Name: מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למד כיצד למדוד קינטיקה של שחרור vesicles בנוירונים היפוקמפיים באמצעות צבע FM 4-64 ומיקרוסקופיה הפוכה בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני העברה עצבית בצורה מדויקת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תאים: חולדה (או עכבר) העיקרי בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס (14-28 ימים במבחנה). גירוי: חשמל, מועבר דרך שתי אלקטרודות פלטינה: 70-90 mV מיקרוסקופית: 60x עדשה שמן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי CCD הפוכה. תוכנה: Slidebook (Intelligent הדמיה חידושים, סנטה מוניקה, CA) ראה עמוד משלים שיטות לפרטים נוספים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם HEPES שנאגרו מלוחים (בהרוורד) לטמפרטורת החדר. מוסיפים את היריבים קולטן הגלוטמט APV (50 מיקרומטר ריכוז סופי) ו CNQX (10 מיקרומטר הסופי). כל ניסוי FM בדרך כלל דורש 20-30 מ&quot;ל בהרוורד. עבור עובד ריכוז של 10 מיקרומטר FM 4-64 (בדיקות מולקולריות), לדלל פתרון מניות 1:1000 ב בהרוורד (עם היריבים הוספה). בצע 2 מ&quot;ל FM soln עבור כל ניסוי. מכסים ברדיד פתרון כדי למנוע חשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslip המכיל את הנוירונים על החדר אלקטרודה. בדוק כי התקשורת בתא היא רמת עם גבי קאמרית מכסה לחלוטין את האלקטרודות. הסר את כל פתרון העולה מתחתית coverslip. הוספת שמן על העדשה (אם באמצעות עדשה שמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מנגנון זלוף. לשטוף מ&quot;ל כמה מאלה כל סדר נתון (שלא כל זרימה one ביסודיות לפני הוספת הבא): מים, מים, אתנול, אז בהרוורד. לאחר מכן להוסיף את בהרוורד (לשמור כמה מ&quot;ל להוסיף ביד בצעדים בעתיד) ולסגור את זלוף. הגדרת מוצא זלוף ואת יניקה משני צדי המתרס בשולי coverslip. זה הכי טוב אם את שקע זלוף מגיע אל החדר, שם כמו יניקה צריך לנוח בחלקו העליון. בעוד הוספת בהרוורד (או על ידי זלוף או ביד), לפתוח את היניקה ולהתאים את עמדתה, כך טוען בתקשורת על זכות ברמה פשוט מלא מכסה את האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש באזור על coverslip שברצונך התמונה ולנסות להביא אותו בערך בפוקוס. אזורים אופטימלית מכילים סינפסות רבות, אבל לא צריך להיות כל כך צפוף כזה תהליכים בודדים ניתן יהיה להבחין בינן. לא צריך להיות שום ל-מינימלית גופי התא, קרום חיצוני (כגון גושים של האסטרוציטים), או חומרים לא ספציפיים אחרים (כגון מוך). לצבוע FM עשוי nonspecifically לדבוק אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;WG&quot; קוביה המסנן (אשר מלהיב עם אור ירוק אדום ואוסף ל-הרבה פליטות אדום). הגדר Slideview &quot;העדפות ללכוד&quot; כדי לספק 900 AP ב 10Hz על תחילתה של תמונה 0 (בדרך כלל 300-900-APS משמשים גירוי זה טעינה). בחלון התמונה, בחר את &quot;fluo מול אדום&quot; הגדרות המסנן ולשנות זמן חשיפה 100 ms. בטל קיימים הגדרות timelapse. אל תיקח את כל התמונות עד שתהיה מוכן להתחיל את הגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא יניקה הוא על / פתוח. מהר להוסיף את soln FM (2 מ&quot;ל) לחדר בקצה השני של יניקה. מיד העיתונות בסדר בחלון התמונה לקחת תמונה להתחיל גירוי. חכו 30-45 שניות לאחר גירוי ואז לשטוף במהירות FM ידי הוספת ~ 2 מ&quot;ל של בהרוורד (אני עושה זאת ביד עם טפטפת, אבל זה יכול להיעשות גם על ידי זלוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את FM עם בהרוורד דרך זלוף עבור ~ 10 דקות. קצב הזרימה צריך להיות 1-1.5 mL / min. במהלך שלב זה לשטוף, לשנות את העדפות גירוי כך את הופעת גירוי מתחיל @ תמונה 10 (בדרך כלל 900-1200 APS @ 10 Hz משמשים גירוי זה destaining). כ 7 דקות לתוך לשטוף, בדוק את ההעדפות (הופעת גירוי על תמונה 10). עכשיו באמצעות חלון קטן להתמקד לבחור ולהתמקד subregion. ודא את הגדרות גירוי שונו לפני שתמשיך לשלב הבא. קחו תמונה אחת כדי לראות אם לשטוף תושלם (סינפסות הפרט צריך להיות punctated בבירור). אם לא, להגביר את קצב זרימת 0.5mL/min נוספים, לחכות עוד 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף תושלם, להתאים את זמן החשיפה הדרוש כדי עדיין לקבל אות טוב, ברור (בדרך כלל בין 5-10 מילישניות. חשיפה פעמים צריך להיות ממוזער בשל photobleaching מהירה של FM). ואז להגדיר את ההעדפות timelapse לקחת 38 תמונות כל 5 שניות. בדוק את זלוף לעשות יש מספיק בהרוורד עוד 5 דקות, ולהשאיר זלוף זורם. התחל timelapse להתחיל destaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר destain, לשנות את ההגדרות כדי לספק גירוי 1200 AP @ 10Hz (בדרך כלל 1200-2000-APS משמשים בשלב זה סופי) על התמונה 0. כבה את הגדרות timelapse ולקחת תמונה אחת כדי להתחיל גירוי. זלוף עדיין צריך להיות זורם צעד זה יסייע להסיר כל צבע שלפוחי הנותרים FM, על מנת לקבוע הבסיס / &quot;הכל releasable&quot; פלואורסצנטי. לאחר הגירוי הוא סיים, לכבות את הגדרות גירוי, להביא את האזור להתמקד. סגור את זלוף ו יניקהולאחר מכן לקחת שתי תמונות הבסיס הסופי. או תמונות בודדות או Z-מחסנית תמונות (0.5 צעדים מיקרומטר) ניתן לקחת. Z-ערימות מועילים במקרה לא היה שינוי המטוס של המוקד במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניסוי FM שלך נעשה. אם מיד עושים ניסויים יותר, העדשה קאמרית יש לנקות בין כל ניסוי, אך המנגנון זלוף לא צריך לנקות עד לאחר הניסוי הסופי. שוטפים את מנגנון לחלוטין עם מים, אז אתנול. </li></ol>

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי ברות להצהיר עליהם.

כפי 300 הפוטנציאלים לפעולה (APS) מספיקה כדי לגרום לפחות סיבוב אחד של מיחזור שלפוחית, גירוי הטעינה של 300 APS או יותר ניתנת לעיתים קרובות התווית בריכה מיחזור של שלפוחית. למרות גירויים טעינת אינטנסיבי יותר, כגון APS 900, עשוי לאפשר מספר נקוב של שלפוחית ​​נוספת כדי להיות מתויג, זה גם מעלה את כמות הזמן לצבוע יכולים להטביע ממברנות תאי, המוביל מכתים הלא ספציפית יותר. מצאתי את הצעד לשטוף להיות קריטית כדי להבטיח destaining הנכון. חשוב perfuse עם קצב זרימה 1-1.5 מ&quot;ל לדקה, בדרך כלל 10 + 2 דקות. תמונה אחת ש...

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T-3166</td><td></td></tr><tr><td>CNQX disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-239</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג fm

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית ​​יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית ​​שכותרתו עם FM לצבוע כדי לפקח על קצב שחרור שלפוחית ​​presynaptic. FM4-64 הוא צבע אדום ניאון styryl amphiphilic כי מטביע לתוך הממברנות של שלפוחית ​​סינפטית כמו אנדוציטוזה מגורה. אינטראקציות lipophilic לגרום לצבוע כדי להגדיל באופן משמעותי בשנת הקרינה, ולכן פולטות אות בהיר כאשר הקשורות שלפוחית ​​ואחד הנומינלי כאשר בנוזל תאיים. אחרי צעד לשטוף משמש כדי לסייע להסיר צבע חיצוני בתוך קרום התא, FM הנותרים מרוכזת בתוך שלפוחית ​​והוא גורש מכן, כאשר exocytosis הוא המושרה על ידי סיבוב נוסף של גירוי חשמלי. קצב שחרור שלפוחיות נמדדת מירידה וכתוצאה מכך הקרינה. מאז FM צבע ניתן ליישם חיצוניים transiently, הוא כלי שימושי לקביעת שיעורי exocytosis בתרבויות העצבית, במיוחד כאשר משווים את שיעורי בין הסינפסות transfected ו boutons לשלוט השכנות.

היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית ​​יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית ​​שכותרתו עם צבע אדום ניאון FM 4-64 למדוד את קצב שחרור שלפוחית ​​presynaptic בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

היכולת למדוד את קינטיקת שחרור הוסיקולות יכולה לסייע בהבנת חלק מיסודות התמסורת העצבית. כאן השתמשנו ב... בזמן אמת

אני ג'ימי לין. אני סטודנט לתואר מתקדם בתוכנית לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת הרווארד. כעת אני עובד במעבדת מרפי, ובמעבדה אנו עובדים עם נוירונים מההיפוקמפוס.כעת אראה לכם כיצד לבצע ניסויי FM d. כעת נמשיך ונקבע את זכוכית הכיסוי שעליה נמצאים נוירונים לתוך התא המעוצב במיוחד. המיקרוסקופ שלנו הוא מיקרוסקופ הפוך מסוג CC, D; וודאו שייבשתם היטב את החלק התחתון.לא נחבר את האלקטרודות. לא. כעת מערכת הפרפוזיה מוכנה. אני אמקם אותה בקצה אחד של התא.אנו משתמשים בחימר לצורך קיבוע. מובילי ה-HBS לכל ניסוי יוסיפו את כל המרכיבים הללו. מערך ההיתוך מוכן.ניתן להשתמש בחימר כדי לקבע זאת במקומו, אני מניח בצורה כזו שיש בה גופי תא, כיוון שקממי גופי התא יספגו הרבה מהצבע ויהיו ממש בתוך הסינפסות. אולי באזור סמוך כמו כאן, שבו רק באזור הזה הייתי באופן מיידי ואנחנו ממשיכים. וכך מתבצע הפיגמנטציה הפוטוכימית הראשונית (photo bleaching) מתוך 10 התמונות הראשונות.וכאן הגענו לשלב שבו, אני ג'מיל ניוטון. אני סטודנט לתואר שני בתוכנית לביולוגיה מולקולרית כאן בהרוורד. אני עובד כעת במעבדה למדעי המוח תחת הנחייתה של Vinky Murphy כחוקרת הראשית (pi).והנושא עליו אני רוצה לדבר איתכם היום הוא ביצוע ניסויי FM. מהי המטרה של הניסוי שלכם? הדבר הנחמד ב-FM הוא ש-FM הוא צבע פלואורסצנטי המאפשר לנו לעקוב אחר הקינטיקה של האקסוציטוזה.לכן, ראשית אנו מוודאים שהצבע נספג בסינפסה על ידי מתן גירוי טעינה. לאחר תקופת שטיפה, אנו נותנים גירוי שחרור שבו הצבע משתחרר מהשלחיתות. האם אתם עובדים על סוג ספציפי של נוירונים?לכן, במעבדה שלנו, אנו משתמשים בשיטה זו עבור נוירונים של ההיפוקמפוס, ואנו משתמשים בה בנוירונים בתרבית ולא בליזיס. מהן הבעיות האפשריות בניסוי זה? חלק מהבעיות הנפוצות, במה שאנו משתמשים בו, הן סימולציה חשמלית.לעיתים בעבר, מכל סיבה שהיא, היו בעיות בהפעלת הסימולציה החשמלית. ואני יודע שמעבדות אחרות משתמשות גם הן בתמיסת אשלגן בריכוז גבוה. לכן, תמיסת אשלגן בריכוז גבוה יכולה להוות חלופה טובה לשימוש בגירוי חשמלי במקרה של בעיות בגישה זו.בנוסף, בדרך כלל, מסיבה כלשהי במהלך שלב השטיפה, נראה כי לא מתרחש שחרור מספיק של הצביעה הבלתי ספציפית. מצאתי לעיתים קרובות שרק על ידי הגדלת קצב הזרימה, כך שבמקום חצי ml נבצע 1.5 ml לדקה, ועל ידי הגדלת זמן השטיפה מחמש דקות לעשר דקות, התוצאות משתפרות באופן דרמטי. מהם היישומים האפשריים של ניסוי זה?מה אתם בעצם רוצים לבדוק? ובכן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון תאי בקרה לעומת תאים שעברו מניפולציה כלשהי. לדוגמה, בקווי עכברים שונים, תוכלו לבדוק אם קינטיקת השחרור שונה באופן כלשהו, או לבדוק אם הוספה של תרופה מסוימת משפיעה בפועל על הציטוזיס.תודה.

measuring-exocytosis-in-neurons-using-fm-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

חדש אמצעים למדוד עצבית אופטית באמצעות תחליפי דופמין ניאון.

שחרור הדופמין ב מסופי Presynaptic הפרט דמיינו עם FFNs

טכניקת דימות פלואורסצנטי לחיות לכמת את חידוש והתגייסות של שלפוחית ​​סינפטית ספציפי (SV) בריכות במסופי העצבים המרכזית מתוארת. שני סיבובים של SV מיחזור מנוטרים על מסופי העצב אותו מתן הבקרה הפנימית.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה...

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

בסרטון זה, סיבי עצב של זחלי דרוזופילה שקועים בצבע FM, אשר נקשר לשומנים בקרום התא. מיקרואלקטרודת יניקה ופולסים חשמליים מעוררים את תהליך האנדוציטוזה, ומשלבים את צבע FM בשלפוחיות אנדוציטיות שזה עתה נוצרו. שיטה זו, אשר מדמיינת שלבים presynaptic של neurotransmission, שימושי לחקר תפקוד סינפטי ושחרור נוירוטרנסמיטר.

העמסה ופריקה של צבע FM בתיווך מיקרואלקטרודה בתאי עצב של זחלי דרוזופילה

אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית ​​הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

כאן אנו מתארים הכנה חדשה להדמיית מסופים חושיים חיים של קצות מעקה המעצבבים את זקיקי השיער של עור אוזן העכבר במהלך צביעה והימנעות בצבעי סטיריל פירידיניום.

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

אחסון הוא פרמטר חשוב לגבי מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של תאים. אנו מתארים שיטה הדרה פלורסנט ומאפשר מלא-שדה למדידה של במבחנה כמות עצביים עם תת מיקרומטר רזולוציה צירית הנדרש לניתוח של neurites ומבנים דינמי משתמעת בצמיחה עצביים.

ברזולוציה גבוהה אמצעי הדמיה של נוירונים על ידי שימוש של זריחה החרגה שיטה והתקנים Microfluidic ייעודי

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

למד כיצד למדוד קינטיקה של שחרור vesicles בנוירונים היפוקמפיים באמצעות צבע FM 4-64 ומיקרוסקופיה הפוכה בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני העברה עצבית בצורה מדויקת.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

גלה סרטונים נוספים