מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM
30 בנובמבר 2006
היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית שכותרתו עם צבע אדום ניאון FM 4-64 למדוד את קצב שחרור שלפוחית presynaptic בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס.
אני ג'ימי לין. אני סטודנט לתואר מתקדם בתוכנית לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת הרווארד. כעת אני עובד במעבדת מרפי, ובמעבדה אנו עובדים עם נוירונים מההיפוקמפוס.
כעת אראה לכם כיצד לבצע ניסויי FM d. כעת נמשיך ונקבע את זכוכית הכיסוי שעליה נמצאים נוירונים לתוך התא המעוצב במיוחד. המיקרוסקופ שלנו הוא מיקרוסקופ הפוך מסוג CC, D; וודאו שייבשתם היטב את החלק התחתון.
לא נחבר את האלקטרודות. לא. כעת מערכת הפרפוזיה מוכנה. אני אמקם אותה בקצה אחד של התא.
אנו משתמשים בחימר לצורך קיבוע. מובילי ה-HBS לכל ניסוי יוסיפו את כל המרכיבים הללו. מערך ההיתוך מוכן.
ניתן להשתמש בחימר כדי לקבע זאת במקומו, אני מניח בצורה כזו שיש בה גופי תא, כיוון שקממי גופי התא יספגו הרבה מהצבע ויהיו ממש בתוך הסינפסות. אולי באזור סמוך כמו כאן, שבו רק באזור הזה הייתי באופן מיידי ואנחנו ממשיכים. וכך מתבצע הפיגמנטציה הפוטוכימית הראשונית (photo bleaching) מתוך 10 התמונות הראשונות.
וכאן הגענו לשלב שבו, אני ג'מיל ניוטון. אני סטודנט לתואר שני בתוכנית לביולוגיה מולקולרית כאן בהרוורד. אני עובד כעת במעבדה למדעי המוח תחת הנחייתה של Vinky Murphy כחוקרת הראשית (pi).
והנושא עליו אני רוצה לדבר איתכם היום הוא ביצוע ניסויי FM. מהי המטרה של הניסוי שלכם? הדבר הנחמד ב-FM הוא ש-FM הוא צבע פלואורסצנטי המאפשר לנו לעקוב אחר הקינטיקה של האקסוציטוזה.
לכן, ראשית אנו מוודאים שהצבע נספג בסינפסה על ידי מתן גירוי טעינה. לאחר תקופת שטיפה, אנו נותנים גירוי שחרור שבו הצבע משתחרר מהשלחיתות. האם אתם עובדים על סוג ספציפי של נוירונים?
לכן, במעבדה שלנו, אנו משתמשים בשיטה זו עבור נוירונים של ההיפוקמפוס, ואנו משתמשים בה בנוירונים בתרבית ולא בליזיס. מהן הבעיות האפשריות בניסוי זה? חלק מהבעיות הנפוצות, במה שאנו משתמשים בו, הן סימולציה חשמלית.
לעיתים בעבר, מכל סיבה שהיא, היו בעיות בהפעלת הסימולציה החשמלית. ואני יודע שמעבדות אחרות משתמשות גם הן בתמיסת אשלגן בריכוז גבוה. לכן, תמיסת אשלגן בריכוז גבוה יכולה להוות חלופה טובה לשימוש בגירוי חשמלי במקרה של בעיות בגישה זו.
בנוסף, בדרך כלל, מסיבה כלשהי במהלך שלב השטיפה, נראה כי לא מתרחש שחרור מספיק של הצביעה הבלתי ספציפית. מצאתי לעיתים קרובות שרק על ידי הגדלת קצב הזרימה, כך שבמקום חצי ml נבצע 1.5 ml לדקה, ועל ידי הגדלת זמן השטיפה מחמש דקות לעשר דקות, התוצאות משתפרות באופן דרמטי. מהם היישומים האפשריים של ניסוי זה?
מה אתם בעצם רוצים לבדוק? ובכן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון תאי בקרה לעומת תאים שעברו מניפולציה כלשהי. לדוגמה, בקווי עכברים שונים, תוכלו לבדוק אם קינטיקת השחרור שונה באופן כלשהו, או לבדוק אם הוספה של תרופה מסוימת משפיעה בפועל על הציטוזיס.
תודה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד במדידת קינטיקת שחרורB של שלפוחיות על מנת להעמיק את ההבנה של התמסורת העצבית. באמצעות דימות בזמן אמת עם צבע FM 4-64, המחקר בוחן את קצבי שחרור שלפוחיות פרה-סינפטיות בתרביתי נוירונים של ההיפוקמפוס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- העברה עצבית
רקע
- העברה עצבית היא תהליך קריטי בתקשורת בין נוירונים.
- שחרור שלפוחיות הוא חיוני להעברת אותות בין נוירונים.
- טכניקות דימות בזמן אמת יכולות לספק תובנות לגבי דינמיקת וסיקולות.
- FM 4-64 הוא צבע פלואורסצנטי המשמש בדרך כלל לסימון של ואקואולות (vesicles).
מטרת המחקר
- למדידת קצב שחרור של ואסיקולות פרה-סינפטיות.
- להשגת תובנות לגבי מנגנוני התמסור העצבית.
- לניצול דימוי בזמן אמת לצפייה בדינמיקה של ואסיקולות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוי בזמן אמת של וסיקולות המסומנות ב-FM 4-64.
- שימוש בתרביות של נוירונים מההיפוקמפוס לצורך הניסוי.
- תא מותאם אישית להרכבת כיסויי זכוכית עם נוירונים.
- מערך מיקרוסקופ הפוך לביצוע הדימוי.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של שיעורי שחרור של ואסיקולות פרה-סינפטיות.
- תובנות לגבי הקינטיקה של דינמיקת שחרור הוואסיקולות.
- הדגמה של יעילות ה-FM 4-64 במחקרי דימיון (imaging).
- תרומה להבנת תהליכי העברה עצבית.
מסקנות
- הדמיה בזמן אמת היא כלי בעל ערך לחקר שחרור של שלפוחיות (vesicles).
- המחקר מרחיב את הידע על מנגנוני העברה עצבית.
- FM 4-64 מספק שיטה מהימנה לוויזואליזציה של שלפוחיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של אקסוציטוזה של שלפוחיות סינפטיות באמצעות סימון בצבע FM מספקת תובנות יישומיות לגבי מנגנוני שחרור מוליכים עצביים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות הממוקדות בנוירוביולוגיה. גישה זו מאפשרת השוואה ישירה של קינטיקת שחרור השלפוחיות בין נוירונים שעברו מניפולציה גנטית או פרמקולוגית לבין ביקורות, ובכך תורמת להפחתת סיכונים מכניסטיים ולהגברת הביטחון החזוי בנקודת המפנה של הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני שחרור סינפטי בתרביות נוירונליות רלוונטיות למחלה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות המשפיעות על אקסוציטוזה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי כימות שינויים בתפקוד הפרה-סינפטי.
- מספק ביטחון חיזוי להקדמת תוכניות של תרכובות נוירו-אקטיביות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מדדים כמותיים הדירים לשחרור שלשיתים בתרביות נוירונים ראשוניות.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך השוואה בין סינפסים שעברו טרנספקציה לבין סינפסים של בקרה.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה של השפעות תרכובות או התערבויות גנטיות על קצבי אקסוציטוזה.
- מכין מערכות מvתוקפות לסריקה עוקבת של מודולטורים סינפטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם בדיקות לתפקוד סינפטי במערכות in vitro עם מודלים נוירונליים הרלוונטיים למחלה.
- מספק רצף מהגילוי המכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות סינפטיות.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של מועמדים לטיפולים נוירו-תרפויטיים בהתבסס על קריאות תפקודיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
מדידת אקסוציטוזה מבוססת צבע FM משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים לבין תיקוף תרגומי במערכות נוירונליות.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת את שחרור שלפוסיות סינפטיות כדי לבחון השערות על מנגנוני תמסורת עצבית.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור עבור סריקת תרכובות או סריקה גנטית בתרביות עצביות.
- אנליטיקה: מספק מדידות קינטיות מבוססות פלואורסצנציה להשוואה סטטיסטית חסונה של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר תפקוד סינפטי in vitro לפנוטיפים רלוונטיים למחלה במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכה של התערבויות נוירו-אקטיביות מגוונות לאורך תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים סינפטיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והרחבת קנה מידה של בדיקות אקסוציטוזה כמותיות לצורך השוואה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון בתיקי ניסויים בביולוגיה של מערכת העצבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של תרכובות נוירו-אקטיביות ויעדים גנטיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות נוירונים ובדימות פלואורסצנציה של תאים חיים.
- נדרשת גישה למיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך ולתאי פרפוזיה ייעודיים.
- נדרשים פרוטוקולי שטיפה וגירוי קפדניים להבטחת הדירות של המדידה.
- יש להתאים את קצבי הזרימה ומשכי השטיפה כדי למקסם את הסרת הצבע ואת ספציפיות האות.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות פוטנציאלית בגירוי החשמלי וביעילות ספיגת הצבע.
