הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

לוחית כיסוי מצופה ב-sogar, שהוכנה על ידי מריחת טיפה של sogar על הזכוכית וייבוש למשך לילה, מונחת בחלל העגול של תא ההקלטה המוכן מראש ומכוסה בתמיסת הקלטה. תולעת הממוקמת במרכז מודבקת למשטח מגן הסף, החל מהראש או מהזנב, תוך יישום דבק על הצד הגבי של התולעת באמצעות פיפט דבק. עם השלמת ההדבקה, נבצע חתך סמוך לוולבה בממשק שבין הקוטיקולה לדבק באמצעות מחט זכוכית, אשר יורחב לכיוון הראש לאחר הוצאת האיברים הפנימיים והביצים מחלל הגוף.

הקצה החתוך של החתך מורתך נקודתית עם הדבק לסוגאר (sogar), כך שהעצב הבטני ושרירי דופן הגוף נחשפים. השריר הבטני המדיאלי הקדמי לוולבה נסגר באמצעות patch clamp, ואלקטרודת הגירוי ממוקמת במעלה מסלול חבל העצבים. שלום, אני ג'נט ריצ'מונד, פרופסור חברה במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אילינוי שיקגו.

היום אדגים לכם טכניקת נתיחה המאפשרת לנו לחשוף את הצומת העצבית-שרירית של צלף הים. לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי, אנו משתמשים בהכנה זו כדי לחקור תמסורת סינפטית.

בסדר, בואו נתחיל. לפני העבודה עם הנמטודות, יש להכין חלק מהציוד לפחות יום אחד לפני הפרוצדורה. תא הקלטה לדיסקציה, כיסויי זכוכית מצופים ב-S guard, פיפטים ישנים, מורכי דבק ופיפט מיצוי.

התחל בבניית התא. חתוך לוח פרספקס בעובי 1/16 אינץ' כך שיתאים למסגרת המיקרוסקופ. ההקלטות יבוצעו במרכז הפרספקס.

קדחו חור מעגלי גדול מספיק כדי להכיל זכוכית כיסוי מעגלית בקוטר 22 מילימטר. הדביקו זכוכית כיסוי של 48 על 60 מילימטר לצד התחתון של התא מתחת לחור, באמצעות גלגול של שעוות טמיעה לרקמות מסוג para plaque בעלת נקודת התכה נמוכה בכל פינה של זכוכית הכיסוי. השעווה מותכת במהירות על פלטה מחממת, מה שמותיר שכבת שעווה דקה בין הפלקסיגלס לבין נסקיית זכוכית הכיסוי לאחר הקירור; הסִירו שאריות שעווה עודפות באמצעות להב.

זכוכית הכיסוי המתאימה לתא היא זכוכית כיסוי מצופה S guard במידה של 22 מילימטר. כדי שה-sard יעבוד, יש להכינו טרי בהתאם להוראות היצרן. לאחר ההכנה, מניחים טיפה קטנה של sard על כל זכוכית כיסוי וממרחים אותה באמצעות להב כדי ליצור פני שטח אחידים.

לאחר מכן, מניחים את לביבות הכיסוי המצופות בתוך מכלים סגורים ומכניסים אותם לתנור בטמפרטורה של 65 °C למשך הלילה לצורך הקשיה. מחר הן יהיו מוכנות לביצוע הדיסקציה לאורך הפרוטוקול. נדרשות פיפטות זכוכית סיליקט בעלות קוטר חיצוני של 1 mm, שנמשכו לקצה בעל התנגדות של כ-4 MΩ, לכן מומלץ להחזיק צנצנת כזו זמינה.

ראו את פרסום JoVE העוסק בהכנת פאצ'ים, פיפטות ואלקטרודות חדות באמצעות פולר תכנותי על ידי Miriam Goodman. לצורך פרטים טכניים לביצוע אלקטרופיזיולוגיה, יש להדביק את הנמטודה במקומה. לשם כך, נדרש אפליקטור לדבק.

ממיג הדבק הוא פשוט צינור פלסטיק באורך שני מילימטרים עם קוטר פנימי של מילימטר אחד. קצה אחד של הצינור יוחזק בפה. ניתן לציידו בפיה, ובקצהו השני של הצינור תוחזק פיפטה של מילימטר אחד הממולאת בדבק.

במהלך הנתיחה נעשה שימוש גם בפיפטת מיצוי ייעודית. זו עשויה מצינור ופיפטה בדומה לממיס הדבק, למעט העובדה שהפיפטה שבורה מעט לאחור כדי לאפשר את הכנסת הביצים והאיברים הפנימיים. התחילו בסריקת קו שעווה לאורך היקף התא.

כעת לחצו והניחו כיסוי זכוכית (cover slip) מצופה ב-Sylgard, כאשר שכבת ה-Sylgard פונה כלפי מעלה. קו השעווה מקבע את זכוכית הכיסוי ומונע מתמיסת ההקלטה לחלחל תחתיה ולהזיז את כיסוי הזכוכית במהלך הנתיחה וההקלטה. לאחר מכן ממלאים את התא בתמיסת הקלטה חוץ-תאית. עיינו בטקסט הנלווה לקבלת מרשם התמיסה כאשר התא מוכן.

השתמשו בפיק לנמטודות כדי להעביר מספר נמטודות לתוך התמיסה. עם תרגול, ניתן להדביק את הנמטודות השוחות ללא צורך בפעולות נוספות למניעת תנועה. מלאו מכל דבק, שהורכב ממכסה של מבחנה ל-PCR המוחזק באמצעות שעווה או פלסטלינה, עם מלאי עבודה של דבק אקרילי מסוג Sano כדי לעבוד עם הדבק.

השלימו את בניית מורכי הדבק על ידי חיבור פיפט ההקלטה לקצה מורכי הדבק. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, מלאו את מורכי הדבק באמצעות שאיבה עם הפה. הדבקת הדבק לנמטודה היא מאתגרת ודורשת תרגול מכיוון שהדבק עובר פולימריזציה במגע עם תמיסת ההקלטה החוץ-תאית.

כדי למנוע זאת, שמרו על זרימה קבועה של הדבק כלפי חוץ, אחרת הוא יתקשה ויסתימה את הפ pipette. אם ה-pipette נסתמה, ניתן לעיתים לשחרר את הסתימה על ידי הקשה עדינה של הקצה על לוחות הכיסוי. התאמנו בעבודה עם הדבק.

כאשר תצליחו לכתוב את שמכם בדבק על ה-sil guard, אתם כנראה מוכנים להדבקה של קוטיקולת הנמטודה כדי לקבע נמטודה. ראשית, בחרו נמטודה אחת הקרובה למרכז התא, היכן שיש מקום לפעול. שנית, מרחו כמות קטנה של דבק על הראש או על הזנב של הנמטודה ומשכו את הנמטודה במהירות כלפי מטה אל פני השטח של ה-sil guard.

לאחר מכן, מרחו פס דבק לאורך הקצה הגבי של הקוטיקולה של הנמטודה. פעולה זו מאלצת את הנמטודה להתקפל לצורת C כאשר הוולבה פונה פנימה. יש למלא כל רווח בקו הדבק כדי להבטיח היצמדות מקסימלית של הנמטודה ל-syl guard.

זהו תהליך מורכב וניתן להיעזר בתרגול על מוטנטים עם תנועתיות נמוכה (hypo motil). כפי שניתן לראות ב-31, יש שם בלוֹב ממש מימין. כעת אני אסובב את הדגימה ואז אכניס את מחט הזכוכית ואתחיל לבצע את החתך. כדי לבצע את החתך בקוטיקולה, עברו להשתמש בפיפטת דיסקציה ידנית.

פיפטה זו צריכה להיות חדה יותר מהפיפטות המשמשות להקלטת הדבק, ובעלת מוט קצר וחזק לשימוש בהגדלה המקסימלית. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, יש ליישר את הפיפטה במקביל לציר האורכי של הנמטודה ולהחדיר את הקצה ליד הוולבה, בממשק שבין הקוטיקולה לדבק. חתך זה משחרר את הלחץ ההידרוסטטי של הנמטודה, ובכך דוחף את הביצים והמעיים החוצה דרך נקודת החתך.

המשיכו לחתוך את הקוטיקולה לכיוון ראש הנמטודה בתנועת פריסה הדומה לפתיחת מעטפה, עד שתגיעו לבלעוטית. כעת עברו להשתמש בפיפטת השאיבה כדי לשאוב החוצה את האיברים הפנימיים של הנמטודה. לאחר ניקוי החתך, הקוטיקולה הפתוחה תשמור על צורתה הגלילית.

בשלב הבא, קח פיפטה נקייה להדבקה. השתמש בה כדי לבצע "הלחמה" בנקודות (spot weld) של הקוטיקולה בשולי החתך אל פני השטח של ה-syl guard. חשוב להשתמש בנקודות דבק מינימליות בשלב זה כדי למנוע פגיעה ב-njs או הסתרתם.

שעת nerve cord הגבי ושרירי דופן הגוף חשופים כעת, אך עדיין יש להסיר את קרומי הבסיס המכסים את ה-NMJ. כדי לעשות זאת, שאבו את תמיסת ההקלטה החוץ-תאית מהתא והחילו תמיסת הקלטה חוץ-תאית עם 0.4 mg/mL של קולגנאז. לאחר 10 עד 20 שניות, הסירו את הקולגנאז ושטפו את הדגימה מספר פעמים עם תמיסת הקלטה רעננה.

הנמטודה מוכנה כעת להקלטות אלקטרופיזיולוגיות. במיקום ה-NMJ, השתמשו בעדשה פי 10 על בימת מיקרוסקופ אנכי כדי למרכז את הנמטודה בתא ההקלטה, לאחר מכן עברו לעדשת טבילה במים פי 40 עם אופטיקת DIC וודאו ששרירי דופן הגוף והשרוך העצבי תקינים. מקמו את הנמטודה בצורה אופקית כך שניתן יהיה להחדיר אלקטרודות הן מהצד השמאלי והן מהצד הימני.

בדרך כלל, אנו מבצעים patch של הגוף המדיאלי-ונטרלי בזמן ששרירים פנימיים לוולבה חשופים, אך ניתן לבצע patch בקלות גם לשרירים בצד הגבני (dorsal) ובצד הבטני (ventral) של התולעת, כאשר מספר נוירונים נראים כחצי עיגול הצמוד לשריר. כעת, בצעו patch לשריר באמצעות טכניקות patch clamping סטנדרטיות כדי להשיג gig seal. מניסיוננו, אלקטרודות רישום עם התנגדות של כ-4 MΩ עובדות היטב עבור מצב רישום voltage clamp של התא השלם (whole cell).

הגבירו את השאיבה והפעילו זרם חשמלי על הממברנה עד לפריצת חותם ה-gigo. דיברנו על השגת התנגדות של 4 mega. אם תסתכלו שם, כן, רשום 4.9 megas.

זה גדול יותר, נורמלי. זה בטווח שאנחנו משתמשים בו. אוקיי. כן. עכשיו אנחנו ננסה להגדיל את, אז מה?

מה? אנחנו רוצים שזה ירד עד למטה. כן. הבנתי. יאי.

בהקלטה טובה, לשרירי דופן הגוף של נמטודות בוגרות מסוג wild type יש בדרך כלל קיבול ממברנה של כ-70 picofarad, וניתן להקליט אותם באופן יציב למשך 10 דקות לפחות בפוטנציאל החזקה של 60- millivolts עם זרמי החזקה מינימליים של כ-50 pico amps. לאחר ששריר תא עבר patched, גירוי באמצעות אלקטרודה שנייה, ערוץ המופעל על ידי אור, Rodin או הוספת תמיסה היפרו-אוסמוטית, יעוררו תגובות מדידות. כדי להפיק תגובה בעירור חשמלי, אנו מניחים בדרך כלל אלקטרודת גירוי המכילה תמיסה חוץ-תאית על חבל העצבים הגבי (ventral nerve cord) במיקום פנימי ביחס לשריר שעבר patched.

תצורת ה-loose patch זו דורשת פולסים של מילישנייה אחת עד שתיים של זרם שבין 10 ל-40 וולטים. לרוע המזל, לאחר מספר תגובות מעוררות, חבל העצבים נפגע באופן בלתי הפיך ומסיבה שאינה ידועה, ניתן לעורר באמצעות תצורה זו תגובות מעוררות כולינרגיות בלבד. לחלופין, ניתן להשתמש בנמטודות המבטאות תעלה המופעלת באור שבה טרנסגן dosin באוכלוסיות נוירונליות שונות כדי לעורר שחרור.

כהכנה לשיטה זו, יש לשים לב כי הנמטודות המשמשות ליישום זה חייבות להיות גדלו על חיידקים המועשרים ברטינול. בהכנה זו, נעשה שימוש ב-LED בעוצמה גבוהה באורך גל של 470 nanometer, המסונן דרך מסנן עירור GFP של 450 עד 490 nanometer, כדי להפעיל שוב ושוב את ה-channel opsin, דבר הגורם לשחרור מושרה של מוליכים עצביים שונים בהתאם לסוגי התאים המבטאים את התעלה. את הטכניקה האחרונה לסקירה ניתן להשתמש בה כדי למדוד את הגודל של מאגר השחרור המהיר (readily releasable pool) של שלפוחיות סינפטיות ממספר נוירונים אל השריר הנמדד.

פעולה זו מבוצעת על ידי הזרקת פולס לחץ של תמיסה חוץ-תאית היפראוסמוטית אל השריר שנמצא תחת פאץ' למשך אחת עד שלוש שניות. התוצאה תהיה רצף של אירועים פוסט-סינפטיים א-סינכרוניים. הקלטות של שרירי דופן הגוף בשיטת whole cell voltage clamp מוצגות עבור כל אחד משלושת פרוטוקולי הגירוי שתוארו לעיל: תגובות למגיב חשמלי, למגיב אור ולתגובה היפראוסמוטית.

בכל המקרים, שריר דופן הגוף המדיאלי-בנטראלי מקובע בפוטנציאל של 60- millivolts. תאי שריר מסוג Wild type מראים בדרך כלל שיעורים גבוהים של זרמי סינפסה מיניאטוריים פנימיים אנדוגניים. בתמיסות ההקלטה הסטנדרטיות שלנו, דפולריזציה של שני millisecond של חבל העצבים הבנטראלי הקדמי גורמת לשחרור סינכרוני מכמה סינפסות, מה שמוביל לתגובה מעוררת גדולה של כ-2 עד 2.5 nano amps.

בתולעי פרא (wild type), עקבות מייצגים מימין לעקבות של תולעי הפרא ב-A וב-B מראים שחרור סינפטי במוטנט עם חוסר קואורדינציה חמור ב-18 פאנל C מראה תגובה מושראת באור מהחיבור העצבי-שרירי של תולעת פרא המבטאת channel red dosin. בנוירונים כולנרגיים, פולס אור של 2 מילישניות מייצר בדרך כלל תגובה של 1.5 עד 1.8 nano amps. הזרקה בלחץ של תמיסת מלח היפראוסמוטית בריכוז 850 Milli osmo על השריר למשך שנייה אחת מייצרת מטח אסינכרוני של זרמים סינפטיים מיניאטוריים המייצגים את מאגר הוסיקולות הזמין לשחרור מיידי.

הרגע הצגתי בפניכם את טכניקת הדיסקציה שבה אנו משתמשים כדי לחשוף את הצומת העצבית-שרירית של sea elegance ולבצע רישומים אלקטרופיזיולוגיים. חשוב לזכור שטכניקה זו היא מאתגרת וסביר להניח שידרשו מכם חודשים כדי להגיע לשליטה מלאה בה. עם זאת, ברגע שתרכשו אותה, היא תהיה טבעית עבורכם כמו רכיבה על אופניים.

הטכניקות יילמדו ותישארו איתכם, וככל שתתרגלו אותן יותר, כך ההכנה תהיה מהירה ואמינה יותר. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.