הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured
29 במאי 2009
הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.
דימות תאים חיים הוא שימושי במיוחד בעת חקר הדינמיקה של תעבורה אורגנלית. סרטון זה ידגיש פרוצדורה המשמשת לדימות של גרנולות ליבה צפופה (dense core granules) בנוירונים של היפוקמפוס בתרבית. קומפלקסים של טרנספקציה מושגים תחילה על ידי ערבוב של מצע D-N-A-M-E-M ושל ריאגנט הטרנספקציה lipectomy.
מכיוון שנוירונים מההיפוקמפוס מעובדים על כיסויי זכוכית הפוכים הפונים לשכבה חד-שכבתית של גליות, יש להפוך את כיסויי הזכוכית הללו על מנת לחשוף אותם לסוכן הטרנספקציה. לאחר המתנה למשך זמן מספיק לביטוי של חלבונים בעלי ליבה צפופה (dense core vesicle proteins) המסומנים בתג GFP, בונים תא הדמיה. ניתן לבצע הדמיה של ICALs בעלי ליבה צפופה בנוירונים מתורבתים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב.
פרוטוקול זה הוא גמיש וניתן להתאימו לדמיון של אברונים אחרים כגון מיטוכונדריה, אנדוזומים ופרוקסיזומים. שלום, אני מייקל סילברמן וברוכים הבאים למעבדה שלי למדעי העצבים התאיים באוניברסיטת סיימון פרייזר. אנו מעוניינים לבחון כיצד אברונים נעים בתאי עצב.
כדי לגשת לשאלה זו, אנו מסמנים אבנים מבניות ממברנליות, ובמיוחד וסיקולות בעלות ליבה צפופה (dense core vesicles) בנוירונים של היפוקמפוס בתרבית. וכדי להראות לכם כיצד אנו עושים זאת, אני מעביר את הדברים לדייוויד. היי, אני דייוויד ממעבדת סילברמן.
היום אראה לכם פרוצדורה לדימות של תאים חיים של וסיקולות בעלות ליבה צפופה (dense core vesicles) ונוירונים בתרבית באמצעות מיקרוסקופיית שטח רחב (widefield microscopy). בואו נתחיל. עבור מרבית הניסויים, אנו משתמשים בצלחות של נוירוני היפוקמפוס של חולדה אשר גודלו בצפיפות תאים של 250,000 תאים לצלחת של 6 סנטימטרים. עבור כל טרנספקציה, סמנו שתי מבחנות של 1.5 מיליליטר, אחת עבור ה-plasmid DNA והשנייה עבור חומר הטרנספקציה.
בתוך מנדף זרימה למינרית, כדי לשלב מיקרוגרם אחד של plasmid DNA עם מאה מיקרוליטר של MEM במבחנה אחת בטמפרטורת החדר, ודאו שאתם משתמשים ב-MEM שאינו מכיל תוספים. שלבו שישה מיקרוליטר של lip עם מאה מיקרוליטר של MEM במבחנה השנייה. ניתן להשתמש בכמות זהה עבור double transfect, למרות שבמקרים אלו יחס ה-lip DNA יקטן בחצי.
כדי לשמר את חיי המדף של ריאגנט השומנים (lipid reagent), יש לשמור אותו בקירור או במקרר שולחני בכל עת; דגרו את המבחנות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את תערובת ה-DNA ב-MEM אל מבחנת השומנים וערבבו בעדינות עם APE, ולאחר מכן דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 25 דקות, הוסיפו 60 µL של 50 mM K neuronic acid כדי למזער נזק ציטוטוקסי לנוירונים המטופחים.
מכיוון שאנו מתרחלים נוירונים בצד התחתון של כיסויי זכוכית התלויים מעל שכבה אחת של GL, יש צורך להפוך את כיסויי הזכוכית ולחשוף את הנוירונים לתמיסת הטרנספקציה. הפכו בזהירות את הכיסויים, כך שהחלק התחתון יהיה פונה כלפי מעלה, באמצעות פינצטה סטרילית. סדרו אותם כך שלא יחפפו זה את זה.
היזהרו לא לגרד את המשטח המצופה ב-neuron של לבישן הכיסוי או את המשטח המצופה ב-ggl של הצלחת. בסיום הדגירה של 30 דקות, קחו כ-0.5 milliliters של מצע מהצלחת בתשעה סנטימטרים וערבבו בעדינות עם ה-DNA שבמבחנה. העבירו את תמיסת ה-DNA בחזרה לצלחת על ידי טפטוף אחיד על פני השטח של המצע.
החליקו בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה בכיוון אחד, אך הקפידו לא לגרום למצע להתנפח. לאחר הערבוב בכיוון אחד, עצרו וחזרו על הפעולה בכיוון הניצב כדי לפזר באופן אחיד את קומפלקסי ה-DNA lipectomy ברחבי הצלחת. דגרו למשך 90 דקות באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide.
לאחר הדגירה, הפכו את לבישי הכיסוי כך שצדם התחתיום יפנה למטה, וסדרו אותם כך שלא יחפפו. לבסוף, אפשרו לביטוי ה-DNA להימשך למשך הזמן הרצוי, שבדרך כלל הוא לילה אחד עד 48 שעות באינקובטור. דימוי חי של גרנולות ליבה צפופות המסומנות ב-GFP בנוירונים של היפוקמפוס בתרבית מחייב מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במצלמת CCD.
יהיה צורך בתא דימות עם בקר טמפרטורה ומחמם לעדשה. התא לא צריך להכיל פתחים פתוחים, התאמה שניתן לבקש בעת הזמנת התא. לאחר מכן, הפעילו את מצלמת המיקרוסקופ, את מנורת הפלורסצנט ואת התוכנה לרכישת תמונות.
הפעילו את אספקת החשמל לפלטפורמת התא והמחממי העדשות. זהו גם זמן מתאים למריחת טיפה של שמן על העדשות. כעת הכינו את הפלטפורמה המחוממת ותא הדמיון.
לנוחות המניפולציה, סמנו צד אחד של חלקו העליון של התא בעזרת טוש קבוע. הניחו את התא כאשר הצד העליון פונה כלפי מעלה על מכסה של מבחנה בנפח 50 milliliters, המשמש כמחזיק תא אידיאלי.
מרחו טבעת של גריז בחריץ המקיף את החור בדופן התא המסומן כ-top. הימנעו משימוש מוגבר בגריז, שכן הוא יחדור לתא ויצמצם את השטח הגלוי. השתמשו בפינצטה.
הצמד זכוכית כיסוי נקייה ולא שומשה, בגודל 18 סנטימטר, לצדו העליון של התא. הפעל לחץ עדין על קצוות זכוכית הכיסוי כדי ליצור אטימה הדוקה בתוך החריץ השקוע של התא. הפוך את התא ומרח טבעת גריז דומה על החריץ בצד הנגדי או התחתון של התא.
העבירו 750 µL של מדיום דימוי לתא. זוהי כמות עודפת, אך הגריז אמור למנוע מהמדיום להישפך, והעודף ימנע כלואת בועות בעת הנחת לוכית הכיסוי המכסה את התאים. שמרו את התא המוכן באינקובטור לתרביות רקמה עד למועד השימוש.
יש להימנע מדגירות ממושכות של שעה או יותר, שכן מדיום הדימות יתאדה והרכבו ישתנה. לצורך הרכבת התא הסופית עבור דימוי של מחזורי חיים (lifestyle imaging), העבירו את התא המוכנה ואת הצלחת עם לביבות הזכוכית (cover slips) שעברו טרנספקציה מהאינקובטור למנדף לתרבית רקמות. בעזרת פינצטה סטרילית, הוציאו בזהירות לביבת זכוכית אחת מהצלחת שעברה טרנספקציה.
לאחר מכן, הצמידו את קצה זכוכית הכיסוי למגבון Kimwipe כדי לספוג את מצע הגידול. כעת, הניחו את זכוכית הכיסוי כאשר צד הנוירונים פונה כלפי מטה אל תוך התא המוכן. הצמידו תחילה צד אחד של זכוכית הכיסוי לגריז והפעילו לחץ מסביב לקצוות כדי להניח את זכוכית הכיסוי בצורה שטוחה מבלי לכלוא בועות.
צפוי שתוספת של מדיום הדימוג תישפך החוצה; נגבו את עודפי מדיום הדימוג, אך היזהרו לא להזיז את זכוכית הכיסוי ממקומה. העבירו את התא למחמם הפלטפורמה שחומם מראש והדקו את התא במקומו. לאחר מכן, העבירו את התא לבמה כדי להפחית פוטובליצ'ינג (photobleaching) ופוטוטוקסיות (phototoxicity).
כוון את המנורה לעוצמה המינימלית הדרושה כדי למצוא את התאים שעברו טרנספקציה. כעת מצא תא בעל עניין. בעת שימוש בעדשת שמן בעוצמה נמוכה, כגון 40 x, מומלץ להיצמד לתבנית חיפוש מתוכננת כדי להבטיח כיסוי מקסימלי של כיסוי הזריקה (cover slip) ולהימנע מרכישת תמונות כפולות.
לאחר איתור השדה הרצוי, העבירו את הערוץ לחלבון המעניין המסומן פלואורסצנטית. עברו לעדשת שמן בהגדלה גבוהה, כגון 60 עד 100x, והחזירו את עוצמת המנורה להגדרה גבוהה. השתמשו ברכישת זרימה (stream acquisition) או בפונקציה מקבילה בתוכנת הדימוג שלכם כדי להקליט את הדינמיקה של החלבון המסומן פלואורסצנטית עבור אבנים רב-תאיות (organelles) הנעות במהירות. יש למזער את זמן החשיפה ואת ההשהיה בין החשיפות כדי להפיק הקלטות בקצב פריימים גבוה.
ניתן לתקן בזמן אמת סחף מוקד (focal drift) הנצפה בתצוגה המקדימה על המסך באמצעות כוונון מיקוד ידני. הקפידו לצלם תמונת פאזה וכל תמונה נלווית אחרת הדרושה לניתוח ולהצגה מאוחרים יותר. שמרו את כל התמונות לפני המשך סריקת לבישת הכיסוי וביצוע ההקלטה הבאה.
בדרך כלל, שלוש עד חמש הקלטות מכיסוי זכוכית אחד נחשבות למוצלחות, וכל כיסוי זכוכית מצולם למשך 30 עד 60 דקות. יש לקחת בחשבון פוטוטוקסיות ובריאות כללית של התאים, שכן התובעים פחיתים בתאים פגומים. תצפיות בדימות תאי חיים מורכבות בדרך כלל מהקלטות, המכונות גם ערימות תמונות (stacks), המראות תנועה של אברונים המסומנים פלואורסצנטית בתוך שדה הראייה. להלן סרטון מייצג של תובעת dense core iCal.
הצבע הופך כדי להקל על התצפית. שימו לב לחלקיקים הנעים. גרפי CH הם תמונות הממחישות את תנועת החלקיקים באמצעות הצמדת סריקות קו, שבהן כל נקודת זמן מיוצגת על ידי עמודה בגרף.
איור זה מדגים כיצד שני חלקיקים הנעים בכיוונים מנוגדים מיוצגים בגרף CH. ניתוח נוסף של כרונוגרפים יכול לספק מידע על מהירות שטף החלקיקים, היפוכים באורך המסלול וחלקיקים סטציונריים. שלום, הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע הקלטות במהירות גבוהה של הובלת שלפוחיות dsco בתוך נוירונים תרביתיים של היפוקמפוס.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לחמם מראש את כל רכיבי תא הדמיה והפלטפורמה כדי להפחית את העקה בתאים במהלך מעברם מהאינקובטור לבמה. יש לעבוד במהירות אך בזהירות. וזהו זה.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לדימות חי של שלפוחיות בעלות ליבה צפופה (dense-core vesicles) בנוירונים של היפוקמפוס בתרבית, באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשדה רחב (wide-field). השיטה ניתנת להתאמה לדימוי של אבנים אחרות, ובכך היא משפרת את חקר הדינמיקה של תעבורת אבנים בתא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- דימיון תאים חיים הוא קריטי להבנת הדינמיקה של אבנים (organelles).
- שלפוחיות בעלות ליבה צפופה (Dense-core vesicles) ממלאות תפקיד משמעותי בתפקוד עצבי.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב היא כלי דימיון רב עוצמה.
- נוירונים מההיפוקמפוס משמשים בדרך כלל למחקרים מסוג זה.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט לדימות של שלפוחיתים בעלי ליבה צפופה (dense-core vesicles).
- סיוע בחקר תנועת אברונים בנוירונים.
- הדגמת יכולת ההתאמה של פרוטוקול הדימות לאברונים אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת קומפלקסים לטרנספקציה באמצעות מצע D-N-A-M-E-M.
- טרנספקציה של נוירונים של ההיפוקמפוס שגודלו בתרבית עם חלבונים המסומנים ב-GFP.
- בניית תא הדמיה עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- הדמיה חיה של וסיקולות בעלות ליבה צפופה (dense-core vesicles) באמצעות מיקרוסקופיה בשדה רחב (wide-field microscopy).
תוצאות עיקריות
- דימוי מוצלח של שלפוחיות בעלות ליבה צפופה (dense-core vesicles) בנוירונים חיים.
- הדגמה של הדינמיקה של תעבורת אברונים.
- התאמה של הפרוטוקול לדימוי של אברונים אחרים.
- תובנות לגבי תפקידן של שלפוחיות בעלות ליבה צפופה בפעילות נוירונלית.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של דינמיקת אברונים בנוירונים.
- דימות תאים חיים הוא כלי בעל ערך למחקר במדעי המוח.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו עבור אברונים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות חי של שלפוחיות בעלות ליבה צפופה (dense-core vesicles) בנוירונים ראשוניים מאפשר תצפית ישירה על דינמיקת ההובלה של האברונים, תהליך מרכזי באיתות נוירונלי ובפונקציה סינפטית. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות ביולוגיות על ידי אספקת מדדים תפקודיים של הובלה, שחרור ומיחזור של שלפוחיות במודלים נוירונליים הרלוונטיים למחלה. התאמתה של השיטה לאברונים מרובים והיישום שלה בעלות נמוכה הופכים אותה למתאימה להפחתת סיכונים (de-risking) מכניסטיים בשלבים מוקדמים של תוכניות למחלות נוירודגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי הובלה של וסיקולות בנוירונים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של דינמיקת וסיקולות בעלות ליבה צפופה (dense-core vesicles) בנוירונים ראשוניים של ההיפוקמפוס שהוצאו לתרבית.
- ערך ניבוי: מסייע בהערכת השפעות המעורבות עם המטרה (target engagement) על הובלת אברונים, ובכך תורם לתעדוף של תרכובות מובילות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מודלים עצביים שעברו וולידציה, המתאימים לסריקת תרכובות במערכים המשכיים ולמחקרים של מודולציה של מסלולים.
- תוצרים כמותיים: מאפשר מדידה של מהירות שלפוחיות, אורך ריצה ושטף כיווני באמצעות ניתוח קימוגרף לצורך הערכה השוואתית של תנאים.
- יכולת הרחבה ושימוש חוזר: תואם למיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשטח רחב (wide-field), מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור אברונים ותנאים ניסיוניים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה באופן ישיר תהליכים עצביים המעורבים בהפרעות נוירודגנרטיביות שבהן הובלת שלפוחיות (vesicle trafficking) פגועה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תצפיות בשלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית בנוירונים ראשוניים.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק תובנות מכניסטיות המנחות החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בהתבסס על הצלה תפקודית או שיבוש של פנוטיפים של הובלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, ובמיוחד עבור תוכניות המתמקדות במדעי המוח.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של גנים או תרכובות המשפיעים על תעתוע של שלפוחיות, שחרורן או קוטביות עצבית.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות טרנספקציה סטנדרטית ודימוי של חלבוני שלפוחיות מתויגים ב-GFP בנוירונים של ההיפוקמפוס.
- אנליטיקה: מייצר תוצרי קריאה כמותיים כגון מהירות חלקיקים, אורך ריצה ותנועה כיוונית באמצעות ניתוח קימוגרף וכרונוגרף.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מידול מערכות נוירונליות הרלוונטיות למחלה, שבהן תפקוד לקוי של שלפוחיות בעלות ליבה צפופה (dense-core vesicles) תורם לפתולוגיה.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצג יכולת דימוי גמישה ובעלת עלות נמוכה, שניתן להחילה על אברונים מרובים (למשל, מיטוכונדריה, אנדוזומים) וניתן להעבירה בין פרויקטים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי צמצום העמימות בהבנה המכניסטית של דינמיקת אברונים עצביים.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקולים ניתנים לשחזור של טרנספקציה, הכנת תאי תרבית ודימיג.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להערכה תפקודית מוקדמת של יעדים באמצעות תשתית מיקרוסקופיה נגישה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכון על ידי זיהוי תרכובות המווסתות תעבורת שלפוחיות במודלים עצביים מאומתים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות ראשוניות של נוירונים, טרנספקציה וטכניקות של דימוי תאים חיים.
- תלוי במיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשדה רחב עם מצלמת CCD, תא בבקרה תרמית וחימום של העדשה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור יעילות הטרנספקציה, תנאי הדימוי ואנליזה מבוססת קיימוגרף.
- התאמה לאברונים אחרים דורשת תיקוף של קונסטרוקטים מתויגים ב-GFP ואופטימיזציה של רמות הביטוי כדי למנוע ארטיפקטים של ביטוי-יתר.
- מגבלות מעשיות כוללות שיעורי טרנספקציה נמוכים (~0.5%), המחייבים צפיפות תרבית מספקת לצורך אנליזה של תא בודד וזמני סריקה ממושכים יותר כדי ללכוד מספר מספיק של אירועים.
