חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal
1 באפריל 2009
בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.
הליך זה מתחיל בהזרקה של עובר דג זברה חד-תא הממוקם בתוך תבנית הזרקה כך שהתא מכוון כשהוא פונה הרחק ממכשיר ההזרקה. העוברים מוזרקים אז ב-MRNA כאשר המחט נעה דרך החלמון ונכנסת לתא. למחרת.
מחסנית פלסטיק להתקנה מלאה ב-aros. עובר מורדם מונח לאחר מכן הפוך בחור ב-aros בתמונה במיקרוסקופיה קונפוקלית. שלום, אני גרבהאם מהמעבדה של ד"ר הייזל סיב במכון וייטהד למחקר ביו-רפואי ומהמחלקה לביולוגיה ב-MIT.
היום נציג לכם הליך להזרקת עוברי דגי זברה בשלב התא היחיד והדמיה חיה של המוח במיקרוסקופיה קונפוקלית. במעבדה שלנו אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור מורפוגנזה מוחית של חולייתנים ברזולוציה של תא יחיד. אז בואו נתחיל.
ה-mRNA המשמש בתהליך זה מתועתק מפלסמיד המקודד C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A קשור לממברנה GFP. ראשית, ליניאריזציה של הפלסמיד באמצעות עיכול לא עם אף אחד, ואז מתמלל את mRNA GFP של ממברנה מהפלסמיד הלינארי באמצעות ההודעה M וערכת המכונה לאחר שהעתק את ה-mRNA, תוך כמת מדלל ה-mRNA והמים למיקרוגרם אחד למיקרוליטר אחד, Eloqua, ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שצריך. ביום שלפני ההזרקה הקימו כלובי הזדווגות, והפרדו בין הזכרים לנקבות ביום ההזרקה. השתמש במכשיר מייתור מיקרופיפט פולרי כדי למשוך מחטים קפילריות להזרקה.
הכינו תבנית הזרקה של ורד 1%AGA עם נתיבים ברוחב העוברים בשלב התא היחיד ביום ההזרקה, הפשרה של mRNA GFP ממברנה בריכוז של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר על קרח. מדלל את ה-mRNA אחד עד חמש במים לריכוז סופי של 200 ננוגרם למיקרוליטר ושמור על הקרח. העמיס את המחט הקפילרית במיקרוליטר אחד של ממברנה מוכנה, mRNA GFP ב-200 ננוגרם למיקרוליטר.
כאן מוסיפים 0.05% פנול אדום ל-mRNA כדי להפוך אותו לגלוי להזרקות. הכניסו את המחט הטעונה לתוך מיקרו-מניפולטור שמחובר למיקרו-מזרק המופעל בגז. כוון את נפח ההזרקה לננוליטר אחד.
לאחר מכן, משוך את המחיצות של דגי הבר שהוצבו בכלובי הזדווגות מהיום הקודם. לאסוף את העוברים מיד לאחר שהם מוטלים. מלאו את תבנית הזרקת הוורדים של AGA במדיום עובר ומכוונים את העוברים בתוך התבנית עם תא יחיד בצד הרחק מהמיקרו-מניפולטור.
הזריקו דרך הקוריון והחלמונים כך שה-mRNA יופקד ישירות לתא היחיד. הזריקו כ-50 עוברים בכל ניסוי. עם זאת, אם התא התפצל, אין להזריק לאחר שהעוברים הוזרקו, אלא דגרו אותם בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במהלך הלילה במדיום העובר.
לאחר הדגירה הלילית, העוברים שהוזרקו מוכנים להרכבה ולהדמיה. כדי להתחיל את ההליך, הסרת הקוריון מהעוברים באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ סטריאו שעה לפני נקודת העניין, הכינו שקופית להרכבה של עד ארבעה עוברים. אחר כך תמלא את הסלייד ב-0.7% ארו רק עד למעלה של הסלייד ותמתין בערך 20 דקות או עד שהארוס יתקשה.
לאחר שה-aros התקשה, יש ליצור חור קטן ב-Aeros באמצעות קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר כדי ליצור חורים גליליים להרכבת כל עובר. הסר את הפלאגים הארוס עם מלקחיים לפני ההרכבה. הנח את העוברים על המחסנית המלאה ב-Aeros תחת מיקרוסקופ ניתוח.
הוסף 50 מיקרוליטר של טריקה להרדמה. העוברים. השתמשו במלקחיים כדי לכוון את העוברים הפוכים בחורים הצילינדריים ב-AROS עם המוח או האזור המעניין מול כיסוי הכיסוי התחתון.
העוברים ב-AGA התרוממו עם כיסוי נוסף ומאובטחים עם גריז ואקום סיליקון. העוברים מוכנים כעת להדמיה. דמיינו את העובר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר פלואורסצנטי הפוך כפי שמוצג כאן, או תמונת מיקרוסקופ קונפוקלי דיסקי מסתובב ב-63x ומעלה כדי לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים בתוך האפיתל העצבי.
התמונות מיוצאות כקבצי TIF מתוכנת LSM ומנותחות באמצעות פוטושופ. זוהי תמונה קונפוקלית מייצגת של עובר דג זברה בן 24 שעות, נוירו-אפיתל בין חדרי המוח האמצעי לחדר המוח האחורי. M מציין את המוח האמצעי, החדר ו-H מציין את החדר האחורי.
כל תא מסומן ב-GFPE הקשור בממברנה. הרגע הדגמנו טכניקה שמאפשרת לנתח את מוח דג הזברה המתפתח כרזולציה תאית יחידה. טכניקה זו אפשרה לנו לחקור סוג חדש של שינוי צורת תא הנקרא כיווץ בסיסי BA.
ניתן להשתמש בו גם לניתוח סוגים אחרים של תופעות ולהרחבת ההבנה שלנו לגבי אורגנוגנזה של חוליות, כמו גם את הביולוגיה התאית הבסיסית שלה. אז זהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
הסרטון הזה מדגים שיטה לניתוח התפתחות המוח של חולייתנים בעובריהם של דגי זברה חיים ברזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. התהליך כולל הזרקת עוברי דגי זברה ולאחר מכן הרכבה והדמיה של המוח המתפתח.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- טכניקות הדמיה
רקע
- דגי זברה הם אורגניזם מודלי לחקר התפתחות חולייתנים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמות חיות.
- ניתוח ברמת תא יחיד מספק תובנות לגבי התפתחות והתמיינות תאית.
- שיטה זו יכולה לשמש למחקרים שונים בביולוגיה התפתחותית.
מטרת המחקר
- לדמות את המוח המתפתח בעובריהם של דגי זברה.
- להדגים טכניקה להדמיה ברזולוציה של תא יחיד.
- לשפר את ההבנה של התפתחות המוח של חולייתנים.
שיטות ששימשו
- הזרקת mRNA לעוברי זברה חד-תאיים.
- שימוש בשקופית הרכבה מפלסטיק להדמיה.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיה ברזולוציה גבוהה.
- מיקום עוברים בתבנית הזרקה לצורך אוריינטציה אופטימלית.
תוצאות עיקריות
- הזרקה מוצלחת של mRNA לעוברי זברה.
- השגת תמונות ברזולוציה גבוהה של המוח המתפתח.
- הוכחת היתכנות של טכניקות הדמיה חיות.
- תובנות על התנהגות תאית במהלך התפתחות מוקדמת.
מסקנות
- השיטה מאפשרת תצפית מפורטת על התפתחות המוח בדגי זברה.
- ניתן להשיג הדמיה ברזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- שיטה זו יכולה לשמש למחקרים נוספים בנוירוביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Live imaging of the zebrafish embryonic brain enables high-resolution visualization of cellular dynamics during neural tube morphogenesis, providing a disease-relevant system for studying vertebrate brain development. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by allowing direct observation of cell shape changes and rearrangements critical to organogenesis. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking subcellular behaviors to structural outcomes in a transparent, genetically tractable system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of membrane-bound protein dynamics in developing neuroepithelium.
- Operational Value: Supports biological de-risking by linking cytoskeletal mechanisms to tissue-level morphogenetic events.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline morphogenetic benchmarks.
- Operational Value: Promotes assay standardization through reproducible embryo mounting and inversion protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system alignment by capturing conserved mechanisms of vertebrate brain folding applicable to human neural tube defects.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment through quantifiable readouts of cell shape changes such as basal constriction.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing single-cell resolution data that informs target confidence prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time observation of cell behaviors in intact tissues.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized production of fluorescently labeled embryos suitable for time-lapse analysis.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via fluorescence intensity and spatial tracking of GFP-labeled membranes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling conserved morphogenetic processes across vertebrate species.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurodevelopmental screening due to embryo transparency and external development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in brain morphogenesis pathways.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized injection volumes, mounting orientation, and imaging parameters.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by enabling early detection of phenotypic anomalies in developing tissues.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by linking cellular phenotypes to structural outcomes in a high-fidelity model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques and embryonic staging.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure with 63x or higher objective capabilities.
- Necessitates standardization across teams for embryo handling, anesthesia timing, and mounting consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to other brain regions or developmental stages beyond 18–24 hpf.
- Limited by imaging depth of 80–100 μm, restricting analysis of deeper brain structures.
