Name: Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: למדו את פרוטוקול זיהום תאי HeLa בנגיף Vaccinia וניתוח ביטוי גנים באמצעות תמלול הפוך ותמלול מבחנה. שיטה זו מאפשרת חקר שינויים בביטוי גנים של המארח והנגיף לצורך ניתוח מערכי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

וייטהד במכון עמיתי קרנות

חלק 1: סינתזה cDNA מ-RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש Ambion אמינו Allyl MessageAmp השנייה ערכה, מומלץ להוסיף נפח של אתנול 100% על מאגרים לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור התגובה PCR, להוסיף בין 100ng כדי 5μg של רנ&quot;א 1μl הכולל של פריימר T7 (DT) אוליגו. תביאו את נפח עד 12μl עם מים nuclease חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב thermocycler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות רנ&quot;א של 70 ° C ו צנטריפוגות בקצרה. מניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את 1 סינתזה רחוב סטרנד לערבב אב לשמור בטמפרטורת החדר (עם overage 10% pipetting שגיאה). (לוח 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות פיפטה מאסטר או קפיצי לערבב ולאחר מכן צנטריפוגות בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 8μl של מיקס מאסטר לטעום כל RNA. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות thermocycler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות צנטריפוגה בקצרה ומניחים על קרח. להמשיך מיד לשלב הבא של סינתזה dsDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את 2 nd סטרנד סינתזה מאסטר לערבב על קרח (עם overage 10% pipetting שגיאה). (לוח 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות פיפטה מאסטר או קפיצי לערבב ולאחר מכן צנטריפוגות בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 80μl לטעום כל לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 16 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות thermocycler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 2 שעה, להמשיך לשלב לנקות cDNA או להקפיא מיד -20 ° C. </li></ol> חלק 2: פעמיים תקועים cDNA לנקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Pure cDNA מהמקרר ולאפשר לו לאזן את טמפ &#39;החדר למשך 30 דקות לפני השימוש. לנער את הבקבוק מלא resuspend חרוזים מגנטיים מחייב cDNA לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nuclease ללא Aliquot מים לתוך צינור 1.5mL ו לדגור על 50-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות במהלך הדגירה 2hr הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 180μl של Pure cDNA לטעום כל אחת, לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. העברת דגימות לצלחת מסביב לתחתית 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשיכים לערבב בעדינות על ידי דגימות רועדות את הצלחת על שייקר מסלולית לפחות 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. השאירו צלחת על דוכן העדים במשך כ 6 דקות, או עד שהתערובת הופכת שקופה חרוזי מחייב יש pelleted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מדוכן מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לשטוף 150μl הצפת cDNA זה היטב ולנער את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות בינונית. חרוזים לא לפזר בשלב זה, בשל מתח הפנים הנמוך למאגר לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מדוכן מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף זמן 2 nd עם הצפת 150μl לשטוף cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף 2 nd, לייבש את החרוזים על ידי רועדת את הצלחת למשך 2 דקות על שייקר מסלולית במהירות המקסימלית. אל overdry! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute cDNA מן החרוזים ידי הוספת 18μl המים nuclease ללא שחומם מראש ל מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף ללחוץ את הצלחת במשך 3 דקות על שייקר מסלולית, ואז לבדוק כדי לוודא חרוזים מגנטיים מפוזרים באופן מלא. אם לא, ממשיכים לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חרוזים מגנטיים התפזרו לגמרי, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת cDNA eluted (~ 16μl) לצלחת PCR חדש (או צינורות PCR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך ישירות לשלב הבא, או להקפיא את cDNA ב -20 ° C. </li></ol> חלק 3: ב תמלול חוץ גופית (IVT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת מאסטר IVT בטמפרטורת החדר. (לוח 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות פיפטה מאסטר או קפיצי לערבב, ו צנטריפוגות בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 24μl לטעום כל אחד, לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות thermocycler, ואז להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשלב הבא. </li></ol> חלק 4: ארנה לנקות אחרי IVT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס החרוזים RNA מחייב בקצרה להשיג תערובת אפילו לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת ארנה איגוד בטמפרטורת החדר (לוח 4) ניתן לעשות זאת מבעוד מועד -. תמהיל מחייב מוכנים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot elution ארנה הצפת לתוך צינור דגירה 1.5mL ועל 50-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 70μl של תמהיל ארנה מחייבלטעום כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות הצלחת PCR לצלחת מסביב לתחתית 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl של 100% isopropanol לטעום כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הצלחת על שייקר מסלולית לפחות 2 דקות לערבב ביסודיות את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. השאירו את הצלחת על דוכן העדים עד שהתערובת הופכת שקופה חרוזי מחייב יש pelleted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מדוכן מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μl פתרון ארנה שטפי זה טוב לטלטל את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות בינונית. חרוזים לא יכול לפזר באופן מלא בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מדוכן מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף זמן 2 nd עם פתרון לשטוף ארנה 100μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף 2 nd, לייבש את החרוזים על ידי רועדת את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות המקסימלית. אל overdry דגימות! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute ארנה מן החרוזים ידי הוספת מאגר 40μl שחומם מראש ארנה elution לטעום כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף ללחוץ את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 3 דקות, ואז לבדוק כדי לוודא חרוזים מגנטיים מפוזרים באופן מלא. אם לא, ממשיכים לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חרוזים מגנטיים התפזרו לגמרי, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. Supernatant מכיל את ארנה ניקה-up אמינו allyl משולבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת ארנה eluted לצלחת PCR חדש (או צינורות PCR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (שלב אופציונאלי) בדוק את ריכוז RNA של הדגימות על ידי מדידת 1.5μl על ספקטרופוטומטר NanoDrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להמשיך אל השלב הבא, או לאחסן את ארנה ב -80 ° C. </li></ol> טבלה 1: 1 סינתזה cDNA רחוב סטרנד מיקס מאסטר <table border="1" cellpadding="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> סכום עבור תגובה 1 </td></tr><tr><td> 10X סטרנד ראשון הצפת </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> Ribonuclease אינהיביטור </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> מערך סקריפט </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 2: סטרנד cDNA 2 nd סינתזה מיקס מאסטר <table border="1" cellpadding="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> סכום עבור תגובה 1 </td></tr><tr><td> Nuclease מים חינם </td><td> 63 μl </td></tr><tr><td> 10X סטרנד השנייה הצפת </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> DNA פולימראז </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> לוח 3: מיקס מאסטר IVT <table border="1" cellpadding="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> סכום עבור תגובה 1 </td></tr><tr><td> aaUTP פתרון (75 mM) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> ה-ATP, CTP, GTP לערבב (25 mM) </td><td> 12 μl </td></tr><tr><td> T7 UTP פתרון (75 mM) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> T7 הצפת התגובה 10X </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> T7 מערבבים אנזימים </td><td> 4 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 4: מיקס ארנה הכבילה <table border="1" cellpadding="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> סכום עבור תגובה 1 </td></tr><tr><td> RNA חרוזים עקידת * </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> הפתרון ביד Resuspension * </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 100% isopropanol ** </td><td> 6 μl </td></tr><tr><td> ארנה תתרכז הצפת הכבילה </td><td> 50 μl </td></tr></tbody></table> * מערבבים את החרוזים RNA מחייב את הפתרון resuspension החרוז הראשון. ** מוסיפים את isopropanol ומערבבים היטב לפני הוספת להתרכז חיץ מחייב ארנה.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

קריטי שלבים בסיבוב השני של הגברה לא מומלץ, היות הטיות נתונים מערך נצפו. ערבוב בזהירות בכל שלב האנזימטית (1 st ו - 2 nd סינתזת גדיל cDNA, IVT) הוא קריטי להשגת תשואות הגברה טובה, כמו דגירה של כל צעד האנזימטית בטמפרטורה המתאימה. Cycler PCR עם מכסה מחומם מתכווננת עדיפה - סטיות אפילו קטן כמו 2-3 מעלות במהלך IVT בתנור הכלאה הכלאה אוויר או אמבטיה במים יכול להשפיע באופן משמעותי על תשואה של המוצר מוגבר...

<table><tbody><tr><td>ערכה להגברת aRNA מדגם Amino Allyl MessageAmp II</td><td>ריאגנט</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>עבור 20 תגובות</td></tr><tr><td>ערכה להגברת aRNA מדגם Amino Allyl MessageAmp II</td><td>ריאגנט</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>עבור 100 תגובות, בפורמט של 96 בארות</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>אחר</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>או ספקטרופוטומטר שווה ערך</td></tr></tbody></table>

vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

המשפחה<em&gt; Poxviridae</em&gt; מורכב גדילי הדנ&quot;א הכפול גדולים המכילים וירוסים לשכפל אך ורק בציטופלסמה של תאים נגועים. חברי<em&gt; Orthopox</em&gt; הסוג כולל אבעבועות, הסוכן סיבתי של אבעבועות קטנות האדם, הקוף, ואת vaccinia (VAC), חבר prototypic משפחת וירוסים. בתוך גדולות יחסית (~ 200 kb) vaccinia הגנום, שלוש כיתות של גנים המקודדים: מוקדם, ביניים מאוחר. בעוד כל שלוש כיתות מתועתקים ידי virally בקידוד polymerases RNA, כל שיעור מהווה פונקציה שונה במחזור החיים של הנגיף. Poxviruses לנצל אסטרטגיות מרובים עבור אפנון של הסביבה המארחת הסלולר במהלך ההדבקה. כדי להבין את הרגולציה של המארח וגם גן ביטוי וירוס, יש לנו מנוצל הגנום כולו גישות לנתח שפע תמליל מנגיף וגם התאים המארחים. הנה, אנחנו מדגימים כמובן זמן זיהומים של תאים הלה בווירוס Vaccinia ו-RNA הדגימה במספר נקודות זמן לאחר הפגיעה. מארח שני ו-RNA ויראלי הכולל מופרד מוגבר של הכלאה כדי microarrays עבור ניתוח של ביטוי גנים.

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 2 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

המשפחה Poxviridae מורכבת מנגיפים גדולים המכילים DNA דו-גדילי המשכפלים את עצמם אך ורק בציטופלזמה של תאים נגועים. חברים ב...

שלום, אני ג'ודי ין מהמעבדה של קייט רובינס במכון וייטהד למחקר ביו-רפואי. לאחר הדבקת תאי hela בנגיף הוואקסיניה ובידוד RNA כולל, כפי שהוצג בפרוטוקול וידאו קודם של JoVE, ניתן לבודד ולהגביר RNA ויראלי באמצעות שעתוק הפוך ושעתוק in vitro; ה-RNA המוגבר ישמש בהמשך לניתוח מיקרו-מערך (microarray) של ביטוי גנים ויראליים ושל המארח. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל את סינתזת ה-c DNA מה-RNA, הוסיפו את הנפח המומלץ של אתנול בריכוז 100% לתמיסורי השטיפה לפני השימוש בערכה. בתוך מבחנת תגובת PCR, הוסיפו בין 100 nanograms ל-5 micrograms של RNA כולל ו-1 microliter של פריימר T7 oligo. השלימו את הנפח ל-12 microliters באמצעות מים נקיים מנוקלאז. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות במכשיר תרמוסייקלר.בשלב הבא, הוציאו את דגימות ה-RNA מ-70 degrees Celsius בתוך הצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, הניחו את הדגימות קצרה על קרח. הכינו תערובת מאסטר (master mix) לסנתזה של הגדיל הראשון עם תוספת של 10% לנפח כדי לפצות על שגיאות פיפטינג.השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר, ערבבו את ה-master mix באמצעות פיפטור עדין או על ידי נקישה, ולאחר מכן סבבו סבב קצר בצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, העבירו 8 µL של ה-master mix לכל דגימת RNA, וערבבו באמצעות פיפטור על ידי העלאה והורדה של הנוזל שלוש עד ארבע פעמים. דגרו בטמפרטורה של 42 °C למשך שעתיים בטרמוסייקלר. לאחר הדגירה, סבבו את הדגימות סבב קצר בצנטריפוגה והניחו אותן על קרח. עברו מיד לשלב הבא של סינתזת cDNA.הכינו את תערובת המאסטר (master mix) לסינתזת הגדיל השני על קרח, עם עודף של 10% בנפח כדי לפצות על שגיאות פיפוט. ערבבו את תערובת המאסטר בעזרת פיפוט עדין או על ידי ניעור קל, ולאחר מכן צנטריפוגו לזמן קצר. העבירו 80 µL לכל דגימה וערבבו בעדינות על ידי פיפוט מעלה ומטה שלוש עד ארבע פעמים. הדגירו בטמפרטורה של 16 °C למשך שעתיים בטרמוסייקלר.לאחר דגירה של שעתיים, המשיכו לשלב ניקוי ה-cDNA או הקפיאו באופן מיידי בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בניקוי ה-cDNA דו-גדילי, ראשית, הוציאו את ה-cDNA pure מהמקרר והמתינו 30 דקות להגעה לטמפרטורת החדר לפני השימוש; נערו את הבקבוק כדי להחזיר למצב של סספנסיה מלאה את חרוזי קישור ה-cDNA המגנטיים לפני השימוש; העבירו מנה (aliquot) של מים נקיים מנוקליאז למבחנה של 1.5 מיליליטר ודגרו בטמפרטורה של 50 עד 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.במהלך שתי שעות האינקובציה הקודמות, הוסיפו 180 µL של CD NA pure לכל דגימה וערבבו היטב על ידי העברה של הנוזל למעלה ולמטה באמצעות הפיפטה. העבירו את הדגימות לפלטה בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה. לאחר העברת הדגימות לפלטה, המשיכו לערבב את הדגימות על ידי ניעור עדין של הפלטה על שייקר אורביטלי למשך שתי דקות לפחות.העבירו את הפלטה למעמד מגנטי כדי ללכוד את החרוזיים המגנטיים. השאירו את הפלטה על המעמד למשך כשש דקות או עד שהתערובת תהפוך לשקופה והחרוזיים הקושרים ישקעו לתחתית (pelleted). שאבו בזהירות את העליון (supernatant) באמצעות שואב ואקום, תוך הקפדה לא להפריע לחרוזיים המגנטיים.לחלופין, הסירו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות פיפטה והשליכו אותו. לאחר השלכת הנוזל העליון, הוציאו את הפלטה מהמגנט. הוסיפו 150 microliters של CDNA wash buffer לכל באר ונערו את הפלטה למשך דקה אחת במכשיר הנעורה האורביטלי במהירות בינונית.חריצים אלו לא יתפזרו בשלב זה עקב מתח הפנים הנמוך של באפר השטיפה. לאחר הניעור, החזירו את הפלטה למעמד מגנטי. כדי ללכוד את החריצים המגנטיים, שאבו בזהירות את העלייה עם שואב ואקום מבלי להפריע לחריצים המגנטיים.או הסירו בזהירות את הנוזל העליון בעזרת פ pipette והשליכו אותו. הוציאו את הפלטה מהמעמד המגנטי. חזרו על השטיפה פעם שנייה עם 150 µL של CDNA wash buffer.לאחר השטיפה השנייה, ייבשו את החרו지를 על ידי ניעור של הפלטה במשך שתי דקות במכשיר הניעור האורביטלי במהירות מרבית. חשוב לא לאפשר לחרו지를 להתייבש יתר על המידה. לאחר מכן, אלוטו את ה-CDNA מהחרוזים על ידי הוספה נמרצת של 18 µL של מים נטולי נוקלאז אשר חוממו מראש לכל דגימה.נער את הפלטה במשך שלוש דקות במנער אורביטלי. לאחר מכן, ודא כי הגבישים המגנטייםK (magnetic beads) מפוזרים באופן מלא. אם לא, המשך בניעור.לאחר שהחרוזים המגנטיים התפזרו במלואם, העבירו את הפלטה למעמד מגנטי. כדי ללכוד את החרוזים המגנטיים, העבירו בזהירות את ה-cd NA ששוחרר לפלטת PCR חדשה או למבחנות PCR. עליכם לשחזר כ-16 µL של תמיסת השחרור לכל דגימה.המשיכו ישירות לשלב הבא או הקפיאו את ה-cd NA בטמפרטורה של 20- מעלות Celsius. הכינו את תערובת ה-IVT master mix בטמפרטורת החדר. שאיפו בעדינות את ה-master mix בעזרת פיפט או נערו לערבוב, וסובבו במערבל צנטריפוגי למשך זמן קצר.לאחר הצנטריפוגציה, יש להוסיף 24 µL לכל דגימה ולערבב בעדינות על ידי פיפטינג מעלה ומטה שלוש עד ארבע פעמים, ולאחר מכן להדגיר ב-37 °C למשך 14 שעות בטרמוסייקלר. לאחר מכן יש לשמור ב-4 °C עד לשלב הבא; יש לערבב קצרות את חרוזי קישור ה-RNA במיקסר (vortex) כדי לקבל תערובת אחידה לפני השימוש. יש להכין את תערובת קישור ה-RNA A בטמפרטורת החדר.ניתן לבצע שלב זה מראש. ניתן לשמור את תערובת הקשירה שהוכנה בטמפרטורת החדר למשך עד שבוע. ערבב היטב באמצעות וורטקס, העבר מנה (aliquot) של באפר אלוציה של RNA לתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר, דגור בטמפרטורה של 50 עד 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.כעת, הוסיפו 70 µl של תערובת קישור ה-A RNA לכל דגימה וערבבו היטב באמצעות שאיבה ושחרור (pipetting) של הנוזל שלוש עד ארבע פעמים. העבירו את הדגימות מלוח ה-PCR ללוח בעל 96 בארות עם תחתית עגולה. לאחר מכן, הוסיפו 50 µl של 100% isopropanol לכל דגימה וערבבו היטב באמצעות שאיבה ושחרור של הנוזל שלוש עד ארבע פעמים.נער את הפלטה בעדינות על מנער אורביטלי למשך שתי דקות לפחות. כדי לערבב את הדגימות ביסודיות, העבר את הפלטה למעמד מגנטי. כדי ללכוד את חרוזי המגנט.השאירו את הפלטה על המעמד עד שהתערובת תהפוך לשקופה והחרוזיים הקושרים ישקעו. לאחר שהחרוזיים שקעו, שאבו בזהירות את העלייה עם שואב הוואקום מבלי להפריע לחרוזיים המגנטיים. לחלופין, הסירו בזהירות את העלייה באמצעות פיפטה והשליכו אותה.הוצא את הפלטה מהמעמד המגנטי. לאחר מכן, הוסף 100 µL של תמיסת שטיפת RNA לכל באר ונער את הפלטה במשך דקה אחת במנער אורביטלי במהירות מתונה; אין צורך שחרוזים יתפזרו לחלוטין. בשלב זה, העבר את הפלטה למעמד מגנטי.ללכידת חרוזי המגנט. שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שואב ואקום מבלי להסיט את חרוזי המגנט. לחלופין, הסירו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות פיפט והשליכו אותו.לאחר הסרת הנוזל העליון, הוציאו את הפלטה מהמעמד המגנטי. חזרו על השטיפה פעם שנייה עם 100 µL של תמיסת שטיפה ל-RNA. לאחר השטיפה השנייה, ייבשו את החרוזים על ידי ניעור הפלטה במשך דקה אחת במנער האורביטלי במהירות המקסימלית.יש להקפיד לא לייבש את הדגימות יתר על המידה. יש לשטוף את ה-A RNA מהחרוזים על ידי הוספה של 40 µL של תמיסת elution עבור A RNA שחוממה מראש. יש לנער בעוצמה כל דגימה בלוח על גבי מנער אורביטלי למשך שלוש דקות. לאחר מכן, יש לוודא שהחרוזים המגנטיים מפוזרים באופן מלא.אם לא, המשיכו בערבוב. ברגע שהחרוזיים המגנטיים התפזרו לחלוטין, העבירו את הפלטה למעמד מגנטי כדי ללכוד את החרוזיים המגנטיים. הנוזל העליון (supernatant) מכיל את אלל האמינו המנוקה, המשולב ב-RNA.העבירו בזהירות את ה-RNA שאלואו לפלטת PCR חדשה או למבובות PCR. בשלב זה, ניתן לבדוק את ריכוז ה-RNA של הדגימות על ידי מדידה של 1.5 µL בספקטרופוטומטר NanoDrop. המשיכו מיד לשלב הבא או אחסנו את ה-RNA בטמפרטורה של 80°C-.הרגע הצגנו כיצד לסמן פלואורסצנטית דגימות RNA שעברו הגברה ושולבו באללים אימונו-ספציפיים עבור היברידיזציה של מיקרו-מערך. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי לא מומלץ לבצע סבב הגברה שני. מכיוון שנצפו הטיות בנתוני המערך, חשוב לזכור כי ערבוב קפדני בכל שלב אנזימטי מומלץ הן עבור הגדילה של הגדיל הראשון והשני.סינתזת CDNA, או שלב ה-IVT, הם קריטיים להשגת תנובת הגברה גבוהה, וכך גם דגירה של כל שלב אנזימטי בטמפרטורה המתאימה. עדיף להשתמש במכשיר PCR עם מכסה מחומם שניתן לכיוונון, שכן אפילו סטיות קטנות של שתיים עד שלוש מעלות במהלך התעתוק in vitro בתנור היברידיזציה באוויר או באמבט מים להיברידיזציה עלולות להשפיע משמעותית על תנובת המוצר שהוגבר.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם. הקפידו לצפות בסרטונים האחרים בסדרה זו, שבהם אנו מדגמים כיצד לבצע הדבקה של vaccinia virus בנקודות זמן שונות, מיצוי RNA מהדגימות, והכנה וניקוי של RNA מסומן פלואורסצנטית.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 1 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 3 מתאר את תהליך fluorescently תיוג RNA מוגבר מן המארח והן דגימות ויראלי באמצעות צימוד allyl אמינו של צבעים. חלק 3 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

וירוסים oncolytic הם מבטיחים סרטן ותרופות. היכולת לוודא את infectability של דגימות רקמה חיה המתקבל חולים לפני הטיפול הוא יתרון ייחודי של גישה זו הטיפולי. פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך רקמות...

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

שיטה של ​​התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

ICP0 עובר טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. מנגנון מולקולרי של אירוע זה אינו ידוע. כאן נתאר את השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ככלי לכמת ICP0 בתנועת זיהום HSV-1, אשר מניחה את היסודות לניתוח באופן כמותי ICP0 רוברטסונית במחקרים מכניסטית בעתיד.

ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

למדו את פרוטוקול זיהום תאי HeLa בנגיף Vaccinia וניתוח ביטוי גנים באמצעות תמלול הפוך ותמלול מבחנה. שיטה זו מאפשרת חקר שינויים בביטוי גנים של המארח והנגיף לצורך ניתוח מערכי.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

גלה סרטונים נוספים