החדר דג הזברה המוח Injection

הליך זה מתחיל בבימוי של עוברי דג הזברה. כאשר העוברים הגיעו לשלב העניין, הוציאו אותם מהקוריון. לאחר מכן נוצרים חורים בכלי מצופה ארוס עם קצה פיפטה להרכבת העוברים והעוברים מונחים בעדינות בחורים עם זנבותיהם כלפי מטה.

לאחר הרכבת העוברים, מוזרק בזהירות קובייה פלואורסצנטית לחלל החדר של העובר דרך המוח האחורי. לאחר הזרקת החדר, העוברים מצולמים והנתונים מעובדים באמצעות פוטושופ. היי, אני ג'ניפר גוטמן מהמעבדה של ד"ר הייזל סיב במכון ווייטהד למחקר ביו-רפואי ב-MIT בקיימברידג', מסצ'וסטס.

היום נראה לכם נוהל להזרקת חדר מוח של דג הזברה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור היווצרות חדרי מוח ומורפוגנזה נוירו-אפיתל בדג זברה חי. בשל אופיים של עוברי דג זברה שקופים, אפיון צורת חדר המוח יכול להיות קשה.

טכניקה זו היא דרך שימושית ופשוטה להבדיל בין החלל המלא בנוזל לבין הרקמה שמסביב ולאפיין עוברים מוטנטיים שעלולים להיות בעלי פגמים בהיווצרות חדרי המוח. אז בואו נתחיל. כדי להתכונן להזרקת חדר המוח של דג הזברה, אנו מתחילים בהכנת מחטי ההזרקה.

קוטבית המחט של מכשיר סאטר משמשת למשיכת המחטים הנימים. לאחר מכן ממלאים את המחט הנימים בצבע פלואורסצנטי, כגון דקסטרין אדום טקסס. לאחר מכן, המחט המלאה מותקנת במניפולטור מיקרו במנגנון מיקרו-הזרקה.

חותכים את המחט לגודל המתאים בזווית. ליצירת קצה משופע, מדוד את גודל הטיפה של המחט ובדוק שהיא בין ננוליטר אחד לשני ננוליטר להזרקת שמן. כדי להתחיל בשלב הליך זה, יש להזריק את העוברים, לדברי קימל בכל העוברים, 30 דקות מוקדם יותר משלב העניין.

לדוגמה, כדי לחקור את החדרים 24 שעות לאחר ההפריה יש להזריק את העוברים 23 וחצי שעות לאחר ההפריה. העובר בשלב העניין מונח מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, והקוריון מוסר בזהירות מהעובר באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, מכינים צלחת ארוס לעוברים באמצעות צלחת פלסטיק המצופה בחורי תקיעה של 1% ארוס בארוס עם קצה פיפט פלסטיק של 200 מיקרוליטר.

הסר בזהירות את פקקי הארוס מהחורים בעזרת מלקחיים. העבירו את העובר ואמצעי העובר לתוך צלחת הארוס עם חורים. הוסף טריקה למדיה כדי להרדים את העובר ולמנוע תנועה.

במהלך הניסוי, הנח בעדינות את זנב העובר לתוך החור וכוון אותו כך שמנגנון ההזרקה יהיה בצד האחורי של העובר. כעת, כשהעובר מונח ומכוון נכון בצלחת הקמה, אנו מוכנים להזרקת חדר המוח. ראשית, סדר את מערך המיקרו-מניפולציה כך שקצה המחט יהיה באותו שדה ראייה כמו העובר בעוצמה גבוהה.

הכניסו בזהירות את המחט דרך לוחית הגג הדקה של המוח האחורי ממש מאחורי נקודת הציר R אפס R מבלי לפגוע ברקמת המוח שמתחת, הזריקו מספיק צבע כדי למלא לחלוטין את החדרים. ייתכן שיידרשו מספר זריקות כדי למלא את חלל החדר בהתאם לשלב העובר. כאשר העובר הוזרק ומוכן להדמיה, מכינים צלחת ארוס חדשה לעובר.

בעזרת צלחת נקייה בציפוי 1% ארוס, חוררים חורים בכלי ומסירים את הפקקים. מעבירים את העובר לצלחת ומוסיפים טריקה כדי להרדים את העובר ולמנוע תנועה. הנח את זנב החדר המוזרק לתוך החור במקומו לתמונה גבית.

העובר מוכן כעת להדמיה. צלם תמונה באמצעות אור מועבר. זה מאוד קריטי לא להזיז את העובר או את המיקרוסקופ.

לאחר מכן, שנה את ההגדרות במיקרוסקופ וצלם תמונה עם אור פלורסנט. מקם מחדש את העובר כדי לצלם תמונות רוחביות עם אור מועבר ואור פלואורסצנטי. שמור את כל התמונות כקבצים לעיבוד תמונה של Photoshop.

כדי לעבד את התמונות בפוטושופ, פתח את תמונות האור המועבר והאור הפלואורסצנטי של אותו עובר שצולמו באותו מיקום. ודא שכל ההגדרות זהות עבור כל תמונה, גרור את תמונת הפלורסנט שלך אל תמונת האור המשודר ויישר אותן בדיוק עם התמונה הפלואורסצנטית שנבחרה. בחר התאמות תמונה ולאחר מכן החלף צבע ושנה את הרקע השחור ללבן.

בחלון החלפת צבע, כוונן את גורם הערפול ימינה עד שהתמונה הפלואורסצנטית תיראה אחידה בצבע. בחלון השכבות, בחר הכפל. כדי view תמונות שכבת-העל, תמונת חלל החדר שלך צריכה להתאים לתמונת האור המועבר. בדיוק.

שמור קובץ זה וחזור על הפעולה עבור כל תמונה אחרת. אם הזרקת החדר מתבצעת כהלכה, התמונות צריכות להיות בעלות קצוות חדים בצבע לא מפוזר כפי שמוצג כאן בתמונות אלה של 25 שעות. לאחר ההפריה בעוד פאנל עוברים מסוג A מציג את תמונת השדה הבהיר, לוח B מציג את תמונת הפלואורסצנט ופאנל C מציג את תמונת השכבה.

מבט רוחבי של תמונת הכיסוי מוצג בפאנל D.מצד שני, אם במהלך הזרקת החדר המחט מוחדרת רחוק מדי, היא תיכנס לרקמת המוח מתחת לחלל החדר ותוביל להזרקה שגויה. התוצאה היא צבע שנראה מחוץ לחלל החדר ובחלמון כפי שמוצג כאן. לוח E מציג את תמונת השדה הבהיר.

חלונית F מציגה את תמונת הפלואורסצנט וחלונית G מציגה את תמונת הכיסוי. מבט רוחבי של התמונה המונחת מוצג בפאנל H.החצים מציינים אזורים שבהם הצבע חרג מחלל חדר המוח. בסרטון הזה, הדגמנו כיצד להזריק צבע פלואורסצנטי לחדרי המוח המתפתחים של דג הזברה.

שיטה זו משמשת להמחשת חלל חדר המוח בניגוד לאפיתל הנוירולוגי שמסביב, והיא שימושית ביותר לקביעת צורת חלל החדר כמו גם צורת רקמת המוח שמסביב. טכניקה זו מאפשרת לנו להבין טוב יותר את תהליך היווצרות חדרי המוח והמורפוגנזה של המוח לאורך זמן בעובר החי. זהו כלי מצוין לחקר פגמים בהיווצרות חדרי המוח, ולאפיון ראשוני של מוטציות מורפוגנזה במוח.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.