המצאה של Myogenic בונה רקמות מהונדסות

נוהל זה מתחיל באיסוף רקמת שריר שלד מ-Neonatal Lewis Wraths. מרקמה זו אנו מבודדים תאי מיובלסטים. תאי מיובלסטים אלו גודלים על צלחות תרבית רקמה למשך יומיים, ולאחר מכן נאספים ומעורבבים לתוך תערובת לבניית רקמה מבוססת קולגן.

מעמזת זו מועברת בזהירות באמצעות פיפט לתוך תבנית טבולה בתוך מצע גידול ומודגרה בטמפרטורה של 37 °C. שלום, אני כריסטינה פסח מהמעבדה של דגלאס קאוון במחלקה לאנשזיה בבית החולים לילדים בבוסטון ובבית הספר לרפואה של הרווארד. היום נדגים לכם פרוצדורה ליצירת רקמה שרירית (myogenic) מהונדסת.

אנו משתמשים בהליך זה כדי לייצר רקמה מהונדסת להשתלה בלב. מטרתנו היא ליצור חיבור חשמלי בין הפרוסות העליונות והתחתונות של הלב כטיפול חלופי להשתלת קוצב לב בילדים עם חסימה לבבית מלאה. אם כך, בואו נתחיל.

בבנייה זו, נעשה שימוש בתבנית יציקה כדי לספק צורה למבנה רקמה מבוסס קולגן להשתלה כירורגית. בסרטון זה, מתואר התהליך של יצירת מבני רקמה מהונדסים המכילים מיובלסטים של השריר השלדי. כמו כן, מודגמת השתלה לבבית של הרקמה התאית שהוכנה לפי פרוטוקול זה.

ניתן להכין תבנית לרקמה כמעט בכל צורה או גודל כדי לענות על הדרישות הפיזיולוגיות של כל לב עבורו תוכננה הרקמה. בהדגמה זו, התבנית תיצור פיסת רקמה שניתן לחתוך כדי להתאימה לחריץ ה-AV של לב חולדה בוגרת. התחילו בבניית התבנית באמצעות להב תער כדי לחתוך את צינור הסיליקון לחתיכות באורך של שלושה סנטימטרים, ולאחר מכן חתכו כל חתיכה לחצי לאורכה.

גזרו חתיכה קטנה של רשת פוליאסטר. לאחר מכן, הניחו טיפה של דבק סיליקון RTV בדרגת שתל בחלק הפנימי של קצה הפיתול.

הניחו במהירות חתיכה קטנה של רשת פוליאסטר על טיפת דבק הסיליקון ויישרו אותה עם קצה הפיתול. פעולה זו תספק משטח שטוח ומורם מעט להצמדת המבנה. חזרו על התהליך עבור הקצה השני של הפיתול.

הניחו לתבנית להתייבש בטמפרטורת החדר במשך שלושה ימים. מומלץ להכין 20 עד 30 תבניות בכל פעם, שכן אלו הן למעשה חד-פעמיות. לאחר שהדבק התייבש לחלוטין, כדי לסייע בסטריליזציה של התבניות, אחסנו אותן במיכל מלא ב-70% ethanol עד למועד השימוש בתבניות המוכנות.

בשלב הבא, קבעו האם כל התמיסות הנדרשות מוכנות גם הן לשימוש להכנה לבידוד תאים. הכינו תמיסת למינין מדוללת של 1 mg למינין ב-250 mL של PBS שעבר סינון דרך פילטר של 0.2 micron וסטריליזציה, המכיל אנטיביוטיקה וחומר נגד פטריות.

בשלב הבא, כסו פלטות תרבית רקמה של 150 millimeter בארבעה milliliters של תמיסת הלמינאט המדוללת והדגרירו אותן בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך ארבע שעות לפחות לפני השימוש. יש להכין גם שני תמיסות נוספות: מצע גידול למיובלסטים ותמיסת עיכול לשריר השלד.

עיינו בחלק הטקסט של הפרוטוקול לצורך הרכביהם. סננו. הסטריליזו את בופר העיכול באמצעות דיסק סינון של 0.2 micron המורכב על מזרק של 10 milliliter. ניתן לשמור מנות (aliquots) של בופר העיכול בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.

העריכו כי תזדקקו לחמישה מיליליטרים של בופר עיכול לכל שגריית חולדות Lewis. דגרו את הכמות הנדרשת של בופר עיכול רקמה ו-10 מיליליטרים של מצע גידול למיובלסטים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, המשיכו בניתוח גורי החולדה.

ראשית, השג לפחות שגרורה אחת של חולדות Lewis ניאונטליות שהוקרבו, באמצעות פינצטה ומספריים קטנים. הסר את השרירים הפאראספינליים מחולדות Lewis ניאונטליות מתים על ידי חיתוך הגב לאורך השפיכה, קילוף שכבות העור והפסציה, ולאחר מכן כריתת השרירים. הנח את השרירים שנכרתו לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter מלאה ב-40 milliliters של one X-H-B-S-S על קרח.

המתינו עד שרצועות השריר ישקעו לתחתית המבחנה והסירו בזהירות את רוב הנוזל ושאריות הדם באמצעות שאיבה בוואקום עם פיפטת פסטור סטרילית בתוך תרבית. לאחר מכן, שפכו את חתיכות השריר שנאספו לתוך צלחת תרבית של 150 מילימטרים ושאבו כמה שיותר מהנוזל שנותר. בעזרת שני להבי תער בעלי דופן אחת, כרכו את הרקמה למשחה סמיכה.

את עיסת השריר יעכלו בתמיסת עיכול שחוממה מראש. שפכו חלק מתמיסת העיכול על עיסת השריר והעבירו את התמיסה ואת תערובת עיסת השריר לנבובת נקייה של 50 מיליליטר. באמצעות פפיט של 10 מיליליטר, ולצורך עיכול יעיל של שרירים מחמישה חולדות לואיס במשקל שלושה ליטרים, נשתמש ב-10 עד 15 מיליליטר מהתמיסה.

הנח את המבחנה על פלטפורמת נדנוד (rocking platform) ובצע עיכול בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כ-30 דקות. במהלך העיכול האנזימטי, יש לטלטל את הרקמה מדי פעם ללא יצירת בועות. השתמש בפיפט של 10 milliliter המחובר לפיפט אלחוטי.

לאחר שהשריר הומר לנוזל, העבירו את התמיסה דרך מסנן תאים של 70 מיקרון. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים המסוננים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-600 G. בעזרת פיפט פסטור ושאיבה, שאבו כמה שיותר מהנוזל והשאיבו מחדש את המשקע ב-10 milliliters של Medium myoblast חם. הניחו לתאים להיספח על פיתח תרביות רקמה לא מצופה של 150 מילימטר למשך 15 דקות כדי לסייע בהסרת פיברובלסטים, שכן הם נספחים מהר יותר ממיובלסטים.

הניחו את הצלחת באינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. הוציאו את הצלחת מהאינקובטור והעבירו את התאים שטרם נצמדו לתרבית המצופה ב-Lamin. ערבבו ודללו אותם במצע גידול למיובלסטים (myoblast medium) כך שתהיה צלחת אחת עבור כל גוריל רט (rat pup) אחד עד שניים.

אם התאים ייזרעו בצפיפות גבוהה מדי, הם יבדילו למיוטובים (myotubes). לבסוף, יש לאפשר לתאים לגדול באינקובטור לח במעלה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. לאחר יום עד יומיים של דגירה, התאים יהיו מוכנים ליציקה למבני רקמה.

לאחר יום עד יומיים של דגירה, הוצא ארבעה מתוך צלחות תרבית הרקמה של המיובלאסטים בגודל 150 מילימטר מהאינקובטור. אין להמתין יותר מ-48 שעות, שכן פיברובלסטים עלולים להשתלט על אוכלוסיית המיובלאסטים. שאב את המצע מהתאים.

לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים ב-XPBS אחד המחומם ל-37 degrees Celsius כדי להפריד את המיובלסטים מהפלטה, והוסיפו ארבעה מיליליטר של תמיסת 0.05%tryin EDTA מחוממת לכל פלטה, והחזירו את הפלטות לאינקובטור למשך חמש דקות. קצרו את המיובלסטים תחת מ красоты המ đạo (culture hood) ואספו את הנוזל למבחנה של 50 מיליליטר. השתמשו ב-10 מיליליטר של מצע גידול למיובלסטים כדי לשטוף את כל הפלטות, ואחדו זאת עם התאים במבחנת הצנטריפוגה.

השקיעו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-600 G ושאבו החוצה כמה שיותר מהנוזל העודף. כעת השעיקו שוב את המיובלסטים ב-1.4 milliliters של מצע מיובלסטים והניחו אותם על קרח. בעזרת פינצטה, הוציאו בזהירות תבנית לבנייה מרחליב האתנול ושטפו אותה פעמיים על ידי טבילה ב-XPBS; שאבו את כל שאריות ה-PBS בעזרת פסטור-פיפט לפני הנחת התבנית בבאר ריקה של פלטת תרבית רקמות בעלת שישה בארות.

בשלב זה, יש להכין תמיסה. יש לאסוף על קרח את הרכיבים הבאים: 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.

תאי קולגן מסוג 1 שהושעו מחדש במדיום למיובלסטים, נתרן ביקרבונט וג'ל. שלבו את הריאגנטים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. ערבבו את התערובת במכשיר Vortex למשך 20 שניות עד שהיא תהפוך לוורודה.

שימו לב כי לסוגי הקולגן מסוג one הזמינים מסחרית יש השפעה משתנה על הערבוב, ההתמצקות והעקביות של המוצר הסופי. החזירו את המבחנה לדלי הקרח למספר דקות כדי להוציא בועות מהתמיסה.

יש לוודא שקולגן מסוג 1 אינו מקרין, אחרת הוא לא יהפוך לג'לטין. כאן אנו משתמשים במוצר המופק מעור של ביצים. לפני שהתערובת מתמצקת, יש להשקיע בזהירות את התערובת לתוך התבנית בצלחת התרבית.

כל תבנית תחזיק כמות של כ-one milliliter מהנוזל הצמיגי. השתדלו להימנע מהכנסת בועות אוויר במהלך הליך זה. העבירו בזהירות את הפלטה המכילה את תבניות המבנה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

ככל שהתערובת מתגבשת, צבעה ישתנה מוורוד כהה לוורוד בהיר; בזמן שהתבנית מתגבשת, חממו מעט מתווך המיובלסטים ל-37 °C. לאחר ד incubaton של כחצי שעה, טבלו בזהירות כל מבנה רקמה בתווך מיובלסטים מחומם והחזירו את הפלטה לאינקובטור. כאשר פרוטוקול זה מבוצע כהלכה, מבנה הרקמה המכיל מיובלסטים מוכן להשתלה in vivo או לניתוחים נוספים.

לאחר יומיים של דגירה, הדגמנו בפניכם כיצד לייצר מבנה הנדסי של רקמה מיוגנית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הרכיבים הדרושים לתמיסת המבנה על קרח כדי למנוע התמצקות מוקדמת. זהו כל התהליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.