Name: חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: למד שיטת הדמיה חיה של המוח המתפתח בעוברי דג זברה ברזולוציית תא בודד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת חקר מורפוגנזה של המוח החולייתני ב-Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה רבה ד&quot;ר ג&#39;ניפר Gutzman מי הראשון שפותח את הטכניקה הזו במעבדה אלימה. תודה גם JB גרין בבית דנה פרבר סרטן המכון בבוסטון, מסצ&#39;וסטס, אשר חביב סיפק את הקידוד פלסמיד CAAX-GFP-mRNA. הדמיה confocal נערך במתקן קק WM ביולוגית הדמיה הקרן ב וייטהד. HS נתמכת על ידי NIHMH70926. EG הוא נתמך על ידי מענק NSF מראש דוקטורט.

1. הכנת ה-mRNA עבור הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MRNA השתמשו בהליך זה הוא עיבד מ קידוד פלסמיד CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. ראשית linearize פלסמיד לפי Gutzman et al, 2008. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לתמלל mRNA memGFP באמצעות mMachine mMessage ערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ה-mRNA שנוצר 1μg/μl, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עובש הזרקת agarose של 1% עם נתיבים ברוחב של עוברים בשלב אחד את התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני ההזרקה, להקים כלובי ההזדווגות הפרדת הזכר מן הנקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הזריקה, למשוך מחטים נימי באמצעות חולץ micropipette להתכונן ההזרקה. </li></ol> 2. הזרקת ה-mRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הזריקה, להפשיר aliquot של mRNA memGFP 1μg/μl על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ה-mRNA 01:05 במים לריכוז סופי של 200ng/μl, ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המחט נימי עם 1μl של mRNA memGFP מוכן ב 200ng/μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טעון מחט לתוך micromanipulator מצורף בנזין microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת הזריקה כדי 1nl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את חוצצים על דגים סוג בר להגדיר בכלובים זיווג מן היום הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את העוברים ברגע שהם הניחו. אוריינט אותם עובש הזרקת agarose מכוסה על ידי בינוני העובר (Westerfield, 1995) עם תא בודד בצד הרחק micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק דרך סיסית ו חלמון כזה mRNA מופקד ישירות לתא בודד. להזריק כ 50 עוברים לכל ניסוי. אין להזריק אם התא חילק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים דגירה על 28 ° C במשך הלילה בינוני העובר </li></ol> 3. הרכבה ועוברים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את התמונה עוברי, להסיר את סיסית עם מלקחיים מן העוברים תחת stereomicroscope שעה אחת לפני נקודת הזמן של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שקופית עבור הרכבה עד 4 עוברים. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ואקום גריז סיליקון לאטום coverslip על החלק התחתון של שקופית 2 מ"מ בעובי במיוחד פלסטיק עם חור בקוטר של כ 1cm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החור שקופית עם agarose 0.7%, ולתת לעמוד כ -20 דקות או עד מוקשה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה, להסיר תוסף קטן בעזרת פיפטה 200μl טיפים ליצירת חורים גליליים שבו לעלות כל העובר. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בשקופית agarose המלא תחת מיקרוסקופ לנתח. הוסף 50μl של tricaine (Westerfield, 1995) כדי להרדים את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים לתפקיד עוברים את החורים גלילי ב agarose עם המוח או באזור של עניין נגד coverslip הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את העוברים על agarose עם coverslip נוסף מאובטח עם גריז סיליקון ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה העובר באמצעות הפוכה, פלורסנט, לייזר או סריקת דיסק ספינינג מיקרוסקופ confocal. תמונה ב 63x או יותר לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים בתוך neuroepithelium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות מיוצאים כקובצי TIFF מתוך התוכנה LSM ונותחו באמצעות Photoshop. </li></ol> 4. תוצאות נציג / תוצאה שמוצג באיור 1 היא תמונה confocal נציג neuroepithelium hpf 24 דג הזברה בין המוח התיכון, ואל החדרים למוח האחורי. כל תא מסומן עם GFP קרום הנכנס. <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> באיור 1. חיים הדמיה confocal של העובר memGFP-מוזרק hpf 24 דג הזברה. (א) Neuroepithelium של עובר 24 hpf עם כל תא שהותוו על ידי ה-GFP. אזור צילמו מפריד בין המוח התיכון ואת החדרים למוח האחורי (ז, ח, בהתאמה), ויצרו את הגבול המוח התיכון, למוח האחורי.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה הזרקת mRNA עוברי דג הזברה לתוך תא בודד. כאן, אנו משתמשים mRNA קידוד GFP קרום במיקוד לתייג כל תא. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד הר התמונה במוח המתפתח ברזולוציה של תא בודד. טכניקה זו אפשרה לנו ללמוד סוג חדש של שינוי צורת התא, ההתכווצות הבזליים, נדרש היווצרות גבול למוח האחורי, המוח התיכון (Gutzman et al, 2008). ניתוח דומה של תופעות אחרות יש פוטנציאל להרחיב באופן משמעותי את הבנתנו המורפוגנזה החולייתנים לבין ביולוגיה של התא הבסיסי.

<table><tbody><tr><td>SeaKem GTG agarose</td><td>ריאגנט</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>צינור נימי</td><td>כלי</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm</td></tr><tr><td>גריז סיליקון לוואקום</td><td>ריאגנט</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont #5 Bio Inox</td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה 1-200 &amp;mu;l</td><td>כלי</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>אלו הם הגדלים המתאימים לעוברים בני 24 hpf.</td></tr><tr><td>ערכת שעתוק mMessage mMachine</td><td>ריאגנט</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>SP6 RNA polymerase</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי סורק Zeiss LSM 510</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>כלי</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרואינז'קטור</td><td>כלי</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות</td><td>כלי</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השיטה במעבדה שלנו פיתחה לנתח את צורת התא שינויים rearrangements נדרש לכופף ולקפל את המוח דג הזברה מתפתח (Gutzman et al, 2008). ניתוח כזה מאפשר הבנה חדשה של ביולוגיה של התא הבסיסי הדרוש לפיתוח של מבנה 3D של המוח החוליות, מגביר באופן משמעותי את היכולת שלנו ללמוד המורפוגנזה בצינור העצבי. המוח העוברי היא בצורת דג הזברה החל הפריה 18 שעות שלאחר (hpf) כמו החדרים בתוך neuroepithelium לנפח. עד hpf 24, השלבים הראשונים של המורפוגנזה בצינור העצבי הושלמו. באמצעות השיטה המתוארת כאן, עוברים בשלב מסוים התא מוזרקים עם קידוד mRNA קרום במיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (memGFP). לאחר hpf הזרקת הדגירה, העובר, בין 18 ל 24 עכשיו, הוא רכוב, הפוך, ב agarose הדמיה על ידי מיקרוסקופיה confocal. יש לציין כי העובר דג הזברה שקוף שהופך אותו אידיאלי עבור מערכת דימות פלואורסצנטי. בעוד ניתוחים שלנו התמקדו גבול למוח האחורי, המוח התיכון לבין למוח האחורי, שיטה זו ניתן יהיה להרחיב לניתוח האזור כל דג הזברה עד לעומק של 8-10 מיקרומטר.

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

בסרטון זה, אנו מדגימים את השיטה שפיתה המעבדה שלנו לניתוח שינויי צורת התאים והסידורים מחדש הנדרשים כדי לכופף ולקפל את ה...

הליך זה מתחיל בהזרקה לעובר של דג זברה בשלב התא הבודד, הממוקם בתבנית הזרקה כך שהתא פונה הרחק ממכשיר ההזרקה. לאחר מכן מזריקים לעוברים mRNA, כאשר המחט נעה דרך החלמון אל תוך התא. למחרת.שקופית קיבוע מפלסטיק ממולאת ב-aros. לאחר מכן, עובר שהורדם מונח כשהוא הפוך בתוך חור ב-aros ומדוגם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שלום, אני גרהאם מהמעבדה של ד"ר הייזל סיב במכון וייטהד למחקר ביו-רפואי ובמחלקת הביולוגיה ב-MIT.היום נדגים בפניכם פרוצדורה להזרקה לעוברי דגי zebrafish בשלב התא הבודד, ולאחר מכן הדמיה חיה של המוח באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור מורפוגנזה של מוח חולייתנים ברזולוציה של תא בודד. בואו נתחיל.ה-mRNA המשמש בהליך זה מתומלל מפלסמיד המקודד ל-C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A membrane bound GFP. ראשית, בצעו לינאריזציה לפלסמיד באמצעות עיכול עם Not I, ולאחר מכן תמללו mRNA של membrane GFP מהפלסמיד הלינארי באמצעות ערכת M message mpeg. לאחר תמלול ה-mRNA, קבעו את הכמות, דללו את ה-mRNA שהתקבל במים לריכוז של 1 µg ל-1 µL, וקפיאו בטמפרטורה של 80°C- עד למועד השימוש. ביום שלפני ההזרקה, הכינו כלובים להרבייה, והפרידו את הזכרים מהנקבות ביום ההזרקה. השתמשו במכשיר setter micropipet puller למשיכת מחטי קפילריה עבור ההזרקה.הכינו תבנית הזרקה של 1% AGA rose עם נתיבים ברוחב העוברי

live-imaging-of-the-zebrafish-embryonic-brain-by-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית מוח שלם in vivo של דגי זברה זחלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת ממדי. הליך הניסוי כולל הכנת דגימה, רכישת תמונה והדמיה.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

למד שיטת הדמיה חיה של המוח המתפתח בעוברי דג זברה ברזולוציית תא בודד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת חקר מורפוגנזה של המוח החולייתני ב-Danio rerio.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

גלה סרטונים נוספים