החדר דג הזברה המוח Injection
6 באפריל 2009
לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium מכווץ קפלי תוך הצינור מתמלא הנוזל השדרתי עובריים (eCSF) כדי ליצור את החדרים במוח העוברי. פיתחנו טכניקה זו זריקה החדר כדי להמחיש טוב יותר את החלל מילא נוזל לעומת הצורה neuroepithelial בעובר חי.
הליך זה מתחיל בבימוי של עוברי דג הזברה. כאשר העוברים הגיעו לשלב העניין, הוציאו אותם מהקוריון. לאחר מכן נוצרים חורים בכלי מצופה ארוס עם קצה פיפטה להרכבת העוברים והעוברים מונחים בעדינות בחורים עם זנבותיהם כלפי מטה.
לאחר הרכבת העוברים, מוזרק בזהירות קובייה פלואורסצנטית לחלל החדר של העובר דרך המוח האחורי. לאחר הזרקת החדר, העוברים מצולמים והנתונים מעובדים באמצעות פוטושופ. היי, אני ג'ניפר גוטמן מהמעבדה של ד"ר הייזל סיב במכון ווייטהד למחקר ביו-רפואי ב-MIT בקיימברידג', מסצ'וסטס.
היום נראה לכם נוהל להזרקת חדר מוח של דג הזברה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור היווצרות חדרי מוח ומורפוגנזה נוירו-אפיתל בדג זברה חי. בשל אופיים של עוברי דג זברה שקופים, אפיון צורת חדר המוח יכול להיות קשה.
טכניקה זו היא דרך שימושית ופשוטה להבדיל בין החלל המלא בנוזל לבין הרקמה שמסביב ולאפיין עוברים מוטנטיים שעלולים להיות בעלי פגמים בהיווצרות חדרי המוח. אז בואו נתחיל. כדי להתכונן להזרקת חדר המוח של דג הזברה, אנו מתחילים בהכנת מחטי ההזרקה.
קוטבית המחט של מכשיר סאטר משמשת למשיכת המחטים הנימים. לאחר מכן ממלאים את המחט הנימים בצבע פלואורסצנטי, כגון דקסטרין אדום טקסס. לאחר מכן, המחט המלאה מותקנת במניפולטור מיקרו במנגנון מיקרו-הזרקה.
חותכים את המחט לגודל המתאים בזווית. ליצירת קצה משופע, מדוד את גודל הטיפה של המחט ובדוק שהיא בין ננוליטר אחד לשני ננוליטר להזרקת שמן. כדי להתחיל בשלב הליך זה, יש להזריק את העוברים, לדברי קימל בכל העוברים, 30 דקות מוקדם יותר משלב העניין.
לדוגמה, כדי לחקור את החדרים 24 שעות לאחר ההפריה יש להזריק את העוברים 23 וחצי שעות לאחר ההפריה. העובר בשלב העניין מונח מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, והקוריון מוסר בזהירות מהעובר באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, מכינים צלחת ארוס לעוברים באמצעות צלחת פלסטיק המצופה בחורי תקיעה של 1% ארוס בארוס עם קצה פיפט פלסטיק של 200 מיקרוליטר.
הסר בזהירות את פקקי הארוס מהחורים בעזרת מלקחיים. העבירו את העובר ואמצעי העובר לתוך צלחת הארוס עם חורים. הוסף טריקה למדיה כדי להרדים את העובר ולמנוע תנועה.
במהלך הניסוי, הנח בעדינות את זנב העובר לתוך החור וכוון אותו כך שמנגנון ההזרקה יהיה בצד האחורי של העובר. כעת, כשהעובר מונח ומכוון נכון בצלחת הקמה, אנו מוכנים להזרקת חדר המוח. ראשית, סדר את מערך המיקרו-מניפולציה כך שקצה המחט יהיה באותו שדה ראייה כמו העובר בעוצמה גבוהה.
הכניסו בזהירות את המחט דרך לוחית הגג הדקה של המוח האחורי ממש מאחורי נקודת הציר R אפס R מבלי לפגוע ברקמת המוח שמתחת, הזריקו מספיק צבע כדי למלא לחלוטין את החדרים. ייתכן שיידרשו מספר זריקות כדי למלא את חלל החדר בהתאם לשלב העובר. כאשר העובר הוזרק ומוכן להדמיה, מכינים צלחת ארוס חדשה לעובר.
בעזרת צלחת נקייה בציפוי 1% ארוס, חוררים חורים בכלי ומסירים את הפקקים. מעבירים את העובר לצלחת ומוסיפים טריקה כדי להרדים את העובר ולמנוע תנועה. הנח את זנב החדר המוזרק לתוך החור במקומו לתמונה גבית.
העובר מוכן כעת להדמיה. צלם תמונה באמצעות אור מועבר. זה מאוד קריטי לא להזיז את העובר או את המיקרוסקופ.
לאחר מכן, שנה את ההגדרות במיקרוסקופ וצלם תמונה עם אור פלורסנט. מקם מחדש את העובר כדי לצלם תמונות רוחביות עם אור מועבר ואור פלואורסצנטי. שמור את כל התמונות כקבצים לעיבוד תמונה של Photoshop.
כדי לעבד את התמונות בפוטושופ, פתח את תמונות האור המועבר והאור הפלואורסצנטי של אותו עובר שצולמו באותו מיקום. ודא שכל ההגדרות זהות עבור כל תמונה, גרור את תמונת הפלורסנט שלך אל תמונת האור המשודר ויישר אותן בדיוק עם התמונה הפלואורסצנטית שנבחרה. בחר התאמות תמונה ולאחר מכן החלף צבע ושנה את הרקע השחור ללבן.
בחלון החלפת צבע, כוונן את גורם הערפול ימינה עד שהתמונה הפלואורסצנטית תיראה אחידה בצבע. בחלון השכבות, בחר הכפל. כדי view תמונות שכבת-העל, תמונת חלל החדר שלך צריכה להתאים לתמונת האור המועבר. בדיוק.
שמור קובץ זה וחזור על הפעולה עבור כל תמונה אחרת. אם הזרקת החדר מתבצעת כהלכה, התמונות צריכות להיות בעלות קצוות חדים בצבע לא מפוזר כפי שמוצג כאן בתמונות אלה של 25 שעות. לאחר ההפריה בעוד פאנל עוברים מסוג A מציג את תמונת השדה הבהיר, לוח B מציג את תמונת הפלואורסצנט ופאנל C מציג את תמונת השכבה.
מבט רוחבי של תמונת הכיסוי מוצג בפאנל D.מצד שני, אם במהלך הזרקת החדר המחט מוחדרת רחוק מדי, היא תיכנס לרקמת המוח מתחת לחלל החדר ותוביל להזרקה שגויה. התוצאה היא צבע שנראה מחוץ לחלל החדר ובחלמון כפי שמוצג כאן. לוח E מציג את תמונת השדה הבהיר.
חלונית F מציגה את תמונת הפלואורסצנט וחלונית G מציגה את תמונת הכיסוי. מבט רוחבי של התמונה המונחת מוצג בפאנל H.החצים מציינים אזורים שבהם הצבע חרג מחלל חדר המוח. בסרטון הזה, הדגמנו כיצד להזריק צבע פלואורסצנטי לחדרי המוח המתפתחים של דג הזברה.
שיטה זו משמשת להמחשת חלל חדר המוח בניגוד לאפיתל הנוירולוגי שמסביב, והיא שימושית ביותר לקביעת צורת חלל החדר כמו גם צורת רקמת המוח שמסביב. טכניקה זו מאפשרת לנו להבין טוב יותר את תהליך היווצרות חדרי המוח והמורפוגנזה של המוח לאורך זמן בעובר החי. זהו כלי מצוין לחקר פגמים בהיווצרות חדרי המוח, ולאפיון ראשוני של מוטציות מורפוגנזה במוח.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה להזרקת חדרים בעובר של דג זברה על מנת לדמיין את החדרים במוח העובר. השיטה משפרת את ההבנה של צורת הנוירואפיתל ודינמיקת הנוזלים בעובר חי.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
רקע
- היווצרות הצינור העצבי היא תהליך קריטי בהתפתחות העוברית.
- נוזל המוח השדרה העוברית (eCSF) משחק תפקיד ביצירת החדרים במוח.
- דמיון של מבנים אלו בעובר חי יכול לספק תובנות לגבי תהליכי התפתחות.
- שיטת ההזרקה לחדרים מאפשרת הדמיה טובה יותר של מבנים אלו.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה להזרקת צבע פלואורסצנטי לחדרים של עוברי דג זברה.
- לשפר את הדמיה של החללים המלאים בנוזלים במוח העובר.
- לשפר את ההבנה של הדינמיקה הנוירואפיתלית במהלך ההתפתחות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- סטייג'ינג של עוברי דג זברה לשלב ההתפתחותי הרצוי.
- הרכבת עוברים בצלחת מצופה aros באמצעות קצות פיפטה.
- הזרקת צבע פלואורסצנטי לחלל החדר דרך המוח האחורי.
- הדמיית עוברים לאחר ההזרקה ועיבוד נתונים עם Photoshop.
תוצאות עיקריות
- שיטת ההזרקה לחדרים מדמיינת בהצלחה את החללים המלאים ב-eCSF.
- בעוברים הוצגה הדמיה ברורה של צורות נוירואפיתליות לאחר ההזרקה.
- השיטה מספקת גישה אמינה לחקר התפתחות המוח העוברית.
- טכניקות עיבוד נתונים משפרות את בהירות תוצאות ההדמיה.
מסקנות
- שיטת ההזרקה לחדרים יעילה להדמיה חיה של עוברי דג זברה.
- שיטה זו יכולה לשמש לחקר היבטים שונים של התפתחות עצבית.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול חקירת ההשפעות של שינויים גנטיים על התפתחות המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Visualizing fluid-filled cavities in live embryos supports mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation by clarifying structure-function relationships. This technique enables quantitative assessment of neuroepithelial dynamics, improving predictive confidence in early discovery. It aids in prioritizing genetic or pharmacological interventions based on phenotypic brain morphogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular morphology as a phenotypic readout for neuroepithelial shape changes.
- Operational Value: Provides a live-imaging compatible method to distinguish fluid spaces from tissue in transparent models.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking genetic perturbations to ventricular defects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fluorescent and brightfield outputs for comparative analysis across conditions.
- Quantitative Output: Facilitates measurement of ventricle size and shape as dependent variables in screening campaigns.
- Reproducibility: Enables consistent ventricular labeling for cross-experiment comparison in multiwell formats.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved vertebrate brain ventricle formation, relevant to human neurodevelopmental disorder studies.
- Translational Continuity: Connects early neuroepithelial patterning to later brain structure and function.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in distinguishing primary ventricular defects from secondary tissue abnormalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening requires structural validation of fluid-filled compartments in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of ventricle formation dynamics.
- Screening: Delivers assay-ready samples with quantifiable ventricular morphology for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Provides image-based morphometric outputs that can be statistically compared across experimental groups.
- Translational Research: Links embryonic ventricle phenotypes to potential postnatal neurological outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental target and pathway validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing phenotypic ambiguity in neurodevelopmental models.
- Operational Value: Standardizes ventricular labeling for reproducible imaging across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural phenotyping data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates based on brain morphogenesis safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microinjection techniques.
- Dependent on fluorescent dye compatibility and injection volume precision (1-2 nL).
- Necessitates standardized mounting and anesthesia protocols to prevent embryo movement during imaging.
- Requires image processing capability (e.g., Photoshop) for overlay and analysis of brightfield and fluorescent channels.
- Limited to embryonic and early larval stages due to increasing tissue opacity and ventricular accessibility.
