זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס
4 במרץ 2009
כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.
הליך זה מתחיל בתרבית זן הפיתיון במצע המכיל חומצות אמינו רגילות בזן הבקרה SLAC וליזין איזוטופי כבד וארגינין. כמויות שוות של שני הזנים מעורבבות ועוברים ליזה על ידי טחינה וחנקן נוזלי ליזטים גולמיים, תחילה מגולגלים על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן מנוקים על ידי קשירה לחרוזי ספרוס. לאחר מכן, ליזאט התא נקשר לחרוזי IgG.
החלבונים הקשורים לחרוזי IgG נרמזים על ידי פרוטאז, מחשוף ומשקעים. הדגימה מוכנה כעת לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה. היי, אני ג'סי צ'או מהמעבדה הבודדת במחלקה לביולוגיה סביבתית של התא במכון למדעי החיים באוניברסיטת קולומביה הבריטית.
היום הראו לכם נוהל לניתוח פרוטאומי כמותי הנקרא סילאק. בשילוב עם טיהור אהדה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור קומפלקסים של חלבונים.
אז בואו נתחיל בהליך זה, זן הפיתיון מכיל חומצות אמינו רגילות בעוד שזן בקרת SLAC מכיל איזוטופים כבדים, ליזין וארגינין. כדי להתחיל, ראשית, גדל ליטר אחד, כל אחד ממתח הפיתיון וזן הבקרה בנפרד לערך המוצג על המסך שלך. לאחר מכן, שפכו את התרבית לצינורות צנטריפוגה של 500 מיליליטר.
אזנו את העומס בתאי הגלולה ב-2, 580 RCF שפכו את המדיה והשעו מחדש את הגלולה. עם 50 מיליליטר D H2O קר תוך העברת התאים ל-50 מיליליטר, צינורות צנטריפוגה, צנטריפוגה את הצינורות כדי לגלול את התאים ב-3000 RCF. בשלב זה, ניתן להקפיא את הכדור בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.
חשוב לזכור להתאים את תרבית זן הביקורת לתרבית זן הפיתיון אחד לאחד לפי משקל גלולה יבשה. השעו מחדש כל כדור תא ב-10 מיליליטר של מאגר NP 40 עם קוקטייל מעכב פרוטאז אחד עד 2000. מערבבים את שתי תרביות התאים על ידי הזרקה ישירה של צינור אחד לשני.
כדי להתחיל לטחון את התאים תחילה, שפכו חנקן נוזלי לתוך המרגמה שהתקררה מראש ואפשרו לו להתאדות לחלוטין. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר תאים למרגמה. יוצקים מעט חנקן נוזלי כדי להקפיא את התאים.
טוחנים את התאים עד שהתאים נעשים תקינים. אבקה. חזור על התהליך עד שכל התאים נטחנים. הקפד לא לאפשר לתאים להפשיר.
הוסף חנקן נוזלי במידת הצורך. לאחר מכן, העבירו את האבקה לכוס קרה כקרח והפשירו בטמפרטורת החדר. כאשר הקצוות מתחילים להפשיר, הוסף 20 מיליליטר של מאגר NP 40 עם אחד עד 200 PIC לאחר ההפשרה.
העבירו את הליזאט הגולמי לצינורות Nalgene של 40 מיליליטר וסובבו במהירות של 16,000 סל"ד ברוטור Sovos SA 600 למשך 30 דקות. בזמן ההמתנה, קח 300 מיקרוליטר משני חרוזי ה-SROs B ושטוף את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של מאגר NP 40 שלוש פעמים. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים במאגרים של 300 מיקרוליטר כך שיהיו בתרחיץ אחד לאחד.
השלב הבא הוא לנקות מראש את הליזאט של התא. כדי לעשות זאת תחילה, העבירו את הסופר נטין לצינור חדש והוסיפו את שני חרוזי ה-B של Spheros. דגירה על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך 30 דקות.
בזמן הדגירה, קח 300 מיקרוליטר של IgG SROs שישה חרוזים ושטוף את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של מאגר NP 40 שלוש פעמים. לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים במאגרים של 300 מיקרוליטר כך שיהיו בתרחיץ אחד לאחד. לאחר הדגירה, גלולה את ה-SROs.
שניים להיות חרוזים ב. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. זכור לשמור אליקוט של ליזאט התא לכתמים מערביים מאוחר יותר.
לאחר מכן הוסף את חרוזי ה-IgG. הפרד את התכולה לשני צינורות לכריכה יעילה יותר, דגירה על פלטפורמה מסתובבת בחדר קירור למשך שעתיים. לאחר הדגירה אוספים את החרוזים בעמודת כרומטוגרפיה בארבע מעלות צלזיוס.
הקפד לשמור אליקוט של הפלג הלא מאוגד. שוטפים את החרוזים עם 10 מיליליטר. מאגר NP 40.
לאחר מכן, שטפו את החרוזים בשלושה מיליליטר. מאגר TEVC. שוב, זכור לשמור חלק מהחרוזים.
זה ישקף את יעילות הכריכה כדי לסלק את החרוזים. ראשית, הוסף חמישה מיקרוליטר של A-C-T-E-V למיליליטר אחד של מאגר TEVC. הוסף מאגר TEVC לחרוזים וערבב.
העבירו את התכולה לשני צינורות EINOR של 1.5 מיליליטר מערבוב יעיל יותר ודגרו על פלטפורמה מסתובבת בחדר קירור למשך הלילה. לאחר מכן, סובב את החרוזים והעביר את האלואט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. שוטפים את החרוזים עם 0.5 מיליליטר נוספים של מאגר TEVC לאחר הכביסה.
שלב את השמונה בשפופרת אחת. אתה צריך להיות 1.5 מיליליטר של ELU שמונה בסך הכל. שמור ציטוט של שמונה TEV Elu כדי לזרז.
התאם את הציטוטים ל-25% TCA עם מאה אחוז TCA. לשם כך, הפרד את שמונה ה- LU בנפח 1.5 מיליליטר לשני צינורות של 750 מיקרוליטר כל אחד. הוסף 250 מיקרוליטר של 100% TCA לשפופרת.
התמיסה שלך צריכה להפוך לחלבית. לאחר מכן, הניחו אותו על קרח למשך 30 דקות. מערבולת מעת לעת של התערובת לאחר הדגירה.
סובב במהירות מרבית בצנטריפוגה השולחנית בחדר קר למשך 30 דקות. יש לשטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר אצטון קר כקרח המכיל 0.05 חומצה הידרוכלורית רגילה. לאחר מכן סובב במשך חמש דקות במהירות מקסימלית בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, יש לשטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר קר כקרח, אצטון ולהסתובב במשך חמש דקות במהירות מקסימלית בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, הסר בזהירות את האצטון והגלולה היבשה להכתמת כסף. השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של פעם אחת ממאגר דגימת ה-SDS.
אם אתם מתכננים להשתמש בחלבון המשקע לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסה, מומלץ לזרז באמצעות אתנול. כדי לעשות זאת תחילה, הוסף 20 מיקרוגרם של גליקוגן לאחר מכן דגימות מדללות חמש פעמים עם מאה אחוז אתנול והתאימו ל-50 מילי-מולרי נתרן ביקרבונט עם מלאי של 2.5 מולארי ב-pH 5.0. מערבבים את התמיסה על ידי היפוך הצינור.
תן לזה לעמוד שעתיים בטמפרטורת החדר. לבסוף, פצלו את התכולה לשני צינורות עינור. גלולה את החלבון המשקע על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 12, 000 GS בטמפרטורת החדר.
ה-aliquot שנשמר במהלך הליך הטיהור צריך לכלול את ליזט התא שנוקה מראש, השבר הקשור, השבר הלא קשור והשבר החמקמק. אנו ממליצים לנתח את תכולת החלבון של האליקוטים הנ"ל על ידי Western Blotting באמצעות נוגדן Antit TAP או צביעת כסף כדי לשקף את יעילות הקישור וההרחקה של הניסוי. בג'ל כתם כסף זה מטוהר SCS שתי ברזים באינטראקציה שלו, השותפים הודגמו והושוו לבקרה לא מתויגת בכתם המערבי הזה.
פלגים שונים שנלקחו במהלך הטיהור של SCS שני ברזים נותחו על ידי Western Blotting באמצעות נוגדן אנטיט ברז. שימו לב ש-SCS שני ברז נדד במשקל מולקולרי נמוך יותר לאחר אלוסיאן על ידי מחשוף פרוטאז TEV, ולא נותרו שני ברזים של S SCS על חרוזי ה-IgG לאחר הפליטה. זה אישר שהטיהור היה יעיל ביותר.
זה עתה הראינו לכם כיצד לטהר קומפלקסים של חלבונים על ידי טיהור זיקה עם חרוזי IgG. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להקפיד להתאים את מתח הבסיס ואת מתח הבקרה על ידי משקל פלה יבש לפני שתתחיל בהליך הטיהור. מכיוון ש-LAC מספק לנו מדידות בלתי מוטות ו-qued של שותפים לקשירת חלבונים, אנו מבצעים רק את השלב הראשון של טיהור הברז כדי למזער את אובדן הדגימה.
אם אתה חווה כמויות משמעותיות של כריכה לא ספציפית, ייתכן שתרצה לבצע את הפרוטוקול כולו, אותו ניתן למצוא במדריך לנמל האביב הקר. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
היי, בחייך, מארק. אה, לך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה של פרוטאומיקה כמותית לזיהוי קומפלקסים של חלבונים ב-Saccharomyces cerevisiae. המחקר משתמש בשיטת SILAC בשילוב עם טיהור זיקה וספקטרומטריית מסות בטנדם כדי לאתר את השותפים לקשירה של חלבון ה-ER הנקרא Scs2p.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פרוטאומיקה
- ביולוגיה של התא
- ספקטרומטריית מסות
רקע
- הבנת אינטראקציות בין חלבונים היא קריטית להבהרת תפקודי תאים.
- SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture) היא שיטה עוצמתית לפרוטאומיקה כמותית.
- טכניקות של ניקוי סלקטיבי (Affinity purification) משפרות את הספציפיות של זיהוי קומפלקסים חלבוניים.
- ספקטרומטריית מסות טנדם מאפשרת ניתוח מפורט של אינטראקציות בין חלבונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה חסונה לזיהוי קומפלקסים של חלבונים בשמרים.
- בדיקת השותפים לקשירה של חלבון ה-ER Scs2p.
- שיפור הסגוליות והרגישות של אנליזות פרוטאומיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול זנאי פיתיון במצעים המכילים חומצות אמינו איזוטופיות רגילות וכבדות.
- ערבוב וליזיס של הזנאים לקבלת ליזאטים גולמיים.
- הצללת הליזאטים באמצעות חרוזי spheros וקישור לחרוזי IgG.
- אלוציה של חלבונים מחרוזי IgG לצורך אנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של השותפים לקשירה של Scs2p.
- הדגמה של יעילות שיטת ה-SILAC בפרוטאומיקה.
- השגת ספציפיות גבוהה בזיהוי קומפלקסים של חלבונים.
- תובנות לגבי תפקידו של Scs2p בתהליכים תאיים.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה משפרת את ההבנה של אינטראקציות בין חלבונים בשמרים.
- הממצאים תורמים לתחומים הרחבים יותר של פרוטאומיקה וביולוגיה של התא.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לאורגניזמים ולקומפלקסים חלבוניים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטאומיקה כמותית מאפשרת זיהוי לא מוטה של רשתות אינטראקציה של חלבונים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובהורדת סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים. באמצעות הבחנה בין שותפי קישור ספציפיים לבין זיהומי רקע בעזרת סימון איזוטופי, השיטה משפרת את הביטחון החזוי בניתוח קומפלקסים של חלבונים. גישה זו נותנת מענה לאתגר מרכזי בחקר אתרי מגע של ממברנות ומנגנוני הובלת ליפידים הרלוונטיים למסלולי איתות תאיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של אינטראקציות בין חלבונים באתרי מגע של ממברנות ה-ER-PM.
- ערך תפעולי: מפחית תוצאות חיוביות שגויות באמצעות כימות מבוסס SILAC, ובכך משפר את מהימנות התיקוף של המטרות.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת ההרכב המולקולרי של קומפלקסים של הובלת ליפידים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות עשויות (validated) לסריקות המשך על ידי הגדרת הרכב החלבונים של ER-PM MCSs.
- ערך תפעולי: מייצר נתוני אינטראקציה כמותיים וניתנים לשחזור, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולמדרגיות (scalability).
- ערך מדעי: מקל על הכנת מודלים הרלוונטיים למחלות על ידי זיהוי חלבונים אוקריוטיים שמורים המעורבים באיתות ליפידית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות מכניסטיות לגבי תעתוע ושליחות של ליפידים, התומכות בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון באמצעות זיהוי שחזור של קומפלקסים מורכבים לאורך חזרות ניסיוניות.
- ערך מדעי: תומך בפיתוח מודלים פרה-קליניים על ידי הגדרת קומפלקסים חלבונים שמורים בשמרים, הישימים לאוקריוטים גבוהים יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת נתונים כמותיים על אינטראקציות המנחים את תיעדוף המטרות ואת ניתוח המסלולים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי זיהוי שותפי אינטראקציה של Scs2p ברשתות הובלה של ליפידים.
- סריקה: מספקת פרופילים של אינטראקציות חלבונים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, עם תוצאות כמותיות עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואת תנאים באמצעות כימות מבוסס SILAC, מה שמאפשר לצומיות להבחין בין קישור ספציפי לרעש רקע.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הגילוי לרצף פרה-קליני על ידי זיהוי חלבונים אוקריוטיים שמורים המעורבים בתפקוד אתרי מגע של ממברנות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה פרוטאומיקה הניתנת לשימוש חוזר ללימוד קומפלקסים של חלבונים על פני מספר מטרות ותחומי מחלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בנתוני אינטראקציה של חלבונים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והניתנות להרחבה באמצעות תהליכי סימון SILAC וטיהור זיקה (affinity purification) סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי אספקת נתוני אינטראקציה כמותיים המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם-סיכון, בהתבסס על רמת הביטחון ברשת האינטראקציות המותקפת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוטאומיקה כמותית, ספקטרומטריית מסות וטכניקות לתרבית שמרים.
- תלוי בציוד עבור סימון SILAC, טיהור זיקה ואנליזה של LC-MS/MS ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של יעילות הסימון, פרוטוקולי ליזיס וצינורות עיבוד לניתוח נתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על מערכות מודל שאינן שמרים או תנאי ליזיס חלופיים.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לטווח הדינמי של הגילוי ולצורך בביטוי גבוה של חלבון הפיתיון (bait).
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:45
Introduction
1:17
Preparation of the Bait and SILAC Control Strain
2:44
Grinding of Cells
4:05
Pre-clearing Cell Lysate
5:51
Eluting From IgG Beads by TEV Protease Cleavage
6:45
Trichloroacetic Acid (TCA) Precipitation
9:00
Sample Analysis by Western Blotting and/ or Silver Staining
8:11
EtOH/ Acetate Precipitation
9:30
Representative Results/ Outcome
10:15
Conclusion
