Name: Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למדו כיצד לסמן RNA אנטי-סנס מתאי HeLa נגועים בנגיף Vaccinia באמצעות צימוד אמינו-אליל של צבעים. שיטה זו מאפשרת הכנת דגימות להיברידיזציית מערך DNA וניתוח ביטוי גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

וייטהד במכון עמיתי קרנות

חלק 1: ארנה תיוג: צימוד allyl אמינו של צבעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1μg של דגימות ארנה לתוך צינורות microcentrifuge 1.5mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק יבש דגימות על אש נמוכה או לא עד שהם יבשים לחלוטין. שווי כל צינור ברגע שהוא יבש - לא overdry! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ צימוד 9μl אל צינור כל resuspend ארנה ידי בעדינות vortexing דקה 1. צנטריפוגה בקצרה לאסוף את דגימת בתחתית של התחתית, ואחר כך לתת המדגם לשבת על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 22μl DMSO איכות גבוהה של כל שפופרת צבע Cy3 או Cy5. שפופרת אחת של צבע מספיק 2 דגימות. לצבוע Cy3 היא תיוג דגימות לעיונך, ואת צבע Cy5 היא תיוג דגימות הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צבעים לערבב היטב. שמור את צבעי בחושך עד מוכן לשימוש. אין להכין צבע מוקדם יותר מאשר 1 שעה לפני השימוש. ודא מים לא נכנס לערבב צבע / DMSO בכל נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 11μl של צבע DMSO / סיי מוכן מדגם זה. מערבבים היטב על ידי vortexing בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30-45 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את דגימות עם נייר כסף או לשמור אותם במגירה כדי למזער את החשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, מוסיפים 4.5μl hydroxlyamine לטעום כל להרוות את התגובה. מערבבים היטב על ידי vortexing בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לעוד 15 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את דגימות עם נייר כסף או לשמור אותם במגירה כדי למזער את החשיפה לאור. </li></ol> חלק 2: תווית ארנה לנקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס החרוזים RNA מחייב בקצרה להשיג תערובת אפילו לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת ארנה איגוד בטמפרטורת החדר. (לוח 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquote הצפת elution ארנה לתוך צינור דגירה 1.5mL ועל 50-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 70μl של תמהיל ארנה מחייב כל דגימה ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות הצלחת PCR לצלחת מסביב לתחתית 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl של 100% isopropanol לטעום כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הצלחת על שייקר מסלולית לפחות 2 דקות לערבב ביסודיות את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. השאירו את הצלחת על דוכן העדים עד שהתערובת הופכת שקופה חרוזי מחייב יש pelleted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant. Supernatant צריך להיות או ורוד בהיר או כחול בהיר, בשלב זה, בשל מולקולות צבען מאוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מדוכן מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μl פתרון ארנה שטפי זה טוב לטלטל את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות בינונית. חרוזים לא יכול לפזר באופן מלא בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מדוכן מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף זמן 2 nd עם פתרון לשטוף ארנה 100μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף 2 nd, לייבש את החרוזים על ידי רועדת את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות המקסימלית. אל overdry דגימות! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute ארנה מן החרוזים ידי הוספת מאגר 20μl שחומם מראש ארנה elution לטעום כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף ללחוץ את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 3 דקות, ואז לבדוק כדי לוודא חרוזים מגנטיים מפוזרים באופן מלא. אם לא, ממשיכים לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חרוזים מגנטיים התפזרו לגמרי, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. Supernatant מכיל את ניקה, דגימות ארנה שכותרתו, וצריך להיות או ורוד חיוור או כחול חיוור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת ארנה eluted לצלחת PCR חדש (או צינורות PCR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (שלב אופציונאלי) בדוק את ריכוז RNA ואת כמות הצבע בדגימות ידי מדידת 1.5μl על ספקטרופוטומטר NanoDrop באמצעות מודול microarray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להכליא ארנה שכותרתו על גבי פלטפורמת microarray של הבחירה שלך, או לחילופין, ניתן לאחסן את ארנה שכותרתו ב -80 ° C עד שאתה מוכן הכלאה. </li></ol> טבלה 1 ארנה איגוד Mix <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> סכום עבור תגובה 1 </td></tr><tr><td> RNA חרוזים עקידת * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> הפתרון ביד Resuspension * </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100% isopropanol ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> ארנה תתרכז הצפת הכבילה </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> * מערבבים את החרוזים RNA מחייב עםחרוז פתרון resuspension first ** מוסיפים את isopropanol ומערבבים היטב לפני הוספת להתרכז חיץ מחייב ארנה.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

קריטי שלבים בעת ביצוע צימוד allyl אמינו, זה הוא קריטי resuspend לצבוע ב DMSO זמן קצר (פחות מ 1 שעה) לפני צימוד ולהבטיח מים לא נכנס לערבב צבע / DMSO, כפי שהוא יגיב עם קבוצת פעילים על הצבע. אל overdry רנ&quot;א (יכול להיות מיובש עד 1-2uL ולא יבש לגמרי), ואת resuspend היטב למאגר צימוד. במהלך תגובת צימוד, לשמור את התגובה בחושך, עם מצליף מדי פעם ספין למטה אם תרצה בכך. <p class="jove_title" style=";text-align:right;d...

<table><tbody><tr><td>ערכה של צבעים רקוטיביים לסימון לאחר התגובה CyDye</td><td>ריאגנט</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>מכילה צבעים מסוג Cy3 ו-Cy5</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>אחר</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>או ספקטרופוטומטר שווה ערך</td></tr></tbody></table>

vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

המשפחה<em&gt; Poxviridae</em&gt; מורכב גדילי הדנ&quot;א הכפול גדולים המכילים וירוסים לשכפל אך ורק בציטופלסמה של תאים נגועים. חברי<em&gt; Orthopox</em&gt; הסוג כולל אבעבועות, הסוכן סיבתי של אבעבועות קטנות האדם, הקוף, ואת vaccinia (VAC), חבר prototypic משפחת וירוסים. בתוך גדולות יחסית (~ 200 kb) vaccinia הגנום, שלוש כיתות של גנים המקודדים: מוקדם, ביניים מאוחר. בעוד כל שלוש כיתות מתועתקים ידי virally בקידוד polymerases RNA, כל שיעור מהווה פונקציה שונה במחזור החיים של הנגיף. Poxviruses לנצל אסטרטגיות מרובים עבור אפנון של הסביבה המארחת הסלולר במהלך ההדבקה. כדי להבין את הרגולציה של המארח וגם גן ביטוי וירוס, יש לנו מנוצל הגנום כולו גישות לנתח שפע תמליל מנגיף וגם התאים המארחים. הנה, אנחנו מדגימים כמובן זמן זיהומים של תאים הלה בווירוס Vaccinia ו-RNA הדגימה במספר נקודות זמן לאחר הפגיעה. מארח שני ו-RNA ויראלי הכולל מופרד מוגבר של הכלאה כדי microarrays עבור ניתוח של ביטוי גנים.

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 3 מתאר את תהליך fluorescently תיוג RNA מוגבר מן המארח והן דגימות ויראלי באמצעות צימוד allyl אמינו של צבעים. חלק 3 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

משפחת ה-Poxviridae מורכבת מנגיפים גדולים המכילים DNA דו-גדילי המשכפלים את עצמם באופן בלעדי בציטופלזמה של תאים נגועים. חברים ב...

שלום, אני ג'ודי Y מהמעבדה של קייט רובינס במכון וייטהד למחקר ביו-רפואי. כאן אנו מדגימים כיצד לסמן דגימות של RNA antisense שנאספו הן מתאי hela שנדבקו לנגיף הווקסיניה והן מהנגיף עצמו, באמצעות צימוד של צבעים בשיטת amino allyl LE. לאחר מכן, נראה כיצד לנקות את ה-RNA המסומן ולהכינו אותו להיברידיזציה לצורך ניתוח ביטוי גנים במערך זעיר (microarray).סרטוני JoVE קודמים מדגימים כיצד לבצע את שלבי ההדבקה הוויראלית, בידוד ה-RNA הכולל וההגברה של ה-RNA. לכן, בואו נתחיל. כדי להתחיל בסימון ה-RNA, ראשית העבירו 1 µg של דגימות RNA לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL.ייבשו את הדגימות בוואקום בחום נמוך או ללא חום עד שיהיו יבשות לחלוטין. סגרו כל מבחנה עם פקק מיד עם התייבשותה. חשוב להימנע מייבוש יתר של הדגימות לאחר שהתייבשו.הוסיפו תשעה מיקרוליטרים של תמיסת חיבור (coupling buffer) לכל מבחנה וערבבו מחדש את ה-A RNA באמצעות וורטקס עדין למשך דקה אחת; סובבו במערך צנטריפוגה לזמן קצר כדי לרכז את הדגימה בתחתית המבחנה ולאחר מכן השאירו את הדגימה על קרח. בשלב הבא, הוסיפו 22 מיקרוליטרים של DMSO באיכות גבוהה לכל מבחנה של צבע SCI 3 או S5; מבחנה אחת של צבע מספיקה לשתי דגימות. צבעי ה-SCI 3 משמשים לסימון דגימות הייחוס שלכם, וצבע ה-SCI 5 משמש לסימון דגימות הבדיקה שלכם.ערבבו את הצבעים במכשיר Vortex לעירבוב יסודי. זכרו לשמור את ה

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 1 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 2 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

וירוסים oncolytic הם מבטיחים סרטן ותרופות. היכולת לוודא את infectability של דגימות רקמה חיה המתקבל חולים לפני הטיפול הוא יתרון ייחודי של גישה זו הטיפולי. פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך רקמות...

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

שיטה של ​​התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

ICP0 עובר טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. מנגנון מולקולרי של אירוע זה אינו ידוע. כאן נתאר את השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ככלי לכמת ICP0 בתנועת זיהום HSV-1, אשר מניחה את היסודות לניתוח באופן כמותי ICP0 רוברטסונית במחקרים מכניסטית בעתיד.

ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

למדו כיצד לסמן RNA אנטי-סנס מתאי HeLa נגועים בנגיף Vaccinia באמצעות צימוד אמינו-אליל של צבעים. שיטה זו מאפשרת הכנת דגימות להיברידיזציית מערך DNA וניתוח ביטוי גנים.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

גלה סרטונים נוספים