Name: Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: למדו את פרוטוקול ההדבקה בתאי HeLa בנגיף Vaccinia ואת חילוץ ה-RNA בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים של המארח והנגיף במערכי מיקרו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

וייטהד במכון עמיתי קרנות

חלק 1: הגדרת זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים הלה ב צלוחיות ולהמתין עד התאים הם כ 80% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מספיק בינוני צמיחה ויראלי לניסוי: DMEM קבוע עם 2% FBS ללא אנטיביוטיקה הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזיהום יכול להתבצע גם עם מלאי גולמי של הנגיף vaccinia עם כייל ידוע, או סוכרוז מטוהרים וירוס עם כייל ידוע אם אתה מודאג לגבי ביטוי גנים המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה משתמש וירוס סוכרוז מטוהרים, להמשיך ישירות חלק 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה משתמש מלאי וירוס גולמי vaccinia, זמן קצר לפני הזיהום, sonicate aliquot של הנגיף sonicator כוס עם אמבטיה של קרח בעיקר מעט מים. <ul style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate בסביבות 30W למשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס הצינור וחזור על sonication 3 פעמים, הוספת קרח יותר אם יש צורך לשמור על כוס מלא קרח צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס בין כל שלב sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חלק 2. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אם אינכם בעלי sonicator כוס, לערבב נפח שווה של המניה וירוס גולמי טריפסין 0.25mg/mL. <ul style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המניות / טריפסין וירוס לערבב 37 ° C waterbath במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרווחים 50-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חלק 2. </li></ul></li></ol> חלק 2: הדבקת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום של חלקיקים נגיפיים צריך להדביק את monolayer על ריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים). בדרך כלל, גבוה הפנים (בין 5 ל 10) משמש timecourses זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את כמות הרצויה של וירוס סוכרוז מטוהרים או וירוס גולמי trypsinized על 37 מעלות צלזיוס צמיחה התקשורת ויראלי ומערבבים היטב. אתה צריך להשתמש בתקשורת מספיק כדי לכסות רק את החלק התחתון של הבקבוק. לדוגמה, 10 מ&quot;ל של המדיה עבור בקבוק T-175. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה מן התאים ולשטוף עם בטמפרטורת החדר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הוירוס / מדיה צמיחה ויראלי בקבוק אחד. <ul style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות, צלחות הטיה לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 בחממה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות הטיה מערבולת כל 15 דקות כדי להפיץ וירוס אחיד לשמור תאים לחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור נקודת זמן 0hr/Mock, מוסיפים את התקשורת צמיחה ויראלי בלבד, עם וירוס לא הוסיף. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 1 שעה, להסיר את המדיה המכילים את הנגיף, ולשטוף שלוש פעמים עם בטמפרטורת החדר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הסכום המקסימלי של מדיום הגידול ויראלי בקבוק אחד. לדוגמה, 30 מ&quot;ל של המדיה עבור בקבוק T-175. מתחילים לספור את זה כנקודת 0 hr שלך זמן. </li></ol> חלק 3: תאים קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ לב כל השפעה cytopathic (CPE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ולשטוף תאים עם 30 מ&quot;ל של בטמפרטורת החדר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מ&quot;ל של טריפסין אל התאים דגירה עבור 2-5min על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק במיקרוסקופ על ניתוק התא ברז הבקבוק בעדינות כדי לסלק תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים עם טפטפת סרולוגיות סטרילי לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבקבוק עם נפח שווה של התקשורת צמיחת תאים, ולהוסיף את התקשורת התאים trypsinized בצינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את טריפסין / מדיה מן התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב מגיב או TRIzol או החיץ תמוגה מתיק הרצוי RNA שלך בבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה משתמש TRIzol, לחלק את הדגימה לתוך 1 מ&quot;ל aliquots שכותרתו צינורות 1.5mL Eppendorf ולהקפיא ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן, קצירת one בקבוק לכל נקודת זמן. </li></ol> חלק 4: מיצוי RNA של דגימות TRIzol <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, דגימות שלך צריך להיות resuspended ב מגיב TRIzol ומוכן להיות מעובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μL של מגיב הפרדת פאזות BCP עבור כל 1 מ&quot;ל של TRIzol בצינור אחד. ייתכן שיהיה עליך להעביר את הצינור מדגם גדול יותר אם אתה מתחיל עם כמות גדולה של TRIzol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס תנער במרץ דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית לצינור טריים. השלב מימית היא שכבת ברור למעלה. אתה צריך להיות מחלים 600μL כ 1mL עבור כל TRIzol שהתחלת לצאת עם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם החילוץ פנול / כלורופורם שנייה, הפעם באמצעות 500μL של כלורופורם לכל 1 מ&quot;ל TRIzol, במקום BCP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס תנער במרץ דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית לצינור טריים. השלב מימית היא שכבת ברור למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20μg של acrylamide ליניארית מדגם זה. Acrylamide ליניארי מעשים כנשא ועוזר לזרז את הרנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 &amp; miקרו; L של isopropanol לכל 1 מ&quot;ל של TRIzol שהתחלת לצאת עם לדגום כל ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב microcentrifuge במהירות המרבית במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה RNA יוצג בחלק התחתון של הצינור. בזהירות רבה, להסיר את supernatant מהצינור, או עם aspirator ואקום, או באופן ידני על ידי pipettor. נא לא להפריע את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ&quot;ל של אתנול 70%. <ul style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של אתנול 70% על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שיא של 14,000 גרם במשך 5-7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות רבה, להסיר את אתנול מן הצינור, או עם aspirator ואקום, או באופן ידני על ידי pipettor. בדוק כי גלולה גלוי בתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב לשטוף. לאחר supernatant נמחקת, לסמן היכן גלולה היא ברכבת התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש גלולה לא יותר מ 5 דקות. אל overdry, או RNA יהיה קשה לשחזר! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ברצונך לעקוב אחר הטיפול אופציונלי DNase להסיר כל שאר ה-DNA מן המדגם, resuspend גלולה ב 17μL מים nuclease חינם. אחרת, resuspend גלולה ב 20μL מים nuclease ללא והמשך לשלב 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי טיפול DNase) באמצעות מערכת RNase ללא Qiagen DNase, להוסיף 2μL הצפת RDD ו 1μL מחדש RNase ללא DNase אני על RNA resuspended. מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי טיפול DNase) לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי טיפול DNase) הוסף 2μL של 2.5 mM EDTA ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית DNase. אין לעבור את הזמן איון או טמפרטורה כמו פעמים יותר / טמפרטורות גבוהות יותר עלולות לגרום השפלה של רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ריכוז RNA על ידי ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות מדגם RNA ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (QC אופציונאלי) בדוק את איכות RNA באמצעות BioAnalyzer Agilent, או על ידי הפעלת המדגם על ג&#39;ל denaturing ובדיקת קריאות OD. (260nm ו - 260/280 יחס) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

קריטי שלבים חלק 1 &amp; 2 ישנם שלבים קריטיים כמה הגדרת זיהום סינכרוני vaccinia, sonication first להיות זהיר (או trypzinizing) של הנגיף, על מנת disaggregate חלקיקי הנגיף. Vaccinia נוטה מאוד צבירה, לבין שיבוש של חלקיקי נגיף חשוב להבטחת אפילו זיהום של תאים. על מנת להשיג זיהום סינכרוני, בגובה הפנים (יותר מ 2) יש להשתמש כדי להבטיח כל תא נגוע. תערובת של תא...

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>ריאגנטים דומים, כגון TriPure מבית Roche, יעבדו גם הם.</td></tr><tr><td>BCP Phase Separation Reagent</td><td>ריאגנט</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>ריאגנט</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>טיפול ב-DNase הוא שלב אופציונלי.</td></tr></tbody></table>

vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

המשפחה<em&gt; Poxviridae</em&gt; מורכב גדילי הדנ&quot;א הכפול גדולים המכילים וירוסים לשכפל אך ורק בציטופלסמה של תאים נגועים. חברי<em&gt; Orthopox</em&gt; הסוג כולל אבעבועות, הסוכן סיבתי של אבעבועות קטנות האדם, הקוף, ואת vaccinia (VAC), חבר prototypic משפחת וירוסים. בתוך גדולות יחסית (~ 200 kb) vaccinia הגנום, שלוש כיתות של גנים המקודדים: מוקדם, ביניים מאוחר. בעוד כל שלוש כיתות מתועתקים ידי virally בקידוד polymerases RNA, כל שיעור מהווה פונקציה שונה במחזור החיים של הנגיף. Poxviruses לנצל אסטרטגיות מרובים עבור אפנון של הסביבה המארחת הסלולר במהלך ההדבקה. כדי להבין את הרגולציה של המארח וגם גן ביטוי וירוס, יש לנו מנוצל הגנום כולו גישות לנתח שפע תמליל מנגיף וגם התאים המארחים. הנה, אנחנו מדגימים כמובן זמן זיהומים של תאים הלה בווירוס Vaccinia ו-RNA הדגימה במספר נקודות זמן לאחר הפגיעה. מארח שני ו-RNA ויראלי הכולל מופרד מוגבר של הכלאה כדי microarrays עבור ניתוח של ביטוי גנים.

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 1 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

משפחת ה-Poxviridae מורכבת מנגיפים גדולים המכילים DNA דו-גדילי, המשתכפלים אך ורק בציטופלזמה של תאים נגועים. חברים ב...

זמני הדבקה של תאי hela באמצעות נגיף הווקסיניה מתחילים בהכנת ההדבקות הוויראליות, הדבקת התאים, ולאחר מכן איסוף ה-RNA מהתאים המודבקים בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. RNA זה יכול להיות מוגבר מאוחר יותר לצורך היברידיזציה למערכים זעירים (microarrays) לצורך ניתוח ביטוי גנים. שלום, אני ג'ודי אן מהמעבדה של קייט אירווינס במכון ווייטהד למחקר ביו-רפואי.היום נראה לכם פרוצדורה להדבקה במסלול זמן של נגיף הווקסיניה (vaccinia virus) בתאי יונקים, ולאחר מכן הפקת RNA מהתאים המודבקים בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. טכניקה זו היא שלב התחלתי בתוך פרוטוקול רחב יותר שמטרתו להפיק ולהגביר RNA כדי להעריך את ביטוי הגנים של הנגיף במהלך ההדבקה, אשר יושלם בשני סרטוני JoVE נוספים. אז בואו נתחיל. כדי להכין את התנאים להדבקה, גדלו תאי HeLa בבקתות והמתינו עד שהתאים יהיו בקירוב 80%confluent.בשלב הבא, ודאו שהכנתם מספיק מצע גידול ויראלי עבור הניסוי. באמצעות DMEM רגיל עם 2% FBS וללא אנטיביוטיקה מוספת, ניתן לבצע את ההדבקה באמצעות מלאי מוכן של נגיף vaccinia עם תירה ידועה או נגיף שעבר טיהור בסוכרוז עם תירה ידועה. אם אתם מודאגים מהבעת גנים של המארח ואתם משתמשים בנגיף שעבר טיהור בסוכרוז, דלגו למקטע הבא.אם אתם משתמשים בנגיף vaccinia גולמי, בצעו סוניקציה למלאי של הנגיף וחלקו אותו לאליקוטות ממש לפני ההדבקה; השתמשו בכלי סוניקציה עם אמבט של בעיקר קרח ומעט מים, ובצעו סוניקציה בעוצמה של כ-30 W למשך 20 שניות. ערבבו את המבחנה באמצעות וורטקס וחזרו על הסוניקציה שלוש פעמים, תוך הוספת קרח במידת הצורך כדי לשמור על הכלי מלא בקרח ומקורר; הקפידו לבצע וורטקס בין כל שלב של סוניקציה. אם אין ברשותכם מכשיר סוניקציה, ערבבו נפח שווה של מלאי הנגיף הגולמי בריכוז של 0.25 mg/mL.ערבבו בבתור (vortex) בעוצמה את מלאי הווירוס עם טריפסין, והדגירו במקלחת מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות. ערבבו בבתור במרווחי זמן של 5 עד 10 דקות כדי להדביק תאים. ראשית, חשבו את כמות החלקיקים הויראליים הדרושה להדבקת השכבה החד-שכבתית (monolayer) בריבוי ההדבקה (multiplicity of infection) הרצוי.או MOI. בדרך כלל נעשה שימוש ב-MOI גבוה שבין 5 ל-10 עבור סדרות זמן של הדבקה. לאחר מכן, הוסיפו את הכמות הרצויה של נגיף מטוהר בסוכרוז או נגיף גולמי מ-tryp למצע גידול נגיפי בטמפרטורה של 37 °C וערבבו היטב.יש להשתמש בכמות מצע מספיקה כדי לכסות רק את תחתית הבקבוק. 10 milliliters של מצע יספיקו לבקבוק T 1 75. יש להסיר את המצע מהתאים ולשטוף ב-PBS בטמפרטורת החדר.הוסיפו את הווירוס או את מצע גידול הווירוס לכל בקבוק עבור נקודת זמן של דמה (mock) בשעה אפס. הוסיפו את מצע גידול הווירוס בלבד ללא הוספת וירוס, סובבו בעדינות והטו את הפלטות; הדגרימו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור עם 5%CO2 למשך שעה אחת. הקפידו להטות ולסובב את הפלטות מדי 15 דקות כדי להפיץ את הווירוס באופן אחיד ולשמור על התאים לחים.לאחר הדגירה, הסר את המצע המכיל את הנגיף ושטוף שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר. הוסף את הכמות המקסימלית של מצע גידול נגיפי לכל בקבוק.לדוגמה, 30 milliliters של מצע עבור בקבוק T 1 75. ניתן להתחיל לספור זאת כנקודת הזמן של שעת האפס בנקודת הזמן הרצויה לאחר ההדבקה. בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ וסמנו כל אפקט ציטופתי או CPE.הסר את המצע ושטוף את התאים עם 30 milliliters של PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 15 milliliters של trypsin לתאים והדגר למשך שתיים עד חמש דקות. בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, בדוק תחת מיקרוסקופ את ניתוק התאים והקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים.העבירו את התאים באמצעות פיפט סרולוגית סטרילית למבחנה קונית של 50 מיליליטר. שטפו את הבקבוק בנפח שווה של מצע גידול לתאים והוסיפו את המצע לתאי הטריפסין במבחנה הקונית. סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-500 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר סבוב בצנטריפוגה, הסירו את מצע הגידול ממשקע התאים, השעיקו מחדש את משקע התאים, והוסיפו או רכיב triol או את בופר הליזה מהערכה המועדפת עליכם לבידוד RNA. אם אתם משתמשים ב-triol, חלקו את הדגימה למכמויות של 1 mL במבחנות Eppendorf מסומנות בנפח 1.5 mL והקפיאו בטמפרטורה של 80°C-. חזרו על הפעולה עבור כל נקודות הזמן.קציר של בקבוק אחד לכל נקודת זמן. בשלב זה, הדגימה צריכה להיות רספנדית עם ריאגנט הטריול ומוכנה לעיבוד. הוסף 200 µL של ריאגנט הפרדה של BCP.עבור כל מיליליטר אחד של triol בכל מבחנה, משתמשים ב-BCP או ב-bromo three chloro propane במקום בפנול. כדי להפחית זיהום של genomic DNA, ייתכן שיהיה צורך להעביר את הדגימה למבחנה גדולה יותר. אם אתם מתחילים עם כמות גדולה של triol, בצעו vortex או נערה חזק והדרימו בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד שלוש דקות; לאחר ההדגרה, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-12,000 g למשך 15 דקות.שכבת מים צריכה להיראות כשכבה שקופה בחלק העליון. העבירו את השכבה המימית למבחנה חדשה. עליכם לקבל כ-600 µL עבור כל מיליליטר של triazole שבו השתמשתם בתחילת התהליך.בצע מיצוי שני באמצעות פנול-כלורופורם. הפעם השתמש ב-500 µL של כלורופורם לכל 1 mL של טריאזול במקום BCP. מיצוי הכלורופורם השני משמש להסרת שאריות של ממס אורגני מהמיצוי, שכן אפילו כמויות מזעריות עלולות לעכב שלבי הגברה עוקבים.ערבב במערבל Vortex או נער בעוצמה, ולאחר מכן הדגר בטמפרטורת החדר למשך שתי עד שלוש דקות. סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-12,000 GS למשך 15 דקות. לאחר הצנטריפוגציה, העבר את הפאזה העליונה למבחנה נקייה.זכרו, הפאזה המימית היא השכבה השקופה שבלמעלה. לאחר מכן, הוסיפו 20 micrograms של אקרילאמיד ליניארי לכל דגימה. האקרילאמיד הליניארי משמש כנשא ומסייע להשקיע את ה-RNA.הוסיפו לכל דגימה 500 µL של איזוֹפרוֹפָּנול עבור כל מילליטר של טריול שהיה בנקודת ההתחלה, וערבבו. הדגירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות; לאחר הדגירה, סובבו את הדגימות במסבב מיקרו-צנטריפוגה במהירות מרבית למשך 10 עד 15 דקות. משקע ה-RNA יהיה גלוי בתחתית המבחנה לאחר הצנטריפוגה.הסרו בזהירות רבה את הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנה, באמצעות שואב ואקום או באופן ידני בעזרת פיפטה. אין להפריע למשקע. שטפו את המשקע עם מיליליטר אחד של 70% ethanol וסובבו בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך חמש עד שבע דקות.בזהירות רבה. הסר את האתנול מהמבחנה באמצעות שואב ואקום או ידנית בעזרת פיפט. השלף את העלייה (supernatant).בדקו שהמשקע נראה בתחתית המבחנה. חזרו על שלב שטיפה זה לאחר השליכת הנוזל העליון. סמנו על המבחנה את מיקומו של המשקע.ייבשו את המשקע באוויר למשך לא יותר מחמש דקות. אל תייבשו יתר על המידה, שכן הדבר יקשה על reconstitution של ה-RNA. לאחר מכן, אם מתוכנן טיפול ב-DNA, השעו את המשקע ב-17 µL של מים נטולי נוקלאז.אם לא מתוכנן טיפול D'S, השעה את ה-resus ב-20 µl. עבור טיפול D'S, השתמש בערכת KaiGen RNA free DNA. הוסף 2 µl של buffer, RDD ו-1 µl של reconstituted RNAs free.ערבב בעדינות את ה-DNAs עם ה-RNA שהושעה, דגרי ודגרי 37 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף שני microliters של EDTA בריכוז 2.5 millimolar ודגרי ב-65 degrees Celsius למשך חמש דקות. כדי לבטל את פעילות ה-DNA, אין לחרוג מזמן או מטמפרטורת הביטול, שכן זמנים ממושכים וטמפרטורות גבוהות יותר עלולים לגרום לפירוק של ה-RNA.כעת השלמת את הטיפול ב-DNA. בדוק את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. ניתן לזהות עקבות של פנול או BCP כשיא ב-270 nanometers, מעבר לשיא הסטנדרטי ב-260 nanometers.בעת מדידת הבליעה של RNA כולל לאחר ההפרישה, אם מופיעה זיהום כזה, יש לטהר את ה-RNA באמצעות שיטת הפרשת RNA מבוססת מסנן או עמודה לפני המשך להגברה. ניתן לאחסן את דגימת ה-RNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. ניתן לבדוק את איכות ה-RNA במידת הצורך, באמצעות Agilent bioanalyzer או על ידי הרצת הדגימה על ג'ל דנטורציה ובדיקת קריאות ה-OD ב-bioanalyzer.איכות RNA טובה מודגשת על ידי מספר שלמות ה-RNA, או RIN. ה-RIN מבוסס על מערכת מספור מ-1 עד 10, כאשר 1 מייצג את הפרופיל המעובד/מפורק ביותר ו-10 מייצג את השלם ביותר. הרגע הראינו לכם כיצד לבצע הדבקה במתווה של סדרת זמנים עם נגיף ה-vaccinia וכיצד להפיק את ה-RNA מתאים נגועים בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ישנם מספר שלבים קריטיים בהקמת זיהום סינכרוני בנגיף הווקסיניה (vaccinia). ראשית, יש לבצע סוניקציה מדויקת או טיפול בטריפסין של הנגיף. חשוב לפרק את מקבצי חלקיקי הנגיף, כיוון שנגיף הווקסיניה נוטה מאוד להיווצרות אגרגטים, דבר שעלול למנוע זיהום אחיד של התאים.שנית, על מנת להשיג הדבקה אסינכרונית, יש להשתמש ב-MOI גבוה של יותר משני, כדי להבטיח שכל תא יודבק. תערובת של תאים נדבקים ותאים שאינם נדבקים תוביל לסבבים מרובים של הדבקה, לתערובות הטרוגניות של נקודות זמן, ולתגובות שעתוק ויראליות ותגובות של המארח שאינן סינכרוניות. שלישית, יש לבצע את ההדבקה בכמויות מינימליות של מצע גידול כדי לאפשר ספיגה מקסימלית של הנגיף אל התאים.בנוסף, ניעור קבוע של הבקבוק או של צלחות התרבית מדי 10 דקות מאפשר את פיזור הווירוס ברחבי הבקבוק ומבטיח שהתאים לא יתייבשו. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.הקפידו לצפות בסרטונים האחרים בסדרה זו, שבהם אנו מציגים את ההליך להגברה ליניארית של דגימות RNA ואת תהליכי ההכנה והניקוי של RNA מסומן פלואורסצנטית.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 2 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 3 מתאר את תהליך fluorescently תיוג RNA מוגבר מן המארח והן דגימות ויראלי באמצעות צימוד allyl אמינו של צבעים. חלק 3 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

וירוסים oncolytic הם מבטיחים סרטן ותרופות. היכולת לוודא את infectability של דגימות רקמה חיה המתקבל חולים לפני הטיפול הוא יתרון ייחודי של גישה זו הטיפולי. פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך רקמות...

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

שיטה של ​​התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

ICP0 עובר טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. מנגנון מולקולרי של אירוע זה אינו ידוע. כאן נתאר את השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ככלי לכמת ICP0 בתנועת זיהום HSV-1, אשר מניחה את היסודות לניתוח באופן כמותי ICP0 רוברטסונית במחקרים מכניסטית בעתיד.

ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

למדו את פרוטוקול ההדבקה בתאי HeLa בנגיף Vaccinia ואת חילוץ ה-RNA בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים של המארח והנגיף במערכי מיקרו.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

גלה סרטונים נוספים