Name: הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למד הדמיה חיה של צפופה ליבות בשיטת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה רחבת שדה בנוירונים היפוקמפליים מתורבתים. פרוטוקול זה מאפשר חקר דינמיקת תנועת אברונים וניתן להתאימו לאברונים נוספים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים הרלד Hutter והלנה דקר קריאה זהירה של כתב היד הזה שלהם. כמו כן, אנו מודים רג Sidhu מ Leica Microsystems עבור המומחיות הטכנית שלו. מחקר זה נתמך על ידי למדעים והנדסה המועצה הלאומית של קנדה, פרס # 327100-06, ואת סיימון פרייזר סגל אוניברסיטת המדע.

חלק 1: transfection של הנוירונים באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ציוד הגדרת: חולדה או עכבר נוירונים בהיפוקמפוס הם מתורבתים לפי Kaech והבנקאי, 2006 [4]. צפיפות התאים טיפוסי המשמש transfections הוא 250,000 צלחת cells/6-cm. ריאגנטים חובה וציוד כוללים חומצה 50 mM kynurenic, בעל קבוע צינור benchtop, צידנית benchtop (הטובה ביותר לשמור על קור מגיב Lipofectamine), מגיב Lipofectamine, מזכרות, צינורות microfuge, micropipetters ו מלקחיים סטרילית. נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תווית transfection two 1.5 מ&quot;ל צינורות, אחד כדי להכיל את ה-DNA פלסמיד, אחד להכיל את מגיב transfection. Incubations הבאים יכולים להמשיך בטמפרטורת החדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 1.0 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד עם ממ 100 μL בצינור אחד (ללא תוספים מכל סוג, ממ לא צריך להיות בטמפרטורה של pH equilibrated). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 6.0 Lipofectamine μL עם ממ 100 μL בצינור 1.5 מ&quot;ל אחרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין התאמות עבור transfections כפול נדרשים אף Lipofectamine: יחס ה-DNA יהיה חצוי במקרים כאלה. יחס Lipofectamine: DNA הוא עדיין בתוך ההצעה של היצרן. מומלץ לבדוק 0.5-1.0 מיקרוגרם לכל פלסמיד ביטוי אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמר את חיי המדף של מגיב Lipofectamine, יש להסיר מהמקרר זמן קצר ככל האפשר והניחו במקרר benchtop כאשר אינו בשימוש. סה&quot;כ זמן מהמקרר צריך להישמר עד למינימום. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פתרון ה-DNA ב-ממ לתוך הצינור שומנים בדם, לערבב בעדינות עם טפטפת, ואז דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 25 דקות, לפני coverslips מרפרף, להוסיף 60 μL של חומצה kynurenic 50 מ&quot;מ עד כדי למזער את הנזק excitoxic המנה של נוירונים בתרבית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips להפוך בזהירות רגל בצד למעלה באמצעות מלקחיים סטריליות, ולסדר כך שהם לא חופפים. היזהר שלא לגרד את פני השטח של נוירון מצופה coverslip או גליה משטח מצופה של המנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כ 0.5 מ&quot;ל של מדיום מצלחת 6 ס&quot;מ ו לערבב בעדינות עם ה-DNA במבחנה, להעביר את פתרון ה-DNA חזרה צלחת מטפטפים באופן אחיד על פני השטח של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל מערבולת, אבל בעדינות להחליק צלחת הלוך ושוב בכיוון אחד, אז להפסיק וחזור בכיוון הניצב שווה להפיץ את ה-DNA Lipofectamine קומפלקסים. דגירה במשך 90 דקות ב בתרבית רקמה אינקובטור (37 ° C CO, 5% 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips פליפ רגל בצד למטה, ולסדר כך שהם לא חופפים. לאפשר ביטוי להמשיך לזמן הרצוי, לילה בדרך כלל עד 48 שעות. </li></ol> חלק 2: הדמיה חיה של ה-GFP-tagged צפופה ליבות שלפוחית ​​ב נוירונים בהיפוקמפוס תרבותי ציוד הגדרת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה של תאים חיים דורשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת CCD, אנו משתמשים DMI לייקה מיקרוסקופ 6000B הפוך מצויד המשתנה לייקה, מנורת הניאון. נדרש גם הוא חדר הדמיה עם בקר טמפרטורה דוד אובייקטיבי. אנו משתמשים מכשירים וורנר RC-21BR שונה עבור coverslip 18 מ&quot;מ בנוסף דוד פלטפורמה (קט # PH2) ו בקר טמפרטורה (קט # TC324B). החדר אינו מכיל יציאות פתוחות, שינוי זה יכול להיכלל בעת הזמנת החדר. דוד המטרה מומלץ מאוד כדי לעזור לשמור על הטמפרטורה של coverslip ולמזער את שינויי המיקוד בשל תנודות הטמפרטורה. תמונות נרכשים עם Hamamatsu אורקה-ER באמצעות Metamorph (התקנים מולקולריים) תוכנה כולל מצב &quot;זרימה&quot; של רכישת הנפתחת ב. שים לב, אנחנו לא משתמשים תא אקלים המקיף את המיקרוסקופ כולו. בנוסף זה יקר ולא הכרחי הדמיה לטווח קצר המתואר כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד אחרים כוללים חומרים כימיים טרי מוכן בינוני הדמיה חיים (1X הנקס עם Ca 2 + ו - Mg 2 +, גלוקוז 0.6% ו HEPES 10mm), תוספת 18 מ&quot;מ coverslips זכוכית, מלקחיים סטריליות, הלא סטרילית מלקחיים, Kimwipes, גריז ואקום ו מזרק (ללא מחט או עם מחט רחב נשא שונה) שבה כדי למרוח משחה. </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הדמיה טרי בינוני לחיות (1X הנקס עם Ca 2 + ו - Mg 2 +, גלוקוז 0.6% ו HEPES 10mm). אנחנו בדרך כלל להכין 50mls בכל פעם ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס כאשר אינו בשימוש. עדיף להכין מספיק במשך שבוע לא יותר, אחד בכל פעם. כ 5-10 מ&quot;ל משמשים לכל צלחת של נוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מיקרוסקופ, מצלמה, מנורת פלורסנט, ורכישת תוכנה התמונה. כמו כן להפעיל את הכוח פלטפורמת קאמרית תנורי אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את לדמייןg קאמרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדר וורנר כולל טפלון להכניס את הרכבה של coverslips. על מנת להקל על, לצד מניפולציה תווית אחת של &quot;למעלה&quot; להכניס את הסמן קבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת טבעת של שומן כדי חריץ המקיף את החור בצד של החדר שכותרתו &quot;מלמעלה&quot;. הימנעו משימוש עודף כפי שהוא ייכנס קאמרית לצמצם את השטח הנצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לצרף נקי, ללא שימוש coverslip 18 ס&quot;מ בצד &quot;למעלה&quot; של החדר, להפעיל לחץ עדין coverslip בשוליה ליצור חותם חזק בתוך החריץ הפסקה של החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את החדר מעל ולהחיל טבעת דומה של שומן כדי חריץ בצד (התחתון) מול האולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצד מוכן הקאמרית מלמטה למעלה, על מכסה של שפופרת של 50 מ&quot;ל, שהוא בעל תא אידיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 750 μL של המדיום הדמיה לחדר. זוהי כמות מוגזמת, אבל שומן צריך למנוע את המדיום מלגלוש שוב עודף תסייע למנוע בועות מלהיות לכוד כאשר coverslip תא מכוסה מוחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על חדר שהוכן בתרבית רקמה החממה עד הצורך. Incubations ממושכת, ~ 1 שעה יש להימנע ככל בינוני הדמיה יתאדה ושינוי בהרכב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הרכבה הסופי תא הדמיה תא חי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את החדר מוכן צלחת coverslips transfected מן החממה עד למכסה המנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה תא הסופי צריך להתבצע במהירות, כדי להבטיח את התאים להישאר שקוע בינוני ב 37 ° C ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, בזהירות להסיר את אחד coverslip מצלחת transfected, לגעת בקצה coverslip כדי Kimwipe להתרחק בינוני צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslip נוירון בצד למטה אל החדר מוכן. מגע צד אחד של coverslip כדי גריז הראשונה להפעיל לחץ בקצוות להביא את coverslip שטוח ללא בועות השמנה. אמצעי הדמיה עודף תישפך החוצה כצפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את המדיום הדמיה עודף, אבל להיזהר שלא להחליק את coverslips מתוך עמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את תא אל תנור מחומם מראש את הפלטפורמה ואת להדק את החדר במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לתא לבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית photobleaching ו photoxicity, להתאים את המנורה לסכום מינימום של עוצמת צורך למצוא תאים transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא תא עניין עם מטרה הנפט נמוך הגדלה (40X). זה מועיל להיצמד לדפוס החיפוש מתוכננת כדי להבטיח כיסוי coverslip מירבית כדי למנוע רכישות התמונה מיותר, שמאל למשל, החלק העליון של coverslip, סריקה למעלה ולמטה עובד ימינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מטרה הנפט הגבוהים בהגדלה (60 100x) פעם שדה הרצוי אותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;הרכישה זרם&quot; או פונקציה דומה של תוכנות הדמיה שלך כדי להקליט וידאו של הדינמיקה חלבון fluorescently שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו תמונה שלב וכל התמונות הנלוות אחרים (GFP מסיסים למשל) לצורך ניתוח מאוחר יותר במצגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל התמונות לפני לחקור את coverslip נוסף הקלטת וידאו הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל 3-5 קטעי וידאו מ coverslip אחד הוא נחשב מוצלח. Phototoxicity בריאות כללית תא יש לזכור כמו תחבורה מוקטן התאים הפגועים. בריאות Cell ניתן לנטר באמצעות תצפיות באמצעות מיקרוסקופ פאזות. בדרך כלל מבוצעות הקלטות למשך כ 30 דקות לכל coverslip. </li></ol></li></ol> חלק 3: תוצאות נציג: חיים הדמיה תצפיות התא בדרך כלל מורכבת של קטעי וידאו (המכונה גם &quot;ערימות&quot; של תמונות) המראים תנועת האברונים fluorescently-tagged בתחום של תצוגה (איור 1 א). ליווי כל וידאו לעיתים קרובות תומכים תמונות להמחשת הכיוון של שדה הראייה ביחס לרמת הגוף, התא של ביטוי חלבון ו / או בריאות של התא. סרטי וידאו של התחבורה יכולה להיות נתונה ניתוח כמותי על ידי שינוי כדי kymographs (איור 1B). Kymographs הם תמונות הממחישות תנועת החלקיקים מעמיד זה בצד זה על ידי סריקות קו הזמן שבו כל נקודה מיוצגת על ידי טור רשם גלים. איור 2 מראה כיצד שני חלקיקים נעים בכיוון ההפוך מיוצגים רשם גלים. ניתוח נוסף של kymographs יכול לספק מידע על שטף החלקיקים, מהירות, אורך לרוץ, תהפוכות, וחלקיקים נייח. <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> באיור 1. חיים נציג תא הדמיה תצפיות. (א) תמונות נבחרות מתוך וידאו של mCherry-tagged רקמות plasminogen Activator (TPA) הובלה. חלקיקים בודדים נעים אנטרוגרדית (חיצים ירוקים) ו מדרדר (חיצים אדומים) כיוונים מצוינים. (ב) Kymographs הממחישות TPA-mCherry התנועההאקסון. קווים אופקיים ב kymographs מייצגים אובייקטים נייחים, ואילו קווים אלכסוניים מייצגים האברונים מתרחק (שיפוע חיובי) או לכיוון (שיפוע שלילי) גוף התא. חיצים ירוקים ואדומים ארוכים המופע רץ המתאים החלקיקים (A). שינויים בתחבורה עקב מגיב microtubule depolymerizing, nocodazole, מתוארת גם עם רשם גלים. הערה צמצום האברונים נע בהעדר קווים אלכסוניים.

<ol><li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li>
<li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li>
<li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

הדמיה תא חי היא טכניקה מאתגרת, אך רב עוצמה עבור תצפית ישירה של תחבורה אברון בנוירונים בתרבית. הקשיים יכולים לנבוע במעלה הזרם של ההליך עם נוירון בריאות לעניים בשל סיבוכים תרבות. לכן, בריאות תא (לדוגמאות ראו נ&quot;צ. 4) יש לבחון לפני ואחרי transfection ידי התבוננות coverslips בעוד בינוני צמיחה באמצעות תרביות רקמה מיקרוסקופ אור. תהליך העברת נוירון המכילים coverslips לחדר הדמיה יכול להיות מלחיץ את התאים, ולכן חשוב לנקוט בזהירות כאשר מניפולציה של coverslips. זה יכול להיות נפוץ מראה בר...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?ID=1144">Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons</a>. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:

David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

A correction to author names has been made for article Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<table><tbody><tr><td>MEM-Eagle עם מלחים של Earle ו-L-glutamine</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>ריאגנט טרנספקציה</td></tr><tr><td>10X Hanks עם Ca2+ ו-Mg2+</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-052</td><td>מצע לדימוי חי</td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>מצע לדימוי חי</td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס cultured

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

התבוננות ואפיון תהליכים תאיים דינמי יכולה להניב מידע חשוב על פעילות הסלולר שלא ניתן שנרכשו תמונות סטטיות. בדיקות ניאון ויטל, חלבון פלואורסצנטי ירוק במיוחד (GFP) חוללו מהפכה בביולוגיה של התא הנובע היכולת לתייג תאים תאיים מסוימים ומבנים הסלולר. כך, למשל, הדמיה חיה של ה-GFP (וגירסאות ספקטרלי שלה) מפלצות אפשרו לניתוח דינמי של cytoskeleton, תחבורה אברון, ואת הדינמיקה קרום שפע של אורגניזמים סוגי תאים [1-3]. למרות הדמיה חיים הפך להיות שכיח, גישה זו עדיין מציבה אתגרים טכניים רבים, בעיקר נוירונים בתרבית ראשונית. אתגר אחד הוא ביטוי של GFP-tagged חלבונים שלאחר mitotic נוירונים, והשני הוא היכולת ללכוד תמונות פלורסנט תוך מזעור phototoxicity, photobleaching, ושמירה על בריאות התא הכללי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מתאר שיטה השומנים מבוסס transfection כי התשואות transfection שיעור נמוך יחסית (~ 0.5%), אולם הוא אידיאלי עבור הדמיה של נוירונים מקוטב במלואו. שיעור נמוך transfection חיונית כל כך אקסונים יחיד דנדריטים ניתן לאפיין את האוריינטציה שלהם אל גוף התא כדי לאשר את הכיווניות של תחבורה, כלומר האנטרוגרד נ מדרדר. הגישה שלנו הדמיה GFP להביע נוירונים מסתמך על מיקרוסקופ רחב בתחום תקן פלורסנט ומצויד במצלמה CCD, לכידת תמונה תוכנה, וחדר הדמיה מחומם. יש לנו הדמיה מגוון רחב של אברונים או מבנים, למשל, צפוף ליבות שלפוחית, המיטוכונדריה, חרוטים צמיחה, אקטין ללא אופטיקה מיוחד או דרישות עירור אחר מאשר מקור אור ניאון. בנוסף, spectrally-ברורים, חלבונים שכותרתו fluorescently, למשל, ה-GFP ו-dsRed מתויג חלבונים, יכול להיות בו זמנית ליד דמיינו לאפיין שיתוף תחבורה או אחר אירועים הסלולר מתואמות. הגישה הדמיה המתואר כאן הוא גמיש עבור מגוון של יישומים הדמיה יכול להיות מאומץ על ידי מעבדה בעלות קטנה יחסית בתנאי מיקרוסקופ זמין.

הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

תצפיות ואפיון של תהליכים תאיים דינמיים עשויים לספק מידע חשוב על פעילות תאית שלא ניתן להפיק מתמונות סטטיות.

דימות תאים חיים הוא שימושי במיוחד בעת חקר הדינמיקה של תעבורה אורגנלית. סרטון זה ידגיש פרוצדורה המשמשת לדימות של גרנולות ליבה צפופה (dense core granules) בנוירונים של היפוקמפוס בתרבית. קומפלקסים של טרנספקציה מושגים תחילה על ידי ערבוב של מצע D-N-A-M-E-M ושל ריאגנט הטרנספקציה lipectomy.מכיוון שנוירונים מההיפוקמפוס מעובדים על כיסויי זכוכית הפוכים הפונים לשכבה חד-שכבתית של גליות, יש להפוך את כיסויי הזכוכית הללו על מנת לחשוף אותם לסוכן הטרנספקציה. לאחר המתנה למשך זמן מספיק לביטוי של חלבונים בעלי ליבה צפופה (dense core vesicle proteins) המסומנים בתג GFP, בונים תא הדמיה. ניתן לבצע הדמיה של ICALs בעלי ליבה צפופה בנוירונים מתורבתים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב.פרוטוקול זה הוא גמיש וניתן להתאימו לדמיון של אברונים אחרים כגון מיטוכונדריה, אנדוזומים ופרוקסיזומים. שלום, אני מייקל סילברמן וברוכים הבאים למעבדה שלי למדעי העצבים התאיים באוניברסיטת סיימון פרייזר. אנו מעוניינים לבחון כיצד אברונים נעים בתאי עצב.כדי לגשת לשאלה זו, אנו מסמנים אבנים מבניות ממברנליות, ובמיוחד וסיקולות בעלות ליבה צפופה (dense core vesicles) בנוירונים של היפוקמפוס בתרבית. וכדי להראות לכם כיצד אנו עושים זאת, אני מעביר את הדברים לדייוויד. היי, אני דייוויד ממעבדת סילברמן.היום אראה לכם פרוצדורה לדימות של תאים חיים של וסיקולות בעלות ליבה צפופה (dense core vesicles) ונוירונים בתרבית באמצעות מיקרוסקופיית שטח רחב (widefield microscopy). בואו נתחיל. עבור מרבית הניסויים, אנו משתמשים בצלחות של נוירוני היפוקמפוס של חולדה אשר גודלו בצפיפות תאים של 250,000 תאים לצלחת של 6 סנטימטרים. עבור כל טרנספקציה, סמנו שתי מבחנות של 1.5 מיליליטר, אחת עבור ה-plasmid DNA והשנייה עבור חומר הטרנספקציה.בתוך מנדף זרימה למינרית, כדי לשלב מיקרוגרם אחד של plasmid DNA עם מאה מיקרוליטר של MEM במבחנה אחת בטמפרטורת החדר, ודאו שאתם משתמשים ב-MEM שאינו מכיל תוספים. שלבו שישה מיקרוליטר של lip עם מאה מיקרוליטר של MEM במבחנה השנייה. ניתן להשתמש בכמות זהה עבור double transfect, למרות שבמקרים אלו יחס ה-lip DNA יקטן בחצי.כדי לשמר את חיי המדף של ריאגנט השומנים (lipid reagent), יש לשמור אותו בקירור או במקרר שולחני בכל עת; דגרו את המבחנות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את תערובת ה-DNA ב-MEM אל מבחנת השומנים וערבבו בעדינות עם APE, ולאחר מכן דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 25 דקות, הוסיפו 60 µL של 50 mM K neuronic acid כדי למזער נזק ציטוטוקסי לנוירונים המטופחים.מכיוון שאנו מתרחלים נוירונים בצד התחתון של כיסויי זכוכית התלויים מעל שכבה אחת של GL, יש צורך להפוך את כיסויי הזכוכית ולחשוף את הנוירונים לתמיסת הטרנספקציה. הפכו בזהירות את הכיסויים, כך שהחלק התחתון יהיה פונה כלפי מעלה, באמצעות פינצטה סטרילית. סדרו אותם כך שלא יחפפו זה את זה.היזהרו לא לגרד את המשטח המצופה ב-neuron של לבישן הכיסוי או את המשטח המצופה ב-ggl של הצלחת. בסיום הדגירה של 30 דקות, קחו כ-0.5 milliliters של מצע מהצלחת בתשעה סנטימטרים וערבבו בעדינות עם ה-DNA שבמבחנה. העבירו את תמיסת ה-DNA בחזרה לצלחת על ידי טפטוף אחיד על פני השטח של המצע.החליקו בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה בכיוון אחד, אך הקפידו לא לגרום למצע להתנפח. לאחר הערבוב בכיוון אחד, עצרו וחזרו על הפעולה בכיוון הניצב כדי לפזר באופן אחיד את קומפלקסי ה-DNA lipectomy ברחבי הצלחת. דגרו למשך 90 דקות באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide.לאחר הדגירה, הפכו את לבישי הכיסוי כך שצדם התחתיום יפנה למטה, וסדרו אותם כך שלא יחפפו. לבסוף, אפשרו לביטוי ה-DNA להימשך למשך הזמן הרצוי, שבדרך כלל הוא לילה אחד עד 48 שעות באינקובטור. דימוי חי של גרנולות ליבה צפופות המסומנות ב-GFP בנוירונים של היפוקמפוס בתרבית מחייב מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במצלמת CCD.יהיה צורך בתא דימות עם בקר טמפרטורה ומחמם לעדשה. התא לא צריך להכיל פתחים פתוחים, התאמה שניתן לבקש בעת הזמנת התא. לאחר מכן, הפעילו את מצלמת המיקרוסקופ, את מנורת הפלורסצנט ואת התוכנה לרכישת תמונות.הפעילו את אספקת החשמל לפלטפורמת התא והמחממי העדשות. זהו גם זמן מתאים למריחת טיפה של שמן על העדשות. כעת הכינו את הפלטפורמה המחוממת ותא הדמיון.לנוחות המניפולציה, סמנו צד אחד של חלקו העליון של התא בעזרת טוש קבוע. הניחו את התא כאשר הצד העליון פונה כלפי מעלה על מכסה של מבחנה בנפח 50 milliliters, המשמש כמחזיק תא אידיאלי.מרחו טבעת של גריז בחריץ המקיף את החור בדופן התא המסומן כ-top. הימנעו משימוש מוגבר בגריז, שכן הוא יחדור לתא ויצמצם את השטח הגלוי. השתמשו בפינצטה.הצמד זכוכית כיסוי נקייה ולא שומשה, בגודל 18 סנטימטר, לצדו העליון של התא. הפעל לחץ עדין על קצוות זכוכית הכיסוי כדי ליצור אטימה הדוקה בתוך החריץ השקוע של התא. הפוך את התא ומרח טבעת גריז דומה על החריץ בצד הנגדי או התחתון של התא.העבירו 750 µL של מדיום דימוי לתא. זוהי כמות עודפת, אך הגריז אמור למנוע מהמדיום להישפך, והעודף ימנע כלואת בועות בעת הנחת לוכית הכיסוי המכסה את התאים. שמרו את התא המוכן באינקובטור לתרביות רקמה עד למועד השימוש.יש להימנע מדגירות ממושכות של שעה או יותר, שכן מדיום הדימות יתאדה והרכבו ישתנה. לצורך הרכבת התא הסופית עבור דימוי של מחזורי חיים (lifestyle imaging), העבירו את התא המוכנה ואת הצלחת עם לביבות הזכוכית (cover slips) שעברו טרנספקציה מהאינקובטור למנדף לתרבית רקמות. בעזרת פינצטה סטרילית, הוציאו בזהירות לביבת זכוכית אחת מהצלחת שעברה טרנספקציה.לאחר מכן, הצמידו את קצה זכוכית הכיסוי למגבון Kimwipe כדי לספוג את מצע הגידול. כעת, הניחו את זכוכית הכיסוי כאשר צד הנוירונים פונה כלפי מטה אל תוך התא המוכן. הצמידו תחילה צד אחד של זכוכית הכיסוי לגריז והפעילו לחץ מסביב לקצוות כדי להניח את זכוכית הכיסוי בצורה שטוחה מבלי לכלוא בועות.צפוי שתוספת של מדיום הדימוג תישפך החוצה; נגבו את עודפי מדיום הדימוג, אך היזהרו לא להזיז את זכוכית הכיסוי ממקומה. העבירו את התא למחמם הפלטפורמה שחומם מראש והדקו את התא במקומו. לאחר מכן, העבירו את התא לבמה כדי להפחית פוטובליצ'ינג (photobleaching) ופוטוטוקסיות (phototoxicity).כוון את המנורה לעוצמה המינימלית הדרושה כדי למצוא את התאים שעברו טרנספקציה. כעת מצא תא בעל עניין. בעת שימוש בעדשת שמן בעוצמה נמוכה, כגון 40 x, מומלץ להיצמד לתבנית חיפוש מתוכננת כדי להבטיח כיסוי מקסימלי של כיסוי הזריקה (cover slip) ולהימנע מרכישת תמונות כפולות.לאחר איתור השדה הרצוי, העבירו את הערוץ לחלבון המעניין המסומן פלואורסצנטית. עברו לעדשת שמן בהגדלה גבוהה, כגון 60 עד 100x, והחזירו את עוצמת המנורה להגדרה גבוהה. השתמשו ברכישת זרימה (stream acquisition) או בפונקציה מקבילה בתוכנת הדימוג שלכם כדי להקליט את הדינמיקה של החלבון המסומן פלואורסצנטית עבור אבנים רב-תאיות (organelles) הנעות במהירות. יש למזער את זמן החשיפה ואת ההשהיה בין החשיפות כדי להפיק הקלטות בקצב פריימים גבוה.ניתן לתקן בזמן אמת סחף מוקד (focal drift) הנצפה בתצוגה המקדימה על המסך באמצעות כוונון מיקוד ידני. הקפידו לצלם תמונת פאזה וכל תמונה נלווית אחרת הדרושה לניתוח ולהצגה מאוחרים יותר. שמרו את כל התמונות לפני המשך סריקת לבישת הכיסוי וביצוע ההקלטה הבאה.בדרך כלל, שלוש עד חמש הקלטות מכיסוי זכוכית אחד נחשבות למוצלחות, וכל כיסוי זכוכית מצולם למשך 30 עד 60 דקות. יש לקחת בחשבון פוטוטוקסיות ובריאות כללית של התאים, שכן התובעים פחיתים בתאים פגומים. תצפיות בדימות תאי חיים מורכבות בדרך כלל מהקלטות, המכונות גם ערימות תמונות (stacks), המראות תנועה של אברונים המסומנים פלואורסצנטית בתוך שדה הראייה. להלן סרטון מייצג של תובעת dense core iCal.הצבע הופך כדי להקל על התצפית. שימו לב לחלקיקים הנעים. גרפי CH הם תמונות הממחישות את תנועת החלקיקים באמצעות הצמדת סריקות קו, שבהן כל נקודת זמן מיוצגת על ידי עמודה בגרף.איור זה מדגים כיצד שני חלקיקים הנעים בכיוונים מנוגדים מיוצגים בגרף CH. ניתוח נוסף של כרונוגרפים יכול לספק מידע על מהירות שטף החלקיקים, היפוכים באורך המסלול וחלקיקים סטציונריים. שלום, הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע הקלטות במהירות גבוהה של הובלת שלפוחיות dsco בתוך נוירונים תרביתיים של היפוקמפוס.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לחמם מראש את כל רכיבי תא הדמיה והפלטפורמה כדי להפחית את העקה בתאים במהלך מעברם מהאינקובטור לבמה. יש לעבוד במהירות אך בזהירות. וזהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מספקים פרוטוקול תרבות מטוהרים מאוד נוירונים בהיפוקמפוס של המוח עכבר טרום לידתי ללא שימוש שכבת תא גלייה מזין.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

מקור: Villarreal, S., et. al., מדידת אנדוציטוזיס שלפוחית סינפטית בנוירונים בהיפוקמפוס מתורבתים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את הניתוח של אנדוציטוזיס שלפוחית סינפטית בתאי עצב בהיפוקמפוס מתורבתים באמצעות תיוג פרוקסידאז חזרת ומיקרוסקופ אלקטרונים.

הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית של אנדוציטוזיס שלפוחית סינפטית בנוירונים בהיפוקמפוס של עכבר 

מקור: Calvo-Rodríguez,  et al. דימות פלואורסצנטי וביו-לומינסנציה של Ca תת-תאי2+ בנוירונים היפוקמפוס מזדקנים. J. Vis. exp.} (2015).  סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיה פלואורסצנטית למדידת רמות סידן ציטוזולי בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך. על ידי השוואה בין נוירונים צעירים ומבוגרים, הוא מדגיש כיצד צפיפות מוגברת של תעלות סידן מגודרות מתח מסוג L והפעלה ממושכת בתאי עצב מזדקנים גורמים לעומס יתר של סידן, סימן היכר של הזדקנות עצבית. אינדיקטורים לסידן פלואורסצנטי חושפים את ההבדלים הללו באמצעות...

הדמיית סידן במבחנה בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך

אנו מתארים כיצד ליישם מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) מבוסס מחקרים של שלפוחית ​​בנוירונים קבוע, בתרבית. רכיבי מפתח של הפרוטוקול שלנו כוללים שלפוחית ​​תיוג עם מפלצות photoconvertible, איסוף תמונות גולמיות נדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי לייצר תמונה ברזולוציה סופר.

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

תרביות בצפיפות נמוכה של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס דורשות בדרך כלל שכבת הזנה גליה כדי לספק גורמים נוירוטרופיים ולשמור על אריכות ימים. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לתרבית נוירונים בצפיפות נמוכה במיוחד על כיסויי זכוכית בנוכחות שכבת הזנה עצבית בצפיפות גבוהה, המאפשרת חקירה של מנגנונים עצביים-אוטונומיים ספציפיים.

שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול עבור culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים בצפיפות נמוכה גדלו על coverslips הזכוכית הפוך מעל בשכבת גליה. שכבות הנוירון גליה מופרדות חרוזי פראפין. הנוירונים גדלו על ידי שיטה זו מתאימים הדמיה אופטית מבחנים תפקודיים ברזולוציה גבוהה.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה כדי ללמוד חלבון שיתוף מקומי בתרבויות עצביות עיקריות.

הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

למד הדמיה חיה של צפופה ליבות בשיטת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה רחבת שדה בנוירונים היפוקמפליים מתורבתים. פרוטוקול זה מאפשר חקר דינמיקת תנועת אברונים וניתן להתאימו לאברונים נוספים.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

גלה סרטונים נוספים

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured