לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון
13 במאי 2009
אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.
נוהל זה מתחיל בהכנת פupa של זבוב הדרוסופילה (drosophila), כך שהיא תהפך אותה "הפוך" כדי לחשוף את תאי שרירי דופן הגוף, את הנוירונים המוטוריים הקשורים אליהם ואת תאי ה-ggl, וזאת באמצעות שילוב של צביעה פלואורסצנטית של קצוות נוירונים פרה-סינפטיים, ביטוי אנדוגני של GFP ו-DS red המכוונים לממברנות של תאי גליה ותאי שריר פוסט-סינפטיים, והדמיה של המרווח הפרה-סינפטי. באמצעות צבעים פלואורסצנטיים, ניתן להבחין בתמונה ברורה של השינויים המבניים המתרחשים בחיבור העצבי-שרירי הגליאלי בדגימה חיה. שלום, אני D Brink מהמעבדה של Vanessa ל-ALS באוניברסיטה של קולומביה הבריטית במחלקה לזואולוגיה. היום אראה לכם הכנה של רקמה ושתי טכניקות לסימון תאים לצורך הדמיה של רקמת פupa של זבובים חיה למיקרוסקופיה קונפוקלית.
אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור תאי גליה בסינפסה שבין העצב לשריר. כעת, למשהו שונה לחלוטין, הכנת רקמה בשיטת "פנים-חוץ" (inside out) מתחילה בשלב קביעת הגיל של הזחלים. פרוצדורה זו תוצג על זחלים בשלב W3 בשל גודלם והקלות שבה ניתן להבצע בהם דיסקציה; השתמשו רק בזחלי W3 הזחלים באופן פעיל.
בשלב הבא, נקה את פני הזחלים בעזרת מכחול רך מאוד בתוך צלחת פטרי עם מים מזוקקים פעמיים. ניקוי הזחלים חשוב כיוון שהוא מוביל לאופטיקה טובה יותר וכן מפחית את כמות החיידקים. לאחר ניקוי הזחלים, העבר אותם לצלחת פטרי קטנה המכילה 3 mL של HL6 קר מאוד עם 5 mM גלוטמט.
הניחו את הצלחת על קרח עד שהבעיל מפסיק לנוע ונרגע, דבר שלרוב לוקח כשתי דקות. ברגע שהזחלים הפסיקו לנוע, ניתן להתחיל בדיסקציה של הרקמה באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, כאשר מחזיקים את מספרי הקפיץ ביד הדומיננטית ואת הפינצטה בעלת הקצה הדק מאוד. בעזרת המספריים, צרו חור קטן בדופן הגוף כדי להשוות את הלחץ לרוחב דופן הגוף, תוך כדי החזקה עדינה של בעיל על קרקעית הצלחת.
באמצעות הפינצטה הסירו את שני הסגמנטים האחוריים, והפרידו את האיברים הפנימיים. ייתכן שחלק מגוף השומן יבלוט מחוץ לחלל הגוף דרך החתך. הסירו גם רקמה זו.
המשיכו להחזיק את הזחלים בעדינות כנגד תחתית הצלחת בעזרת פינצטה עדינה. ביד השנייה, החזיקו סיכה לחרקים בעלת קצה קהה (מספר 0) והדחפו אותה כנגד חלקי הפה של הזחלים. דחפו את חלקי הפה דרך חלל הגוף, בדומה להפיכת גרב על פיה מעל לאגרוף.
הרקמה הפוכה צריכה להיראות כך. באמצעות מספרי דיסקציה עדינים במיוחד, הסירו את גוף השומן והטרכאות מדופן הגוף. הסירו כמה שיותר מגוף השומן.
השתדלו מאוד לא למשוך את הטרכאות או לנתק את מערכת העצבים. קריעה של הטרכאות תגרום להיווצרות חורים בשריר דופן הגוף. בסיום הנתיחה, השריר צריך להיות שקוף ורפוי, ולא עכור או מכווץ.
אם תניחו את השריר בתוך HL six ללא גלוטמט בטמפרטורת החדר, הוא ככל הנראה יתכווץ באופן קצבי. מכיוון שמחוללי דפוסי התנועה ב-CNS פעילים, דופן הגוף השלמה במצב "inside out" נוטה להתקפל לחצי לאורך קווי האמצע הגבייים והבטניים. לכן, התכשיר מספק חצי חיה, שמאלי או ימני, לצורך ויזואליזציה.
לבסוף, מקבעו את הרקמה על סמיכה של מיקרוסקופ עם סידור של זכוכית כיסוי מגשרת. הליאות למקיבע הרקמה יוצגו בהמשך. כדי להתחיל בסימון של מקלי neuronal batons, שאבו במזח 30 µL של תמיסת נוגדן ראשוני אנטי HRP המסומן פלורוצנטית ב-HL six והניחו טיפה על צלחת פטרי.
בשלב הבא, טבל את הדגימה של דופן הגוף שהפכה החוצה לתוך אמבט הצבע. ניתן להבחין בסימון של קצות הנוירונים לאחר כחמש דקות, אך יש להדגיר במשך 10 עד 20 דקות כדי לקבל סימון מלא ובהיר.
כדי לשטוף את עודפי סימון ה-HRP, העבירו את הרקמה אל 0.5 ml של HL six למשך 10 עד 30 שניות בטמפרטורת החדר. צבע שאינו קשור נשטף במהירות, ולכן מחזור השטיפה אינו צריך להיות ארוך או עז. הרקמה המסומנת מוכנה כעת להרכבה ולדמיון באמצעות מיקרוסקופיה.
וריאציה של פרוטוקול סימון הנוגדנים החיים שהוצג זה עתה היא שימוש בדקסטרין המשוער פלואורוצ'רומי כדי להדגיש חללים חוץ-תאיים מלאים בנוזלים. כדי להתחיל הליך זה, דללו צבע דקסטרין משוער פלואורוצ'רומי ב-HL six בריכוז של 0.001 milligrams per milliliter. ייתכן שתצטרכו לשנות את ריכוז הדקסטרין אם אינכם מעוניינים בתזמון מדויק של הדיפוזיה אל החלל החוץ-תאי.
טפטפו טיפה של 20 µL מצבע על לבישת כיסוי מגשרת והעבירו את דגימת הרקמה לתוך אמבט הצבע. אם אין צורך בפרפוזיה של הרקמה הפוכה (inside out) או אם יש לשמור על נפח קטן של HL six, ניתן להרכיב אותה על שקופית בעלת גשר כפול. התחילו בהדבקה באמצעות דבק מהיר (super glue) של שתי לבישות כיסוי ריבועיות בגודל 18 מילימטר על שקופית מיקרוסקופ נקייה מאוד.
השאירו מרווח של שני מילימטרים בין קצות כיסויות הזכוכית ומקמו את המרווח במרכז, בקירוב במרכז השקף. הניחו לדבק להתייבש לחלוטין, אחרת הוא יגבש שכבה מעל התמיסה המימית שסביב דגימת הרקמה.
בשלב הבא, הניחו טיפה של 30 µL של HL six ברווח שבין כיסויי הזכוכית. מקמו את הרקמה ההפוכה בתוך טיפת ה-HL six. ייתכן שיהיה צורך למקם את הרקמה באלכסון אם הזחל גדול ומערכת רכישת התמונות שלכם כוללת מערך פיקסלים מוגבל.
מרחו כמות קטנה של וזלין לקצוות של זכוכית כיסוי שלישית בקוטר 18 מילימטר והניחו אותה כשהצד המשומן פונה כלפי מטה על שתי זכוכיות הכיסוי המודבקות מעל הרקמה, ולחצו בעדינות. להלן התוצאות משתי השיטות שלנו לסימון פלואורסצנטי אקוטי של הכנת זחל בשיטת inside out, שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם דיסק מסתובב. התמונה הראשונה היא תמונת stack אופטית של סינפסה בין תאי דבק עצבי לשריר עם טרמינלים של Buton המסומנים ב-anti HRP חיים.
על פני תא השריר, ניתן לראות סופי עצב מסוג buton המסומנים בבהירות, בצבע כחול (פסאודו-צבע). במרכז ערימת התמונות, אנו מוצאים שלוחות גליאליות המסומנות ב-GFP ומוצגות בירוק, כמו גם batons המסומנים ב-HRP בצבע כחול. סביב ה-batons, ניתן לראות חתכים רוחביים של ה-SSR דמוי הכיס, ה-synaptic reticula, שצבועים באדום גם במרכז הערימה וגם בעומק הערימה, שם נמצאים ה-SSR המסומנים ב-DS red.
ה-SSR הם האזורים הסינפטיים המיוחדים של תאי השריר. ה-bns מקננים בתוך כיסים בתאי השריר, וכך גם חלקים מהבליטות הגליאליות הירוקות. שלוחות התאים הגליאליים משולבות מסביב ל-BNS ול-SSR, אך אינן מכסות את פני השטח של הסינפסה כשמיכה בשכבות העמוקות ביותר של הערימה.
אנו מוצאים שלוחות גליאליות ירוקות ואת ה-SSR האדום, אך לא כמות כזו של טרמינלים מסוג buton. ניתן למצוא גם חתכים רוחביים של עצב המוטורי המעצב את השריר. תאי גליה עוטפים את העצב המוטורי, ולכן גם הוא נראה בירוק.
התוצאה השנייה של סימון פלואורסצנטי אקוטי של תכשיר הזחלים מסוג "inside out" היא סימון פלואורסצנטי של הסינפסה באמצעות דקסטרין. במקרה זה, הנוזל במרווח הפרה-סינפטי או במרוץ הסינפטי מסומן באדום. בשכבות השטחיות של תמונת ה-optical stack, קיימת שכבת נוזל של צבע דקסטרין אדום, וניתן לראות היכן הוא מצטבר בשקעי הגליים שעל ממבྲנת הפלזמה של השריר.
בשכבות עמוקות יותר של הערימה, צבע הדקסטרין הפלואורסצנטי חלחל לתוך הסדקים הסינפטיים; טבעות קטנות בצורת דונאט של צבע נוצרו בין סיומי הנוירונים לבין כיסי ה-SSR המסומנים בכחול. זהו הסדק הסינפטי המודגש באמצעות הצבע. הלמלה הגליאלית הירוקה אינה חוסמת את חדירת הצבע לסדק בשכבות העמוקות יותר של ערימת התמונות.
המאפיינים הבולטים ביותר הם ה-SSR או האזור הסינפטי של השריר המסומן בכחול, והשלוחות הגליאליות השטוחות שצבען ירוק. באופן דומה, המעטפת הגליאלית סביב האקסונים שאינם מעצבבים הנראים בשכבות העמוקות היא ירוקה. נראה כי המעטפת הגליאלית דוחה את צבע הדקסטרין.
הרגע הצגתי בפניכם דרך חדשנית להדמיה של הסינפסה גליאלית-עצבית-שרירית בהכנת רקמה מסוג "inside out" של זחלי דרוזופילה. בעת הכנת הרקמה, חשוב לזכור לשאוף לטיפול עדין ברקמה ולהבטיח שהשריר רפוי ושהעצבים ההיקפיים אינם פגועים. אשמח לסיים בציטוט של מרקס.
הזמן טס כחץ. הפחד טס כמו בננה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית להכנת רקמה בגישת "inside-out" לצורך דימות של סינפסות גלייה-נוירו-שריריות בזחלי Drosophila חיים. באמצעות צבעים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופיה קונפוקלית, מוצגים המאפיינים המבניים של הסינפסות, דבר המספק תובנות לגבי אינטראקציות של תאי גלייה בצומת הנוירו-שרירי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות של דימות חי
רקע
- לתאי גליה תפקיד מכריע בתפקודם של צומתים עצביים-שריריים.
- הבנת האינטראקציות בין תאי גליה לנוירונים חיונית להשגת תובנות לגבי התפקוד הסינפטי.
- טכניקות של סימון פלואורסצנטי משפרות את הוויזואליזציה של מבנים תאיים.
- דימוי חי (Live imaging) מאפשר תצפית בזמן אמת על תהליכים דינמיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להכנת זחלי Drosophila חיים לצורך דימוי.
- הדמיה של המאפיינים המבניים של תאי גליה בחיבור העצבי-שרירי.
- שיפור ההבנה של תפקודי תאי הגליה בהעברה סינפטית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת רקמה בשיטת "פנים-החוצה" (Inside-out) של פגסו דרוזופילה.
- צביעה פלואורסצנטית של טרמינלים של נוירונים פרה-סינפטיים.
- ויזואליזציה של ממברנות של תאי גליה ותאי שריר פוסט-סינפטיים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לדמיון של רקמה חיה.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של טרמינלים של נוירונים ותאי גלייה.
- ויזואליזציה ברורה של המרווח הפריסינפטי.
- תצפית על שינויים מבניים בחיבור הגליאלי-נוירומסקולרי.
- הדגמה של יעילות שיטת ההכנה מסוג inside-out.
מסקנות
- ההכנה מסוג "inside-out" היא טכניקה בעלת ערך לחקר מגעים עצביים-שריריים חיים.
- סימון פלואורסצנטי מספק תובנות לגבי תפקידם של תאי גליה בתפקוד הסינפטי.
- ניתן ליישם שיטה זו במחקרים נוספים בביולוגיה של מערכת העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ביצועית
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה של אינטראקציות גליאליות-נוירונליות בחיבור העצבי-שרירי בדגימה חיה ושלמה, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים במהלך תיקוף מטרות עצביות. על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה הטבעית ומתן גישה לנוזל הפרפוזיה, היא מספקת מערכת רלוונטית למחלה לבחינת ביולוגיה סינפטית בביטחון חיזוי גבוה. גישה זו מגשרת בין ביולוגיה של גילוי לבין חקירת ביומרקרים טרנסלציונליים במודלים פרה-קליניים של מחלות עצביות-שריריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תרומת התאי הגליאליים ליציבות סינפטית ולדינמיקה של שחרור מוליכים עצביים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת חיה ונגישה באופן אופטי לניטור בזמן אמת של שינויים מבניים בגליאה.
סקר ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: תומך בהכנה של מערכות ביולוגיות עוברי-תיקוף לצורך סריקת תרכובות בהמשך במסינפסה.
- ערך תפעולי: מסייע בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הכנת רקמה הניתנת לשחזור ומדידות פלואורסצנטיות כמותיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע מערכת רלוונטית למחלה לחקר תפקוד לקוי של תאי גליה במודלים של ניוון נוירו-שרירי.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב גילוי המטרה ועד לאימות פרה-קליני באמצעות דימות חי של שלמות סינפטית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה ממקמת את הערכת הממשק הגליאלי-נוירונלי בין שלב התיקוף המוקדם של המטרה לבין אופטימיזציית המולקולות המובילות, כאשר מדדים סינפטיים מבניים ותפקודיים מכוונים את החלטות ה-go/no-go.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבחינת השערות לגבי מנגנוני גליה בהעברה סינפטית ובבירור מסלולים.
- סריקה: מספק תכשירים מוכנים לבדיקה עם גישה ניתנת לשחזור למרחב הפריסינפטי לחשיפה לתרכובות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות של מרחב ועצימות של מדורי פרה-, פוסט- וגליה מסומנים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לדימוי ארוך-טווח של שינויים מבניים סינפטיים במודלים של מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך תיקוף מטרות גליה ומחקרי מנגנון פעולה בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתקשורת בין תאי גליה לנוירונים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים להכנת רקמה ולסימון.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת תוצאות מבניות ישירות על מעורבות מטרה סינפטית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות גליאליות מותאם סיכון, בהתבסס על מודולציה סינפטית חזותית והצלה תפקודית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של Drosophila, טיפול ברקמות חיות ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובגישה לפלואורופורים הפולטים באור אדום-רחוק ואדום-ירוק.
- מחייב סטנדרטיזציה של שלבי ההתפתחות של הזחלים, עיתוי הדיסקציה ותנאי הפרפוזיה בין המשתמשים השונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום במודלים של מחלות או בקידמומי גליה חלופיים.
- מוגבל על ידי חלון ההישרדות של הרקמה ואפשרות לזליגת פלואורסצנציה (bleed-through) בדימוי מולטיפלקס.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:56
Introduction
1:25
'Inside-Out' Tissue Preparation
4:29
Neuronal Bouton Labeling with Fluorescently Labeled Primary Antibody Against HRP
6:12
Mounting the Tissue for Visualization Under a Confocal Microscope
5:23
Perisynaptic Space Labeling with Dextran Fluorophore Conjugate
7:23
Representative Results
10:17
Conclusion
