של PBS עם פיפטה פסטר לפני הצבת כל עובש 6-היטב מ&quot;ק רקמהlture צלחת (BD פלקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ריאגנטים אחרים הדרושים להכנת לבנות (F10 חם של 10X, אנטיביוטיקה, קולגן סוג 1 [3.9 מ&quot;ג / מ&quot;ל] [6] Matrigel ™) על קרח ולשמור התקשורת myoblast ב 37 º C. מערבבים 500 μL 10X חם של F10, 100 פניצילין μL / סטרפטומיצין, 100 Fungizone μL, קולגן 1.6 מ&quot;ל, ו - 750 ™ Matrigel μL בתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. מערבבים את פתרון עבור 10 שניות באמצעות ה-Mini-Vortexer (VWR) מוגדר 10 ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להוסיף 80 μL של NaHCO 3 ואת השעיית myoblast משלב 3.3 לתערובת משלב 3.5. וורטקס את התערובת כולה במשך 10 שניות ולהחזיר את הצינור לדלי קרח למשך כמה דקות כדי לנקות את הפתרון של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפיל את התערובת לתוך תבניות לפני שהוא מתחיל לגבש בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל. עובש בכל תחזיק כ 1 מ&quot;ל של נוזל צמיג. נסו להימנע החדרת בועות אוויר במהלך הליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את הצלחת המכיל את בונה יצוק אל האינקובטור. לאחר 30 דקות ~, להסיר את המבנים הקרושה מן החממה בזהירות להוסיף בינוני myoblast כדי לכסות גם כל הרקמה לבנות. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור (איור 2). </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג כאשר בפרוטוקול זה מבוצע כראוי, לבנות myoblast המכילים רקמות מוכן ב ההשתלה vivo (כלומר כאשר יוסר עובש) או להמשך בניתוחים חוץ גופית לאחר 2 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure1.jpg" alt="" /> באיור 1. דוגמאות של תבניות לבנות הושלמה (ראה שלב 1.5). <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure2.jpg" alt="" width="400" height="321" /> איור 2. הקרושה myoblast המכילים רקמות לבנות [1]. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure3.jpg" alt="" /> איור 3. H &amp; E חלקים של רקמה צבעונית myoblast המכילים לבנות. &quot;A&quot; מתאר בסעיף האורך ו &quot;B&quot; מראה חתך.

<ol><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Blau, H. M., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human muscle cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).</li>
<li>Powell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+human+bioartificial+muscles+expressing+a+foreign+recombinant+protein+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Gallop, P. M., Seifter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Properties+of+Soluble+Collagens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Properties of Soluble Collagens.</a> Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש בבית החולים לילדים בבוסטון.

תבניות בו לבנות רקמות יהיה יצוק יכול להתבצע בכל צורה וגודל, אולם יש צורך לפחות בשתי נקודות של הקובץ המצורף. אחרת, המטריצה ​​ותאי ליצור מבנה כדורי והתאים מתים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את השימוש של רשת פוליאסטר למטרה זו, אך יש לנו גם השתמשו בהצלחה רשת נירוסטה. ברור, תבניות גדולות יותר ידרשו התאים יותר נפח גדול יותר של מרכיבים אחרים. כאשר אתה עושה את תבניות, חשוב לצמצם את כמות סיליקון דבק בשימוש כדי לוודא שהוא ממוקם בקצה מאוד הקצוות של הצינור. הסיבה לכך היא myoblasts ליד דבק לא ...

<table><tbody><tr><td>צינור סיליקון</td><td>VWR international</td><td>60985-724</td><td></td></tr><tr><td>דבק סיליקון</td><td>Rhodia Silicones</td><td>MED ADH 4300 RTV</td><td></td></tr><tr><td>רשת פוליאסטר</td><td>McMaster-Carr</td><td>93185T17</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>תערובת חומרי הזנה F-10 HAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6908</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי של בקר</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Dispase-2</td><td>קבוצת Roche</td><td>10295825001</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>46H8863</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה של פיברובלסטים בסיסי</td><td>Promega Corp.</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>צלחות גידול רקמה בנפח 150 מ"מ</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>0.05% (1X) Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלחים מאוזנת של האנקס (Hanks Balanced Salt Solution) בריכוז 1X</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;מסנן תאים (cell strainer)</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>פלטות 6 באריים</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה קונוית 50 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה קונוית 15 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;מסנן m</td><td>Nalge Nunc international</td><td>194-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

המצאה של myogenic בונה רקמות מהונדסות

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

למרות העובדה כי קוצבי אלקטרוניים הם מצילי חיים מכשור רפואי, ביצועים לטווח ארוך שלהם מטופלים ילדים יכול להיות בעייתי בשל מגבלות שהוטלו על ידי גודלו הקטן של הילד הצמיחה הבלתי נמנעת שלהם. כתוצאה מכך, קיים צורך אמיתי עבור טיפולים חדשניים שעוצבו במיוחד עבור מטופלים ילדים עם הפרעות קצב לב. אנו מציעים אלטרנטיבה ביולוגית מוליך המורכב מטריצה ​​מבוסס קולגן המכיל autologously הנגזרות תאים יכול להתאים טוב יותר לצמיחה, להפחית את הצורך בניתוחים חוזרים, וגם לשפר באופן משמעותי את איכות החיים של חולים אלו. במחקר הנוכחי, אנו מתארים תהליך לשילוב העיקרי שלד התא תרבויות myoblast בתוך מטריצה ​​הידרוג לאופנה מבנה הרקמה בניתוח מושתלת אשר ישמש כצינור חשמלי בין לתאי העליון והתחתון של הלב. בסופו של דבר, אנו צופים באמצעות סוג זה של רקמות מהונדסות כדי לשחזר הולכה חשמלית בין העליות והחדרים בילדים עם חסם לב מלא. לאור זאת, אנו לבודד myoblasts מן שרירי השלד של הילוד חולדות לואיס אותם על צלחת laminin מצופה תרבות מנות רקמות באמצעות גירסה שונה של פרוטוקולים הוקמה<sup&gt; [2, 3]</sup&gt;. לאחר 1-2 ימים, תאים בתרבית נאספים ומעורבבים עם אנטיביוטיקה, קולגן סוג 1, Matrigel ™, NaHCO<sub&gt; 3</sub&gt;. התוצאה היא פתרון צמיגה, אחיד שניתן יצוקה לתוך תבנית של צורה כמעט וגודל<sup&gt; [1, 4, 5]</sup&gt;. עבור בונה רקמת שלנו, אנו מעסיקים מסוג 1 קולגן מבודד עור כבש העובר באמצעות נהלים סטנדרטיים<sup&gt; [6]</sup&gt;. לאחר רקמה יש הקרושה ב 37 ° C, תרבות התקשורת הוא הוסיף בזהירות לצלחת עד לבניית הוא שקוע. רקמות מהונדסות מותר אז לרכז עוד דרך התייבשות עבור 2 ימים נוספים, ובשלב זה מוכן<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכה או כירורגי-ההשתלה.

הנה, אנחנו מדגימים ייצור של קולגן מבוסס, רקמה בונה המכיל myoblasts השלד. 3-D אלה בונה מהונדסים עשויים לשמש כדי להחליף או לתקן רקמות<em&gt; In vivo</em&gt;. לענייננו, יש לנו תוכנן אלה כצינור חשמלי החדרים והעליות לתיקון של גוש בלב שלם<sup&gt; [1]</sup&gt;.

המצאה של Myogenic בונה רקמות מהונדסות

על אף שקוצבי לב אלקטרוניים הם מכשירים רפואיים מצילים, ביצועיהם לטווח ארוך במטופלים פדיאטריים עלולים להיות בעייתיים בשל...

נוהל זה מתחיל באיסוף רקמת שריר שלד מ-Neonatal Lewis Wraths. מרקמה זו אנו מבודדים תאי מיובלסטים. תאי מיובלסטים אלו גודלים על צלחות תרבית רקמה למשך יומיים, ולאחר מכן נאספים ומעורבבים לתוך תערובת לבניית רקמה מבוססת קולגן.מעמזת זו מועברת בזהירות באמצעות פיפט לתוך תבנית טבולה בתוך מצע גידול ומודגרה בטמפרטורה של 37 °C. שלום, אני כריסטינה פסח מהמעבדה של דגלאס קאוון במחלקה לאנשזיה בבית החולים לילדים בבוסטון ובבית הספר לרפואה של הרווארד. היום נדגים לכם פרוצדורה ליצירת רקמה שרירית (myogenic) מהונדסת.אנו משתמשים בהליך זה כדי לייצר רקמה מהונדסת להשתלה בלב. מטרתנו היא ליצור חיבור חשמלי בין הפרוסות העליונות והתחתונות של הלב כטיפול חלופי להשתלת קוצב לב בילדים עם חסימה לבבית מלאה. אם כך, בואו נתחיל.בבנייה זו, נעשה שימוש בתבנית יציקה כדי לספק צורה למבנה רקמה מבוסס קולגן להשתלה כירורגית. בסרטון זה, מתואר התהליך של יצירת מבני רקמה מהונדסים המכילים מיובלסטים של השריר השלדי. כמו כן, מודגמת השתלה לבבית של הרקמה התאית שהוכנה לפי פרוטוקול זה.ניתן להכין תבנית לרקמה כמעט בכל צורה או גודל כדי לענות על הדרישות הפיזיולוגיות של כל לב עבורו תוכננה הרקמה. בהדגמה זו, התבנית תיצור פיסת רקמה שניתן לחתוך כדי להתאימה לחריץ ה-AV של לב חולדה בוגרת. התחילו בבניית התבנית באמצעות להב תער כדי לחתוך את צינור הסיליקון לחתיכות באורך של שלושה סנטימטרים, ולאחר מכן חתכו כל חתיכה לחצי לאורכה.גזרו חתיכה קטנה של רשת פוליאסטר. לאחר מכן, הניחו טיפה של דבק סיליקון RTV בדרגת שתל בחלק הפנימי של קצה הפיתול.הניחו במהירות חתיכה קטנה של רשת פוליאסטר על טיפת דבק הסיליקון ויישרו אותה עם קצה הפיתול. פעולה זו תספק משטח שטוח ומורם מעט להצמדת המבנה. חזרו על התהליך עבור הקצה השני של הפיתול.הניחו לתבנית להתייבש בטמפרטורת החדר במשך שלושה ימים. מומלץ להכין 20 עד 30 תבניות בכל פעם, שכן אלו הן למעשה חד-פעמיות. לאחר שהדבק התייבש לחלוטין, כדי לסייע בסטריליזציה של התבניות, אחסנו אותן במיכל מלא ב-70% ethanol עד למועד השימוש בתבניות המוכנות.בשלב הבא, קבעו האם כל התמיסות הנדרשות מוכנות גם הן לשימוש להכנה לבידוד תאים. הכינו תמיסת למינין מדוללת של 1 mg למינין ב-250 mL של PBS שעבר סינון דרך פילטר של 0.2 micron וסטריליזציה, המכיל אנטיביוטיקה וחומר נגד פטריות.בשלב הבא, כסו פלטות תרבית רקמה של 150 millimeter בארבעה milliliters של תמיסת הלמינאט המדוללת והדגרירו אותן בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך ארבע שעות לפחות לפני השימוש. יש להכין גם שני תמיסות נוספות: מצע גידול למיובלסטים ותמיסת עיכול לשריר השלד.עיינו בחלק הטקסט של הפרוטוקול לצורך הרכביהם. סננו. הסטריליזו את בופר העיכול באמצעות דיסק סינון של 0.2 micron המורכב על מזרק של 10 milliliter. ניתן לשמור מנות (aliquots) של בופר העיכול בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.העריכו כי תזדקקו לחמישה מיליליטרים של בופר עיכול לכל שגריית חולדות Lewis. דגרו את הכמות הנדרשת של בופר עיכול רקמה ו-10 מיליליטרים של מצע גידול למיובלסטים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, המשיכו בניתוח גורי החולדה.ראשית, השג לפחות שגרורה אחת של חולדות Lewis ניאונטליות שהוקרבו, באמצעות פינצטה ומספריים קטנים. הסר את השרירים הפאראספינליים מחולדות Lewis ניאונטליות מתים על ידי חיתוך הגב לאורך השפיכה, קילוף שכבות העור והפסציה, ולאחר מכן כריתת השרירים. הנח את השרירים שנכרתו לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter מלאה ב-40 milliliters של one X-H-B-S-S על קרח.המתינו עד שרצועות השריר ישקעו לתחתית המבחנה והסירו בזהירות את רוב הנוזל ושאריות הדם באמצעות שאיבה בוואקום עם פיפטת פסטור סטרילית בתוך תרבית. לאחר מכן, שפכו את חתיכות השריר שנאספו לתוך צלחת תרבית של 150 מילימטרים ושאבו כמה שיותר מהנוזל שנותר. בעזרת שני להבי תער בעלי דופן אחת, כרכו את הרקמה למשחה סמיכה.את עיסת השריר יעכלו בתמיסת עיכול שחוממה מראש. שפכו חלק מתמיסת העיכול על עיסת השריר והעבירו את התמיסה ואת תערובת עיסת השריר לנבובת נקייה של 50 מיליליטר. באמצעות פפיט של 10 מיליליטר, ולצורך עיכול יעיל של שרירים מחמישה חולדות לואיס במשקל שלושה ליטרים, נשתמש ב-10 עד 15 מיליליטר מהתמיסה.הנח את המבחנה על פלטפורמת נדנוד (rocking platform) ובצע עיכול בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כ-30 דקות. במהלך העיכול האנזימטי, יש לטלטל את הרקמה מדי פעם ללא יצירת בועות. השתמש בפיפט של 10 milliliter המחובר לפיפט אלחוטי.לאחר שהשריר הומר לנוזל, העבירו את התמיסה דרך מסנן תאים של 70 מיקרון. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים המסוננים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-600 G. בעזרת פיפט פסטור ושאיבה, שאבו כמה שיותר מהנוזל והשאיבו מחדש את המשקע ב-10 milliliters של Medium myoblast חם. הניחו לתאים להיספח על פיתח תרביות רקמה לא מצופה של 150 מילימטר למשך 15 דקות כדי לסייע בהסרת פיברובלסטים, שכן הם נספחים מהר יותר ממיובלסטים.הניחו את הצלחת באינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. הוציאו את הצלחת מהאינקובטור והעבירו את התאים שטרם נצמדו לתרבית המצופה ב-Lamin. ערבבו ודללו אותם במצע גידול למיובלסטים (myoblast medium) כך שתהיה צלחת אחת עבור כל גוריל רט (rat pup) אחד עד שניים.אם התאים ייזרעו בצפיפות גבוהה מדי, הם יבדילו למיוטובים (myotubes). לבסוף, יש לאפשר לתאים לגדול באינקובטור לח במעלה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. לאחר יום עד יומיים של דגירה, התאים יהיו מוכנים ליציקה למבני רקמה.לאחר יום עד יומיים של דגירה, הוצא ארבעה מתוך צלחות תרבית הרקמה של המיובלאסטים בגודל 150 מילימטר מהאינקובטור. אין להמתין יותר מ-48 שעות, שכן פיברובלסטים עלולים להשתלט על אוכלוסיית המיובלאסטים. שאב את המצע מהתאים.לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים ב-XPBS אחד המחומם ל-37 degrees Celsius כדי להפריד את המיובלסטים מהפלטה, והוסיפו ארבעה מיליליטר של תמיסת 0.05%tryin EDTA מחוממת לכל פלטה, והחזירו את הפלטות לאינקובטור למשך חמש דקות. קצרו את המיובלסטים תחת מ красоты המ đạo (culture hood) ואספו את הנוזל למבחנה של 50 מיליליטר. השתמשו ב-10 מיליליטר של מצע גידול למיובלסטים כדי לשטוף את כל הפלטות, ואחדו זאת עם התאים במבחנת הצנטריפוגה.השקיעו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-600 G ושאבו החוצה כמה שיותר מהנוזל העודף. כעת השעיקו שוב את המיובלסטים ב-1.4 milliliters של מצע מיובלסטים והניחו אותם על קרח. בעזרת פינצטה, הוציאו בזהירות תבנית לבנייה מרחליב האתנול ושטפו אותה פעמיים על ידי טבילה ב-XPBS; שאבו את כל שאריות ה-PBS בעזרת פסטור-פיפט לפני הנחת התבנית בבאר ריקה של פלטת תרבית רקמות בעלת שישה בארות.בשלב זה, יש להכין תמיסה. יש לאסוף על קרח את הרכיבים הבאים: 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.תאי קולגן מסוג 1 שהושעו מחדש במדיום למיובלסטים, נתרן ביקרבונט וג'ל. שלבו את הריאגנטים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. ערבבו את התערובת במכשיר Vortex למשך 20 שניות עד שהיא תהפוך לוורודה.שימו לב כי לסוגי הקולגן מסוג one הזמינים מסחרית יש השפעה משתנה על הערבוב, ההתמצקות והעקביות של המוצר הסופי. החזירו את המבחנה לדלי הקרח למספר דקות כדי להוציא בועות מהתמיסה.יש לוודא שקולגן מסוג 1 אינו מקרין, אחרת הוא לא יהפוך לג'לטין. כאן אנו משתמשים במוצר המופק מעור של ביצים. לפני שהתערובת מתמצקת, יש להשקיע בזהירות את התערובת לתוך התבנית בצלחת התרבית.כל תבנית תחזיק כמות של כ-one milliliter מהנוזל הצמיגי. השתדלו להימנע מהכנסת בועות אוויר במהלך הליך זה. העבירו בזהירות את הפלטה המכילה את תבניות המבנה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.ככל שהתערובת מתגבשת, צבעה ישתנה מוורוד כהה לוורוד בהיר; בזמן שהתבנית מתגבשת, חממו מעט מתווך המיובלסטים ל-37 °C. לאחר ד incubaton של כחצי שעה, טבלו בזהירות כל מבנה רקמה בתווך מיובלסטים מחומם והחזירו את הפלטה לאינקובטור. כאשר פרוטוקול זה מבוצע כהלכה, מבנה הרקמה המכיל מיובלסטים מוכן להשתלה in vivo או לניתוחים נוספים.לאחר יומיים של דגירה, הדגמנו בפניכם כיצד לייצר מבנה הנדסי של רקמה מיוגנית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הרכיבים הדרושים לתמיסת המבנה על קרח כדי למנוע התמצקות מוקדמת. זהו כל התהליך.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

fabrication-of-myogenic-engineered-tissue-constructs

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטות להכנת ג'ל מטריצה ​​בזריקות מרקמות decellularized והזרקת אותו לתוך שריר הלב...

ייצור של חומרים בזריקות נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב

רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

הדור של רקמת שריר לב מיושר הוא דרישת מפתח להתאמת ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע למטרות שימושיות מבחינה קלינית. להלן נתאר גישת הדפסת microcontact לשליטה המדויקת של צורת תא ותפקודו. שימוש באוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי גזע עובריים מופקים אבות לב, אז אנחנו מייצרים רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי.

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

מערכת מודל זה מתחילה מג'ל הפיברין myofibroblast-מאוכלס שיכול לשמש כדי לחקור קולגן אנדוגני (מחדש) ארגון בזמן האמת באופן הרסני. מערכת המודל היא מאוד מתכונן, כפי שהוא יכול להיות בשימוש עם מקורות תאים שונים, תוספים בינוניים, וניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב.  עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

בעבודה זו אנו מציגים טכניקה לייצור מהיר של רקמות כלי דם חיות על ידי תרבית ישירה של קולגן, תאי שריר חלק ותאי אנדותל. בנוסף, מתואר פרוטוקול חדש לאפיון מכני של רקמות כלי דם מהונדסות.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

נכון להיום, פגמים ברקמות עבות משוחזרים בדרך כלל על ידי מריחת דשי רקמות אוטולוגיות או רקמות מהונדסות. בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה חדשה להנדסת דש רקמה וסקולרי הנושא עוקץ אוטולוגי, שישמש כתחליף לדשים אוטולוגיים.

דש שריר כלי דם מהונדס

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה בדיית רקמות עצמית שהורכב טבעות בגדלים משתנים באמצעות תבנית מותאמת אישית פלסטיק מודפס 3D. PDMS התשלילים נרפאים ב כייר מודפס 3D; אז agarose הוא ליהק את התשלילים PDMS נרפא. התאים הם נזרע לתוך בארות agarose וכתוצאה מכך היכן הם מצטברים לטבעות רקמות.

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.

הערכת מדדים תפקודיים של בריאות שריר השלד במיקרוטיסוסות שריר השלד האנושי

אנו מתארים מערכת הדמיה ניתנת לשחזור, אוטומטית ובלתי משוחדת לאפיון תפקוד צומת נוירומוסקולרי באמצעות רקמת שרירי שלד מהונדסת אנושית ומוטונורונים אופטוגנטיים. מערכת זו מאפשרת כימות תפקודי של קישוריות עצבית-שרירית לאורך זמן ומזהה ירידה בתפקוד העצבי-שרירי הנגרמת על ידי נוירוטוקסינים וסרום המטופלים myasthenia gravis.

הנדסה ואפיון של מודל אופטוגנטי של הצומת העצבי-שרירי האנושי

פרוטוקול זה מספק שיטות ליצירת רקמות שרירי לב ושלד מהונדסות-תלת-ממדיות ומתאר את השימוש בהן בשיטות סינון תרופות פרה-קליניות. השיטות המתוארות משתמשות במערכת חישה מגנטית כדי להקל על הערכה בו זמנית של 24 רקמות במקביל.

בדיקות פרה-קליניות של תרופות ברקמות שריר מהונדסות תלת-ממדיות ניתנות להרחבה

למדו כיצד ליצור רקמות מהונדסות מיוגניות מבוססות קולגן עם תאי מיובלסט שלדיים לתיקון חסימת לב מלאה. השיטה מדגימה יצירת מוליך חשמלי דרכי לב לשימוש בחיות מודל.

המצאה של Myogenic בונה רקמות מהונדסות

גלה סרטונים נוספים