Name: מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: למד מיפוי אופטי של לב עכברוש בפרפוזיית Langendorff באמצעות צבע di-8-ANEPPS. שיטה זו מאפשרת מחקר מפורט של פעילות חשמלית בקרום הלב ותובנות לגבי דינמיקה קרדיאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר מן המכון הלאומי לבריאות (HL068915; HL088206) ותרומות לקרן הולכה לב בבית החולים לילדים בבוסטון.

חלק 1: פתרונות הכן ואת מערכת מבודדת בלב perfused <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקרו של הניסוי, L 4.0 פתרון קרבס-Henseleit מוכנה כפי שתואר לעיל [5, 6]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (^ נם) מומס L 1.0 פתרון קרבס-Henseleit יצק מן perfusate שהוכן בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 מ"ל נוספים של קרבס-Henseleit יוסר perfusate שהוכן בשלב 1.1 מעורב עם 5 מול / L di-8-ANEPPS (בדילול ממלאי mmol / L 10 מומס sulfoxide דימתיל (DMSO)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 פתרונות אלה מועברים מים במקטורן זכוכית מאגרים (רדנוטי) שם הם מראש לחמם 41.0 ° C ו מחומצן עם bubbler שקוע (רדנוטי) באמצעות 0.2 מיקרומטר, מסונן 95% O 2; גז 5% CO 2. פתרונות מן 3 מאגרים מניות נשאבים למערכת Langendorff הקיר עם משאבות MasterFlex ™ L / S peristaltic נמוך קליטה סיליקון צינורות (קול, בן הזוג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההרכבה, המערכת Langendorff זכוכית (רדנוטי) נשטף בקפידה עם מגיב E-TOXA-CLEAN (סיגמא אולדריץ) ושטף ביסודיות עם 0.1 M / L HCl, אתנול 100%, מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנגנון הלא הסירקולציה המחודשת Langendorff נבנה כדי לספק 70 מ"מ כספית בלחץ מתמיד של 3 מאגרים נפרדים מחומצן, אשר מופרדים מן הלב עם מים במקטורן סלילי חימום מלכודות בועה (רדנוטי) [7]. 3 קווי טפטוף עצמאי להתכנס מעל ללב בשני 3-way והברזים למיניהם, מאפשר לנו לשלוט במדויק אספקה ​​של פתרונות מוכנים בצעדים 1.1-1.3. מים במקטורן זכוכית מחובר בסדרה עם צינורות BPT MasterFlex PharMed (קול, בן הזוג) והתלהב 39 ° C עם מים מזוקקים באמצעות שני circulators E100 (Lauda). אובדן חום דרך צינור פלטינה ריפא סיליקון (קול, בן הזוג) שמחבר את הלחץ על ראש מאגרים סלילי חימום מלכודות הבועה הביאה 37 ° C perfusate להגיע את הלב. </li></ol> חלק 2: קציר לב חולדה הגדרת זלוף Langendorff <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשרות הרדמה כללית עמוקה 200-250 גרם לואיס חולדות, 100 מ"ג / ק"ג קטמין ו - 10 מ"ג / ק"ג Xylazine מוזרק לתוך חלל intraperitoneal. לתערובת זו נוסיף 500 U / kg הפרין כדי למנוע קרישת דם, שריר הלב במהלך ההליך explantation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור גישה קלה לב וכלי גדול, קיר בית החזה הקדמי מוסר. אחרי זה, הרקמה שמסביב הוא גזור בקפידה את שק קרום הלב נפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זיהוי נחות הווריד הנבוב, כלי זה הוא ligated עם משי 5-0 (Ethicon) ואת כל גוש לב ריאה הוא explanted. רקמות ממוקם מיד קר כקרח פתרון קרבס-Henseleit הכלול מבחנה 50 מ"ל על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבי העורקים עולה מזוהה במהירות גזור מן הרקמה הסובבת. צינורית כראוי בגודל (הרווארד Apparatus) מוכנס לתוך אבי העורקים, טיפול כדי למנוע הפרעה זלוף חובה של העורקים הכליליים על ידי החדרת צינורית רחוק מדי לתוך שורש האאורטה. קנית היא מאובטחת האאורטה עולה עם משי 5-0 (Ethicon). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלב חולדה ממוקם אז ללא החדרת בועות אוויר לתוך צינורית על המנגנון Langendorff. מדרדר זלוף כלי הדם הכליליים מוקמת כעת עם פתרון חם, קרבס-Henseleit מחומצן מן הראש בלחץ המתוארת בשלב 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות נוספות, כולל את הריאות, מוסר כעת את הלב הוא perfused במשך 20 דקות כדי לאפשר התאוששות של תפקוד ולייצב את הקצב. במהלך תקופה זו, בדיקה דקה מאוד טמפרטורה תרמי (קול, בן הזוג) מוחדר לחלל החדר השמאלי ואת sutured במקום עם 5-0 Prolene תפר (Ethicon). החללית מחובר תרמו בקר (Digi-Sense) כדי להבטיח את הטמפרטורה של הלב נשמר על 37 מעלות צלזיוס על ידי התאמת ההגדרות של משאבות מים הדם. Motion מ perfusate נוטף מן הקודקוד לב ממוזער על ידי הנחת פיסת גזה במכל בשפכים. </li></ol> חלק 3: לב טען עם צבע פוטנציומטרית ולרכוש electrographic אותות אופטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) הוא נטען לתוך הלב ידי מעבר לקו זלוף המכיל את קרבס-Henseleit מעורבב עם צבע פלואורסצנטי באמצעות שסתום. בנוסף, צינורית 18G ממוקם אל המבואה שמאל ו / או זכות ו 50 מ"ל נוסף של פתרון לצבוע מנוהל לאט לתוך אחד החדרים האלה כי הם לא מספיק perfused עם צבע הציג דרך העורקים הכליליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ההליך טוען, 3 מוביל א.ק.ג. (הרווארד Apparatus) מונחות בעדינות על פני השטח של הלב שאינו מול אופטיקה משמש המיפוי. אלקטרודה N o 1 ממוקם בחלק apical האחורי של החדר השמאלי, N o 2 על אטריום שמאל, ו-N <su> p&gt; o 3 כמו אלקטרודה התייחסות בשורש אבי העורקים (איור 1). האותות electrographic פרוזדורים חדרית הם מוגבר לאחר מכן, דיגיטציה, ומוצג לצד אותות אופטיים באמצעות התוכנה (RedShirt Imaging) (איור 2). אוסצילוסקופ (Tektronix מודל 1002 TDS) משמש גם כדי לחזות את פני השטח של א.ק.ג. בזמן אמת ולהבטיח צעדה הולם. </su></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א.ק.ג. מגבר (הוגו זאקס Elektronik) הגדרות: מסנן פס גבוה: 0.1 הרץ Pass Filter נמוך: 150 הרץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצלמת CMOS (RedShirt Imaging) ו macroscope ממוקמת באמצעות התאמות XYZ כך את פני השטח של הלב בפוקוס מרוכז בתוך מסגרת הרכישה. המצלמה אופטיקה הם רכובים על השולחן רטט בידוד (מינוס K טכנולוגיה) כדי למזער את תדר תהודה. במקביל, אלקטרודה צעדה קואקסיאליים (הרווארד Apparatus) נשלט עם יחידה מבודדת, גירוי חשמלי-S48 (דשא), מושם על אטריום הנכון הלב בקצב של 300 פעימות לדקה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשמל (דשא) גירוי הגדרות: דרג: 5 פעימות בשנייה עיכוב: 0.2 ms משך הפעילות: 2 ms וולט: 6-12 V מצב: חזור דופק: רווק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הקלטות אופטי אשר חוסר ההצעה artifacts מהתכווצות הלב צריכה להיות זוגיים electromechanically. אנו עושים זאת באמצעות מיתוג מחדש קווי זלוף לפתרון קרבס-Henseleit המכיל 11 mmol / L ^ נם. בין הרכישות, הלב perfused עם טהור קרבס-Henseleit כדי לעזור לשמר את הכדאיות של התכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרמטרים הקלטה נקבעים באמצעות התוכנה (הדמיה RedShirt) עם הגדרות הרכישה הבאה: תצורה: 2,000 הרץ; 128x128 מערך פיקסל מרווח פריים: 0.5 ms מגבר רווח מצלמה: 5x על שבב רווח: 8x-12Me-טוב תריס: 500 עיכוב ms מספר מסגרות: 4000 משך: 2000 ms </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל האורות בחדר וציוד מנוטרלים או מוגן לבטל רעשי רקע במהלך ההקלטה. הנורית מאירה את הלב רק במהלך ההקלטה אופטי כדי להפחית צילום הלבנת ורעילות לצבוע. תריס מקור האור נשלטת בדופק V 5 מועברת דרך לוח הבקרה דרך לוח D-ל-A במחשב (הדמיה RedShirt). </li></ol> חלק 4: ניתוח מידע הרכישה באמצעות דימות תוכנה RedShirt <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הרכישה, נתונים מעובד באמצעות הגדרות סינון שונות. אנחנו בדרך כלל להשתמש בהגדרות ברירת המחדל, למעט בעת כוונון בנד 'עצור / Pass מסנן, אשר מוגדר עם הגבול שמאלה 44.0 ו 98.0 הגבול הנכון. לאחר מכן המידע המוקלט מעובד סרט שנוצר (הדמיה RedShirt). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים מרכישת one המתאים הפעלת החשמל המקומית 16,384 אתרים על פני הלב על פני תקופה של 2 שניות. התוכנה מאפשרת האותות הללו המקומיים להשוות ישירות אחד עם השני ועם הקלטות electrographic פרוזדורים חדרית. הנתונים אז דמיינו ידי מיפוי ההפעלה חשמל מקומיות צבע עיבוד מידע זה כמו אנימציה המציגה את הפעלת החשמל spatiotemporal על פני הלב. כדי ליצור אנימציה כזאת, אנו משתמשים את התוכנה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> temporally ו / או מרחבית לסנן את הנתונים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זמן התחלה וסיום של האנימציה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפת אותות אופטיים צבע על בסיס עוצמת האור מנוחתו של כל פיקסל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת הנתונים צבע וכתוצאה מכך עם תמונה של הלב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור את האנימציה </li></ul></li></ol> חלק 5: תוצאות נציג אם הכנת הלב perfused היה ללא תנועה במהלך ההקלטה, את אותות אופטיים תערוכת יחיד שיא ברורים עבור כל פיקסל מעורב לשינוי עוצמת הפליטה של ​​di-8-ANEPPS. הסרטים המקביל (איורים 3 ו -4) להפגין מול גל עירור ומתפשטים על פני השטח epicardial של הלב כמו גם את הקלטות electrographic רכשה בו זמנית (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="דיאגרמת הגדרת הלב של לנגנדורף לחקר קצב הלב, תוך הדגשת רכיבים ממוספרים." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תצלום הכנה Langendorff-perfused לב המתאר את העמדות של האלקטרודה צעדה על אטריום הנכון א.ק.ג. מוביל כמתואר בשלב 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="דיאגרמת תהליכים ביולוגיים עם אותות; ניתוח נתונים של תוצאות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית." border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="איור 2"> איור 2. אותות אופטיים נציג והקלטות electrographic מלב לואיס perfused חולדה. לוח מראה תמונה של פני השטח epicardial המשמש הדמיה אופטית. העמדה של פיקסלים שנבחרו כדי להדגים את השינויים פליטת הקרינה לאורך זמן בלוח B מסומנים על ידי חצים צבעוניים. אותות Electrographic מוצגים בלוח C עם הקו האדום המציין הפעלה פרוזדורים הקו הכחול אור המקביל לאות חדרית. בבקשהve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "&gt; לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש בבית החולים לילדים בבוסטון.

הסרה של הלב מן החולדות הרדים חייב להתבצע במהירות כדי למנוע איסכמיה בשריר הלב. אם איסכמיה או מספיק זלוף כלילית מתרחשת, בלב צפויה לפתח הפרעות קצב ועלולה להיות infarcted. בנוסף, לבבות אלה יציגו פליטת הקרינה מספיק הקלטות אינפורמטיבי וניתוחים שלאחר מכן. לפני טעינת צבע, בתאי שריר הלב צריך להיות perfused מספקת פתרון קרבס-Henseleit להקים ולתחזק סביבה אלקטרוליט פיזיולוגי ליציבות של דחפים חשמליים. הכנה מדויקת של perfusate הוא גם הכרחי כדי לשמור על חיוניות האיבר לתפקד תקין. הבדלים בריכוז האל...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>ציוד</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת CardioPlex</td><td>ציוד</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקור אור LUXEON LED 460-490 nm</td><td>ציוד</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>מגבר ECG מסוג 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>ציוד</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואית 505 nm</td><td>ציוד</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה 605 nm Long Pass</td><td>ציוד</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT Sideways</td><td>ציוד</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מפרק כדורי מיני</td><td>ציוד</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>סט אלקטרודות גרייה קטנות</td><td>ציוד</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת בידוד רעידות שולחנית BM-6</td><td>ציוד</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודת ECG מונופולרית</td><td>ציוד</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>משאבת גלגלת SCI 400</td><td>ציוד</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>משאבת גלגלת MasterFlex Easy Load II</td><td>ציוד</td><td>Cole-Parmer</td><td>Model 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>צינורית Marprene #14</td><td>ציוד</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>צינורית MasterFlex</td><td>ציוד</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>מגרה בעלי פולסים מרובעים S48</td><td>ציוד</td><td>Grass Technologies</td><td>Model S48</td><td></td></tr><tr><td>יחידת בידוד שנאי RF מסוג SIU5</td><td>ציוד</td><td>Grass Technologies</td><td>Model SIU5</td><td></td></tr><tr><td>מיכל בעטיפת מים בנפח 5 Liter</td><td>ציוד</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>מיכל בעטיפת מים בנפח 2 Liter</td><td>ציוד</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>מיכל בעטיפת מים בנפח 0.5 Liter</td><td>ציוד</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>מיכל בעטיפת מים בנפח 0.25 Liter</td><td>ציוד</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>סליל חימום 10 ml</td><td>ציוד</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>מלכודת בועות לקומפליאנס</td><td>ציוד</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>קנולה לניתוק Luer</td><td>ציוד</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>ברז תלת-כיווני, FLL ל-MLT, ללא מכסי פתחים</td><td>ציוד</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>מד חום תרמוקפל</td><td>ציוד</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-פרובה גמישה מסדרת IT Ultra Fine</td><td>ציוד</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ Tektronix TDS 1002</td><td>ציוד</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl</td><td>ריאגנט</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>ריאגנט</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

מיפוי אופטי של langendorff-perfused לבבות עכברוש

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

מיפוי אופטי של פני הלב עם מתח רגיש צבעי ניאון הפך כלי חשוב לחקור עירור חשמלי במודלים ניסיוניים טווח בהיקף של תרביות תאים אל כל האיברים<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. באמצעות המדינה-of-the-art מערכות הדמיה אופטית, הדור של התפשטות פוטנציאל פעולה במהלך קצב לב נורמלי או בכל ייזום ואחזקה של הפרעות קצב ניתן דמיינו כמעט מיד<sup&gt; [1]</sup&gt;. האחרונה, זמין מסחרית מערכות יכולים לספק מידע ברזולוציות גבוהות ביותר spatiotemporal ו התבססו על הציוד שהותקן פיתחה בתחילה כדי להתגבר על המכשולים שהציבה שיטות אלקטרו קונבנציונליים יותר<sup&gt; [1]</sup&gt;. התקדמויות ברזולוציה גבוהה במהירות גבוהה משלימים תחמוצת מתכת, מוליכים למחצה (CMOS) מצלמות מאוד בהיר, דיודות פולטות אור (LEDs), כמו גם מתח רגיש צבעים, אופטיקה, ומסננים החלו לבצע רכישה האות החשמלי מעשית עבור ביולוגים התא לב וכלי דם, אשר מורגלים יותר לעבוד עם מיקרוסקופים. אף על פי הדור החדש של מצלמות CMOS יכול לרכוש 10,000 מסגרות לשנייה על מערך 16,384 פיקסל, תלוי בסוג של הכנת המדגם, ותיקה טכנולוגיות רכישת הקרינה כגון מערכי photodiode, לייזר מערכות סריקה, מקורר טעונה מצמידים התקן (CCD מצלמות) עדיין יש כמה יתרונות מובהקים מבחינת טווח דינמי, אות לרעש יחס, ועל היעילות הקוונטית<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. במחקר הנוכחי, לבבות לואיס חולדה היו perfused<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; עם perfusate גבישן (קרבס-Henseleit פתרון) בשעה 37 ° C על מנגנון Langendorff שונה. לאחר תקופת ייצוב 20 דקות, לבבות היו perfused לסירוגין עם monoxime 11 2,3-butanedione mmol / L לחסל התכווצות הקשורים בתנועה במהלך הרכישה התמונה. מיפוי אופטי, העמסנו לבבות עם בדיקה מהירה התגובה פוטנציומטרית di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 μMol / L) בקצרה האיר את ההכנה עם 475 ± 15 עירור אור ננומטר. במהלך תקופה 2 טיפוסי השני של תאורה,&gt; 605 ננומטר אור הנפלט הכנת הלב היה צילמו עם מצלמה CMOS מהיר מחובר macroscope אופקי. להדגמה זו, הלבבות היו בקצב של 300 פעימות לדקה עם אלקטרודה קואקסיאליים מחובר יחידת גירוי חשמלי מבודד. במקביל להקלטות דו קוטבית electrographic נרכשו ונותחו יחד עם אותות מתח באמצעות תוכנת בקלות זמינים. באופן זה, פוטנציאל הפעולה על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה ניתן דמיינו ונרשם עם אותות electrographic.

מאמר זה מתאר טכניקה גבוהה ברזולוציה של זמן ומרחב התנועה תמונה אופטית פעולה פוטנציאל על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה באמצעות צבע פוטנציומטרית (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

מיפוי אופטי של פני השטח של הלב באמצעות צבעים פלואורסצנטיים רגישים למתח הפך לכלי חשוב לחקר העירור החשמלי ב...

שלום, אני יון זיו מהמעבדה של ד"ר כהן במחלקה לאנסטזיולוגיה בבית החולים לילדים ובבית הספר לרפואה של הווארד. היום נדגים הליך של מיפוי אופטי בלבבות אדומים שעברו פרפוזיה ב-Lal. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את התפשטות הפעילות החשמלית על פני השטח של הלב.אם כן, נתחיל. בבוקר הניסוי, הכינו ארבעה ליטרים של תמיסת Krebs Hensel light. לאחר הכנת התמיסה, הסירו חלקיקים שלא נמסו באמצעות מסנן של 200 micron בסינון בוואקום.ראשית, השתמש בליטר אחד של תמיסת Krebs Henzel lite שהוכנה כדי להמיס 11 millimoles של BDM. שנית, קח 100 milliliters נוספים של Krebs Henzel lite וערבב פנימה D eight NFS בריכוז 10 millimolar ב-DMSO, עד לריכוז סופי של five Micromolar D eight annex בתמיסה. מאגרי הזכוכית בעלי מעטפת מים, ה-bubbler וכלי הזכוכית המשמשים כאן הם כולם מבית red.Naughty.העבר את שני התמיסות למאגרים שחוממו מראש ל-41 °C. חמצן את התמיסות באמצעות גז מסונן ב-0.2 micron בעזרת משאבת בועות שקועה; דחף את התמיסות משלושת מאגרי המלאי דרך מערכת Ling Endorf המותקנת על הקיר, באמצעות משאבות פריסטלטיות וצינורות סיליקון בעלי ספיגה נמוכה, לצורך הוצאת לב החולדה. ראשית, הזרק תוך-ביטנית לחולדת Lewis במשקל 200 עד 250 gram קטמין וקסילזין כדי להשריות הרדמה כללית עמוקה, והפרין כדי למנוע קרישת דם ואיסכמיה של השריר הלבבי במהלך ההוצאה.לאחר שהחולדה הורדמה לחלוטין ואינה מגיבה ללחץ בבהוaddEventListener toe pinch, ניתן להמשיך בהוצאת הלב. התחילו את הניתוח בהסרת דופן החזה הקדמית כדי לאפשר גישה קלה ללב ולכלי הדם הגדולים. לאחר מכן, בצעו דיסקציה זהירה של הרקמות מסביב ופתחו את שק הפריקרד.לאחר זיהוי הווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava), קשרו כלי דם זה באמצעות חמש תפרים מסוג O Proline והוציאו את כל גוש הלב והריאות. הניחו מיד את הרקמה בתמיסת Krebs Henzel light קרה במקרר בתוך כלי קיבול של 50 מיליליטר על קרח, זהו במהירות את האורטה העולה והפרידו אותה מהרקמה שמסביב. הכניסו קנולה בגודל מתאים אל תוך האורטה.יש להקפיד לא להחדיר את הקנולה עמוק מדי לשורש האאורטה כדי למנוע הפרעה לפרפוזיה ההכרחית של העורקים הכליליים. קבעו את הקנולה לאאורטה העולה. לאחר מכן, הניחו את לב החולדה על מכשיר Ling Endorf מבלי להחדיר בועות אוויר לקנולה.עתה הוקמה פרפוזיה רטרוגרדית של כלי הדם הכליליים באמצעות תמיסת Krebs Hensel lite מחוממת ומחומצנת. מראש העומד של מכשיר ה-Ling Endorf, הסר כעת רקמות עודפות, כולל הריאות, ולאחר הניקוי בצע פרפוזיה ללב למשך 20 דקות כדי לאפשר התאוששות תפקודית ולייצב את הקצב בזמן שהלב עובר פרפוזיה. הכנס חיישן טמפרטורה מסוג תרמוקפל דק מאוד לתוך חלל הפרונטריקול השמאלי.תפרו את הפרובה למקומה באמצעות חמש תפרי prolene במידה 5-0 והתאימו את הגדרות משאבות סחרור המים כדי לשמור על טמפרטורת הלב. בטמפרטורה של 37 °C, מזעזעו את התנועה של ה-Perfuse 8 המטפטף מאפקס הלב. לאחר הנחת פיסת גזה במיכל הניקוז, הלב מוכן כעת להטענה בצבע פוטנציומטרי לצורך רכישת אותות אלקטרוגרפיים ואופטיים; העמיסו את הצבע הפוטנציומטרי dye 8 NEPs אל תוך הלב.עברו לקו הפרפוזיה המכיל Krebs, שבו אור מעורב עם צבע פלואורסצנטי. כיוון שהעליות אינן מקבלות פרפוזיה מספקת של הצבע המוחדר דרך העורקים הכליליים, קנולה בכישור 18 מוחדרת לעלייה השמאלית ו/או הימנית. ולאחר מכן, 50 milliliters נוספים של תמיסת הצבע מוחדרים באיטיות לכל אחת מהלשכות הללו.במהלך הליך הטעינה, מקם בעדינות שלושה אלקטרודות ECG על פני השטח של הלב, כך שלא יפנו לעבר האופטיקה המשמשת למיפוי. האלקטרודה הראשונה ממוקמת בחלק האפיקלי האחורי של החדר השמאלי.השני ממוקם בעלייה השמאלית והשלישי משמש כאלקטרודת ייחוס בשורש האביון. אותות אלקטרוגרפיים מהעלייה ומהחדר מוגברים לאחר מכן, עוברים דיגיטציה ומוצגים כאותות אופטיים באמצעות התוכנה. נעזרים גם באוסצילוסקופ כדי להדמיא את ה-ECG השטחי בזמן אמת ולהבטיח קצב עיבור (pacing) נאות.כוון את מגבר ה-ECG ל-0.1 hertz עבור מסנן המעבר הגבוה ול-150 hertz עבור מסנן המעבר הנמוך, וממקם את מצלמת ה-CMOs באמצעות כוונוני X, Y, Z. פיסת זכוכית הממוקמת במישור המוקד של המצלמה מונחת על פני השטח של הלב, כך שהאזור המבוקש יהיה ממוקד ובמרכז מסגרת הרכישה. המצלמה והאופטיקה מורכבות על שולחן בידוד רעידות כדי למזער תדרים תהודתיים.במקביל, מקם על העלייה הימנית אלקטרודת קוצב קואקסיאלית הנשלטת על ידי יחידה מבודדת לעירור חשמלי מדגם S 48. מכשיר זה יקצב את הלב בקצב של 300 פעימות לדקה; הגדר את העירור החשמלי באופן הבא.הקצב צריך להיות חמישה פולסים לשנייה, השהיה של 0.2 milliseconds, משך גרייה של two milliseconds בעוצמה של six to 12 volts, כאשר המצב מוגדר כ-repeat ו-single pulse. עבור הקלטות אופטיות ללא ארטיפקטים של תנועה הנובעים מהתכווצות, יש לבצע ניתוק אלקטרו-מכני של הלב. בצעו זאת על ידי העברה חוזרת של קווי הפרופזיה לתמיסת Krebs Hensel המכילה 11 millimolar BDM.בין רכישות נתונים. בצעו פרפוזיה ללב באמצעות תמיסת Krebs HENSEL ללא תוספות כדי לסייע בשימור החיוניות של הדגימה. הגדירו את פרמטרי ההקלטה בתוכנה ל-2000 hertz עם מערך פיקסלים של 1 28 על 1 28.יש להגדיר את מרווח הפריימים ל-0.5 milliseconds ואת ההגברים לחמישה x עבור מגבר המצלמה ושמונה x עבור ההגבר המובנה (on-chip gain). יש להגדיר את ההגבר המובנה גם ל-12. הגדירו בבקרת המצלמה של התוכנה השהיית תריס של 500 milliseconds והקליטו 4,000 פריימים במשך 2000 milliseconds.כבו או הסתירו את כל תאורת החדר והציוד כדי למנוע רעשי רקע במהלך ההקלטה; נורת ה-LED מאירה את הלב רק בזמן ההקלטה האופטית. כדי להפחית פוטובליצ'ינג (photobleaching) ורעילות של הצבע, בקר את תריס מקור האור באמצעות פולס של 5V המועבר דרך לוח הבקרה באמצעות לוח D2A במחשב לאחר הרכישה. עבדו את הנתונים באמצעות הגדרות מסננת שונות.בדרך כלל נעשה שימוש בהגדרות ברירת המחדל, למעט בעת כיוון מסנן חסימת פס (band stop pass filter), שבו הגבול השמאלי נקבע ל-44.0 והגבול הימני ל-98.0. לאחר מכן, המידע שהוקלט מעובד ומשמש ליצירת סרטון. נתונים מרכישה אחת תואמים להפעלה חשמלית מקומית ב-16,384 נקודות על פני שטח הלב לאורך תקופה של שתי שניות.התוכנה מאפשרת להשוות ישירות בין אותות מקומיים אלו לבין עצמם ובין נתוני רישומי האלקטרוגרפיה העלידית והחדרית, וזאת על ידי מיפוי של האקטיבציה החשמלית המקומית לצבעים והצגת מידע זה כאנימציה המראה את האקטיבציה החשמלית המרחבית-זמנית על פני שטח הלב. כדי ליצור אנימציה כזו, ראשית, השתמש בתוכנה כדי לסנן את הנתונים באופן זמני ו/או מרחבי. לאחר מכן, בחר זמן התחלה וסיום לאנימציה.שלישית, מיפוי של האותות האופטיים לצבעים על בסיס עוצמת האור במצב מנוחה של כל פיקסל. רביעית, הלבשת נתוני הצבעים שהתקבלו על תמונה של הלב, ולבסוף יצירת האנימציה אם הכנת הלב המבוש perfusion הייתה ללא תנועה במהלך ההקלטה. האותות האופטיים מראים שיא מובחן אחד עבור כל פיקסל המעורב בשינוי בעוצמת הפליטה של D eight anep. סרטוני ההדמיה בזמן אמת אלו מדגימים חזית עירור המתפשטת על פני השטח האפיקרדיאליים של הלב, כמו גם את רישומי האלקטרוגרפיה שנרכשו בו-זמנית.הדגמנו כעת טכניקה ברזולוציה גבוהה לדימוי אופטי של תנועת פוטנציאל פעולה על פני שטח של לב של דג רד-הארט (Alanor Perfuse Red Heart). בעת ביצוע הליך זה, חשוב להוציא במהירות את הלב מהדג המורדם. כדי למנוע איסכמיה של השריר הלבבי, יש להבטיח פרפוזיה נאותה של תאי השריר הלבבי, והלב חייב להיות טעון במלואו בצבע רגיש למים.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דוח זה מספק תיאור מפורט של המתודולוגיה ואת התוצאות של מיפוי אופטי סימולטני endocardial ו epicardial של עירור חשמלי של אטריום נותר בשלמותו הלב Langendorff-perfused כבשה במהלך פרפור פרוזדורי למתוח-Induced.

ברזולוציה גבוהה מיפוי אופטי Endocardial ו Epicardial במודל הכבשים של פרפור פרוזדורי למתוח-induced

מאמר זה מתאר את ההליכים הבסיסיים לעריכת ניסויים מיפוי אופטי בלב Langendorff-perfused הארנב באמצעות מערכת הדמיה פנורמית, ואת שיטת כפול (מתח סידן) הדמיה.

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

בסרטון זה אנו מבצעים זילוח מדרדר לנגנדורף של לב עכבר מבודד. במהלך ההליך, הפעילות הלבבית של הלב נשמרת על ידי ניקוב אותו לאחור עם פתרון זילוח דרך העורקים הכליליים באמצעות צינורית המוחדרת לתוך אבי העורקים העולה. המודל משמש לחקר הפתופיזיולוגיה הלבבית של הלב.

זילוח לב מדרדר לנגנדורף: טכניקת Ex Vivo לניקוב לב עכבר מבודד

לב החולדה המבודד הוא מודל מתמשך לפגיעה באיסכמיה. כאן, אנו מתארים את תהליך קצירת הלב הפועם מחולדה באמצעות קנולציה של אבי העורקים באתרה, זלוף לנגנדורף של הלב, סימולציה של פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה וצביעה על אוטם כדי לאשר את היקף העלבון האיסכמי.

אינדוקציה והערכה של איסכמיה reperfusion פגיעה בלבבות עכברוש Langendorff-perfused

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של (מ 'V) פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca 2 + בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של מטר V ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיפוי אופטי של פעילות חשמלית מן אטריום ימין בעכבר במיוחד צומת סין-פרוזדורים, ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן.

מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר

פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר ניצול מערכת מיפוי אופטי עם הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית רזולוציה גבוהה, כולל הקלטות כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + חולף תחת מתוכנת גירוי דרך קטטר אלקטרודה מיוחדת.

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

מטרת מחקר זה הייתה ליצור שיטה לחקירת דינמיקה קרדיולוגית באמצעות מודל בעלי חיים טרנסלבותית. הגישה הניסיונית המתוארת משלבת אופקרדיוגרפיה כפולה בשילוב עם מחקר אלקטרולוגי להערכת פעילות החשמל במודל לב פורצין מבודד, שלם.

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

פרוטוקול זה מציג מיפוי אופטי דו-צבעי של לבבות עכברים המתקבלים מחיות בר וחיות בר המושפעות מטכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית, כולל מדידות אלקטרופיזיולוגיות של מתח טרנסממברנה וטרנזיאנטים תוך-תאיים Ca2+ ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה.

מיפוי אופטי של לבבות בצבע כפול מעכברי RyR2R2474S של טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית

למד מיפוי אופטי של לב עכברוש בפרפוזיית Langendorff באמצעות צבע di-8-ANEPPS. שיטה זו מאפשרת מחקר מפורט של פעילות חשמלית בקרום הלב ותובנות לגבי דינמיקה קרדיאלית.

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

גלה סרטונים נוספים