לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

בפועל, מה שאעשה הוא להרכיב זאת כאן תחילה ולאחר מכן להחליף אתכם. כעת אבצע שאיבה תוך ניסיון להיות עדין ככל האפשר. אוקיי. מספר שניות של החזקה. אוקיי. בסדר.

המאפיינים החשובים של רשת הדמיות הסגנונית (lifestyle imaging grid) שלנו הם, ראשית, שמדובר במיקרוסקופ הפוך, מה שאומר שהעדשה, הדגימות כאן בעדשה, נמצאות למטה. לכן, העדשה מופנית כלפי מעלה וכל המיקרוסקופ, או למעשה כמעט כל המיקרוסקופ, כולל העדשות והדגימה, נמצאים בטמפרטורה של 37 degrees. לכן, כל מה שנמצא בתוך הקופסה מפלסטיק זו הוא בטמפרטורה של 37 degrees.

וממש מעל הבמה יש לנו תערובת של אוויר ו-CO2. מדובר ב-5%CO2. הרעיון הוא שהדגימה נמצאת למעשה בתוך תא, בדומה לאינקובטור תאים.

כך שזהו מערבל האוויר וה-CO2 שלנו, והוא עובר הלחלה וחימום ואז מועבר בצינור אל הדגימה שעל הבמה. אוקיי. והיום נבצע פלואורסצנציה בערוץ אחד, פלואורסצנציית GFP. זהו הצינור שדרכו נכנס ה-CO2, 5% CO2, והוא פשוט נכנס למחזיק של הבמה.

זה חשוב. לאחר מכן נוכל לסגור אותם, להוריד אותם, ואז נעבור לעמדה הראשונה. מה שאעשה הוא לגשת לשדה הראשון, שהוא מדגם הבקרה שלי, ואבחר עמדות בהתבסס על מה שאני רואה על המסך.

לכן אני מוודא שאני אכן מביט במיקרוסקופ בכל באר חדשה, מכיוון שמישור המיקוד של כל אחת מהבארים שונה, והצלחת אינה שטוחה לחלוטין בתחתיתה. לכן תצטרכו לבצע כיונונים עדינים בעת המעבר מבאר לבאר. כעת אני נמצא בבאר הראשונה, מה שאעשה הוא להתמקד, אז פשוט הדלקתי את התאורה, את התאורה המועברת של המיקרוסקופ.

ואני מוודא שכל האור מגיע לעיניות. לכן אני פשוט מביט פנימה כדי לוודא שאני מקבל שדה ראייה נקי וברור. לאחר מכן, אני מכבה את האור הזה, מדליק את תאורת הפלואורסצנציה, ומוודא שהתאים שאני בוחן נראים בריאים ושאינם אפופטוטיים.

ואז, אני מכבה את זה. מה שאני עושה כעת הוא לשלוח, כך שעכשיו אתחיל לבחור מיקומים, מה שאומר שאני צריך להפנות את נתיב האור למצלמה. זו המצלמה כאן.

כעת אני מגדיר למיקרוסקופ להעביר את כל האות למצלמה, כך שלא ניתן לראות דבר דרך העדשות. בתוכנה השולטת במיקרוסקופ, אבחר את מערכת המסננים המתאימה, שבמקרה שלנו היא psy, ולאחר מכן אקבע את זמן החשיפה.

ואני מכירה את התאים הללו היטב ויודעת שזמן חשיפה של 0.2 שניות מתאים להם. לכן, זהו הערך שאזין לתוכנה. לאחר מכן, אלחץ על focus.

זהו המצב, ובעיקר זה פשוט חי. אור יידלק ואתה תוכל, הו, אני לא יודע אם ניתן לראות תאים, אך הסיבה שזהו שדה טוב היא שכל התאים, אפילו במונחים של הפלואורסצנציה שלהם, אינם תאים אפופטוטיים. תאים אפופטוטיים נוטים להיות בהירים מאוד, ואין לכלוך או שאריות בשדה.

ניתן לראות שהם למעשה, זהו תא בשלב המטפאזה וזהו תא בשלב המטפאזה, וזהו תא שכנראה רק סיים את המיטוזה. אני יכול לקבוע זאת מכיוון שנראה ששתי קבוצות הכרומטין הללו מכוונות זו לזו בצורה יפה מאוד, כאילו הן רק יצאו משלב האנפאזה.

אז זהו שדה טוב. כעת, לאחר שאני יודע שזמן החשיפה ומערכת המסננים נכונים, וזה יהיה תלוי בתוכנה, אני אגדיר מיקומים וכעת התוכנה זכרה את מיקומי ה-X, Y, Z של השדה הזה. וכשבחר שדה נוסף, אני אעשה זאת, כך שכאשר אני בוחר שדות חדשים, אך באותה באר, אני אפתח את התריס, אסתכל על מה שאני רואה על המסך ואבחר שדות על בסיס זה, במקום להסתכל ישירות בשדה.

אני לא רואה שם אף אחד מהטוניקים שלי. אך שוב, גם אם הן ממורכזות היטב, התאים הללו יעברו דרך ה-PS שלי, אני ממשיך, הנה דוגמה טובה. הנה דוגמה טובה לדבר שהייתי נמנע ממנו, ראו כמה זה בהיר?

זה בהיר מאוד. אלו כנראה שאריות של תא אפופטוטי. והסיבה שאמנע מכך היא שבגלל שהאזור כל כך בהיר, כאשר התוכנה תבצע מיקוד אוטומטי, היא תתמקד רק בו והוא לא יהיה באותו מישור של שאר התאים הללו.

ולכן לא אקבל שום מידע מהשדה הזה. זה נראה טוב. יש כאן, זוהי פרו-מטאפאזה ממש כאן, וזוהי מטאפאזה.

אם כך, אבצע שלוש דגימות לכל באר. אלו הן שלוש נקודות, וכעת אעבור לבאר הבאה. לכן, מה שאעשה ככל הנראה הוא לצלם תמונות בכל 10 דקות. זוהי פשרה.

דימוי בסגנון חי (Lifestyle imaging) הוא תמיד פשרה, נכון? עליכם לבצע דימוי, אך עליכם לשמור על התאים בריאים, במיוחד אם אתם מתעניינים במיטוזה. לכן, עליכם למזער את חשיפתם לקו הפלואורסצנט.

ובנוסף, מכיוון שאתם רוצים להשיג מידע, עליכם לצלם תמונות, ולכן עליכם להתפשר ולבחור איזה מידע תרצו לתעד. למטרותינו, תהליך המיטוזה נמשך בדרך כלל כשעה.

לכן, אם נבחר במרווחי זמן של 10 דקות, זה די טוב. אנו רואים את הפרופאזה, המטאפאזה והאנאפאזה, ויכולים לראות כאשר ישנם טיפולים, תרופות או siRNAs המשפיעים על שלבים ספציפיים אלה של מחזור התא. למטרותינו זה מספיק, אך אנו תמיד שואפים ליותר.

אנחנו תמיד רוצים יותר מיקומים או רזולוציית זמן ומרווחים מדויקת יותר, או משהו כזה. לכן מדובר בפשרה. כך, ולאחר מכן אלחץ על התחלה.

כך שהתוכנה שלנו מבצעת סבב מיקוד אוטומטי בשלב הראשון. לכן, ברגע אלחץ על התחל, היא תתחיל במיקוד אוטומטי ותראו את התריס נפתח ונסגר בין פעולות המיקוד האוטומטי. לכן, אלחץ על התחל.

כך פועל פתיחת וסגירת התריס. מנוע ה-Z נכנס לפעולה ומנסה למעשה למצוא את המישור עם הניגודיות הגבוהה ביותר, שיהיה המישור הממוקד ביותר. ניתן לראות על המסך את התהליך של כניסה ויציאה מחיפוש מישור המיקוד האופטימלי, דבר שעלול לעורר דאגה.

התהליך עובד כך שהמערכת מניעה את מנוע ה-Z כדי למצוא את המישור בעל הפוקוס המיטבי, כלומר את המישור שבו התמונה חדה ביותר. לאחר מכן היא מצלמת תמונה במישור זה ושומרת את מיקום ה-Z. מיקום Z זה ישמש עבור 12 המעברים הבאים.

ואז נבצע שוב את מעבר המיקוד האוטומטי. אילו סוגי ניסויים הם עורכים? אוקיי, כך שמעבדה שלנו מעניינת בעיקר בהבנה של מה מווסת את ההתקדמות המיטוטית, או לפחות אני הכי מעוניין להבין את זה.

באמצעות דימוי תאים חיים, ובמיוחד באמצעות מיקרוסקופ הדימוי רב-מיקומי לטווח ארוך שלנו, ניתן להקליט תאים במשך יומיים או שלושה בעודם נכנסים ויוצאים ממיטוזה, ולדמות מספר סבבים של מיטוזה כדי להבין את התהליך. לאחר מכן, ניתן להוסיף תרופות, RNA או כל סוג של הפרעה לתאים שברצונכם לחקור, ובכך להבין כיצד תרופות אלו או גנים אלו חשובים בבקרת ההתקדמות המיטוטית.

מכיוון שלא מדובר בעבודה עם תאים מקובעים אלא בעבודה עם תאים חיים, ניתן להבין מה קורה, ומתי יש צורך לבצע הפרעה כדי להשפיע על המיטוזה או איזה שלב של המיטוזה מושפע. לכן, זו שיטה עוצמתית מאוד בהיבט זה. מהם האלמנטים הטכניים העיקריים של ניסויים אלו?

מהן הבעיות האפשריות? ובכן, הבעיה הגדולה ביותר, מלבד הגדרת המערך – שהגדרת המערך אינה פעולה טריוויאלית – היא שרבים מחזיקים במערך, אך עליהם להבטיח שהוא אכן פועל היטב עבור היישום הספציפי שלהם.

המרכיב הכלכלי אינו, אתם יודעים, אינו זניח. לכן, ישנה ההקמה של המכשור ואז, לאחר איסוף הנתונים, עולה בעיה ממשית של ניתוח נתונים. הדבר דורש צפייה בסרטים הללו; אם, למשל, אתם אוספים 40 סרטים שבכל אחד מהם יש 30 תאים, כך שיש לכם 40 שדות צילום שפשוט צילמתם ובכל אחד מהשדות הללו יש 30 תאים, אז עליכם לשבת עם כל אחד מהסרטים הללו ולבחון כל אחד מהתאים באותו סרט.

לכן, ניתוח הנתונים אורך זמן רב מאוד. כך שזה לוקח שבוע לנתח נתונים שארכו יומיים לאסוף. זהו מכשול משמעותי מאוד בכל הנוגע לאיסוף כמויות גדולות של נתונים.

אשר על כן, למרות שמדובר באיסוף נתונים בספיקה גבוהה, אין מדובר בניתוח נתונים בספיקה גבוהה. מה הייתם עושים כדי להפוך את הניסוי הזה לספיקה גבוהה באמת? המעבדה שלנו נמצאת בתהליך של פיתוח תוכנית המבצעת את ניתוח הנתונים באופן אוטומטי.

וזו תוכנה די טובה. היא לא מושלמת. העין האנושית תמיד עדיפה, אך היא הולכת ומצליחה להתקרב לרמה זו.

אם כן, מהן היישומים המעניינים של ניסוי זה? אולי תוכל להזכיר תחומים אחרים? מלבד חלוקת תאים?

אתה מתכוון ל-, אה, לדימיון תאים חיים? כן. ובכן, ניתן לבצע בדיקות ניידות תאים. ניתן, בתלות במיקרוסקופיה המעורבת, לבחון כיצד תאים, תוכל לבחון התפתחות גידולים אם תרצה בכך מאוד.

אך שם, אם יש לכם את מערך ההדמיה הנכון, אתם כמעט לא מוגבלים בשום היבט. המיקרוסקופ שלנו הוא בעל שדה ראייה רחב ואנו משתמשים בעדשת אובייקטיב של 20x. לפיכך, מדובר במערך בעל רזולוציה נמוכה למדי, אך היא מספיקה עבור מה שאנו צריכים לראות.

אז יש כאלה, אבל בהחלט אין הגבלה, לא תהיו מוגבלים. כל דבר הכולל ניסוי דינמי כלשהו, כגון ביולוגיה, באמת יפיק תועלת מדימיון תאים חיים. לדוגמה, דימיון סידן, למרות שלא ניתן לבצע אותו במכשור שלנו, הוא דימיון של תא חי.

אתה בהחלט זקוק לדימות תאים חיים עבור זה. כפי שציינתי, בדיקות של מטופלים, בדיקות ניידות, ודברים מסוג זה יפיקו תועלת רבה מדימות תאים חיים. האם תרצה לספר כמה מילים על ניסיונך הקודם?

כמה זמן אתם עובדים על הטכניקות הללו? על מה עבדתם לפני כן? וואו. אז במהלך הדוקטורט שלי לא עבדתי.

ביצעתי מיקרוסקופיה קונפוקלית רבה, אך לא דימות חי (live imaging). לכן, במהלך הפוסט-דוקטורט שלי, עזרתי לד"ר King להשיג את המכשיר הזה, שבו השתמשנו כדי להקים את הפסיגות הללו ולהפעיל אותן. כך שבעת הפוסט-דוקטורט, רכשתי ניסיון רב הן במיקרוסקופיה בשדה רחב (widefield) עם דימוי פרללה בזמן (TimeLapse) במיקרוסקופ שלנו, שהוא מיקרוסקופ בשדה רחב, והן בדימוי פרללה בזמן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

הייתי אומר שזה כלי עוצמתי מאוד. מקבלים ממנו מידע רב, אך לא פשוט לגרום לו לעבוד בצורה מושלמת. לכן, הדבר דורש תשומת לב רבה ודייקנות רבה בכל שלב קטן בתהליך.

ועדיין עשויות להופיע בעיות. לכן זוהי יישום מאתגר, אך אם זהו הכלי הדרוש לכם כדי לחקור את הבעיה המדעית שלכם, הרי שהוא יקר מפז בהיבט זה, למרות המורכבות. לכן, מצאו מישהו שמכיר את התחום ושימו אותו לטובתכם.

זוהה הייעוץ שלי. מצוין.