Name: זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: למד שיטת SILAC לזיהוי קומפלקסים חלבוניים ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות טיהור אפיניות וספקטרומטריית מסה. טכניקה זו מאפשרת זיהוי שותפי קשירה של חלבון Scs2p ברמת רגישות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

חומרים ושיטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זני שמרים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הזנים המשמשים במחקר זה מבוססים על רקע BY4742. זן השליטה SILAC (מחצלת, his3, leu2, ura3, lys2 ו arg4: G418) נעשתה על ידי הזדווגות arg4 זן המחיקה (מחצלת, his3, ura3, leu2 ו arg4: G418) כדי BY4742 (מאט אלפא, his3, leu2, ura3 ו lys2), ואת haploids meiotic התקבלו על ידי לנתיחה הטטרדה. לכן, את המתח שליטה auxotroph עבור ליזין ארגינין. זן הפיתיון נעשה על ידי רקומבינציה הומולוגיים PCR בתיווך באמצעות וקטור pBS1479. לכן, תג epitope השתמשו במחקר זה הוא טיהור זיקה טנדם (TAP) תג (3). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SILAC: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן השליטה SILAC היה גדל בתקשורת הנשירה מינימלי בתוספת 98% L-ליזין-4 ,4,5,5-D4 (0.03 g / L, קיימברידג&#39; איזוטופ) ו 98% L-ארגנין-13 C 6 (0.036 גרם / L, קיימברידג&#39; איזוטופ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן הפיתיון היה גדל במדיום עשיר קבוע עם נורמלי חומצות אמינו איזוטופי. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב ראשון של טיהור TAP [פרוטוקול זה מותאם ממעיין הקרה הרבור מעבדה כמובן ידנית (4)] ** בלילה שלפני מרגמה טיהור שלך מראש צמרמורת, ועלי ב -80 ° C במקפיא. כמו כן, מראש צמרמורת הגביע ב -20 ° C ** בצע מאגרים אלה ממש לפני השימוש (עבור L 1 של התרבות): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 מ&quot;ל NP-40 חיץ עם PIC 25 μl (1 / 2000), 50 μl של DTT 1M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;ל של חיץ NP-40 עם 1 / 200 PIC, 50 μl של 1M DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ל של TeV-C חיץ עם PIC 1 / 2000, 10 μl של 1 M DTT </li></ul></li></ol> SILAC והכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 1L כל זן את הפיתיון השליטה זן בנפרד OD 600 = 1.0-1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים תרבות 500ml צינורות Nalgene צנטריפוגות. מאזן את העומס ותאי גלולה ב 2580X g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג מדיה resuspend גלולה עם 50 מ&quot;ל של קר DH 2 O תוך העברת התאים 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגות. גלולה תאים. ** ניתן להקפיא את גלולה ב -80 ° C ** </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ** ** חשוב להתאים את התרבות זן לשלוט לתרבות הפיתיון המתח 01:01 על ידי גלולה משקל יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל תא גלולה ב 10 מ&quot;ל של חיץ NP-40 עם קוקטייל 1 / / 2000 מעכבי פרוטאז (PIC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שתי התרבויות תא decanting ישירות על ידי שפופרת אחת לשנייה. שחיקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את נוזלי N 2 לתוך מרגמה מראש צינן את ולאפשר לו להתאדות לגמרי. הוסף 2 מ&quot;ל של תאים מרגמה בתנועה מעגלית. יוצקים מעט נוזלי N 2 להקפיא את התאים. טוחנים את התאים עד התאים להיות אבקה דקה. חזור על התהליך עד שכל התאים הקרקע. ** אל תאפשר התאים להפשיר. הוסף נוזלי N 2 בעת הצורך ** </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את אבקת כוס מי קרח ו להפשיר בטמפרטורת החדר. כאשר הקצוות מתחילים להפשיר, להוסיף 20 מ&quot;ל של חיץ NP 40-PIC עם 1 / 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת lysate גולמי של 40 מ&quot;ל צינורות Nalgene. ספין על xgfor 39,000 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, לקחת 300 μl של חרוזים Sepharose 2B (GE). לשטוף את החרוזים 300 μl של חיץ NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 פעמים. Resuspend את החרוזים חיץ 300 μl כך שהם slurry 01:01. טרום ניקוי התא lysate </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לצינור חדש ולהוסיף את החרוזים 2B Sepharose. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, לקחת 300 μl של IgG Sepharose 6 חרוזים (GE). לשטוף את החרוזים 300 μl של חיץ NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 פעמים. Resuspend את החרוזים חיץ 300 _l כך שהם slurry 01:01. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה את החרוזים. מעבירים את supernatant לצינור חדש. ** שמור aliquot של lysate התא עבור המערבי סופג מאוחר יותר ** הכבילה למעסיק חרוזים IgG sepharose </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החרוזים 2B Sepharose על ידי צנטריפוגה. מוסיפים את החרוזים IgG (הכין בעבר slurry 1:1). הפרד את התוכן לשני צינורות עבור מחייב יותר יעיל. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את החרוזים. ** שמור aliquot סיעת מאוגד ** </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חרוזים חיץ 10 NP-40 מ&quot;ל (1 / 2, 000 PIC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים עם 3 מ&quot;ל TeV-C חיץ (1 / 2, 000 PIC). ** שמור aliquot של החרוזים. זה ישקף את היעילות של ** מחייב משחררי מן החרוזים IgG ידי מחשוף פרוטאז TeV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של AcTEV למאגר 1ml של TeV-C (עם PIC 02/01 000,). לאחר ערבוב, להפריד את התוכן לשני צינורות 1.5 מ&quot;ל Eppendorf יותר ערבוב יעיל. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים העברת eluate לצינור 1.5-מ&quot;ל טריים. שטפו את החרוזים עם 0.5 מ&quot;ל נוספים של TeV-C חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את elaute בצינור אחד. היית צריך 1.5 מ&quot;ל של eluate בסך הכל.** שמור aliquot של eluate TeV ** חומצה Trichloroacetic (TCA) precipatation (לניתוח ספקטרומטריית מסה מבוססות, אנו ממליצים להשתמש EtOH / משקעים אצטט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם aliquots 25% TCA עם 100% TCA. כדי לעשות זאת, להפריד את eluate 1.5 מ&quot;ל לתוך 2 צינורות של μl 750 כל אחד. הוסף 250 μl של 100% TCA אל הצינור. הפתרון שלך צריך להפוך חלבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על קרח למשך 30 דקות עם vortexing תקופתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במהירות מקסימלית בצנטריפוגה שולחן בראש בחדר קר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם 500 μl של אצטון קר כקרח המכיל 0.05 N HCl ו - ספין של 5 דקות במהירות מקסימלית (חדר קר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם 500 μl של אצטון קרים כקרח ספין 5 דקות על מקסימום (חדר קר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות אצטון גלולה יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים כסף, resuspend את הכדור ב 50 μl של חיץ מדגם SDS 1X. EtOH / אצטט precipatation </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מיקרוגרם של גליקוגן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל דגימות 5X עם EtOH 100% להסתגל 50 מ&quot;מ נ&quot;ך 3 COO עם מלאי M 2.5, pH 5.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stand הפתרון 2hr </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה זירז חלבון על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות על 12,000 X גרם בטמפרטורת החדר. </li></ol> NP-40 חוצץ (עבור 200 מ&quot;ל) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> במלאי ריכוז </td><td> להוסיף </td></tr><tr><td> 10 mM נתרן זרחתי חיץ (pH 7.2) </td><td> 0.1 מ &#39; </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td><td> 2 M </td><td> 15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1% NP-40 </td><td> 100% </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;מ NAF </td><td> 1 M </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.1 mM Na 3 VO 4 </td><td> 10 mM </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td style="text-align:right;" colspan="3"> נפח עד 200 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> ADD לפני השימוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 1, 000 של 1 M DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 2, 000 של PIC (קוקטייל מעכבי פרוטאז) </li></ol> TeV-C חוצץ (עבור 50 מ&quot;ל) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> במלאי ריכוז </td><td> להוסיף </td></tr><tr><td> 25 מ&quot;מ טריס (pH 8.0) </td><td> 100 מ&quot;מ </td><td> 12.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td><td> 2 M </td><td> 3.75 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.1% NP-40 </td><td> 100% </td><td> 50 _l </td></tr><tr><td> 0.5 mM EDTA </td><td> 500 מ&quot;מ </td><td> 50 __l </td></tr><tr><td style="text-align:right;" colspan="3"> נפח עד 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> ADD לפני השימוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 1, 000 של 1M DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 2, 000 של PIC </li></ol>

<ol><li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Jour.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.</li>
<li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 Forthcoming.</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 Forthcoming.</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Yeast+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methods in Yeast Genetics.</a> , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.</li>
</ol>

Aliquots הציל במהלך ההליך טיהור צריכה לכלול (1) מראש פינה lysate התא, (2) חלק מחויב, (3) חלק מאוגד, ו (4) חלק eluted. אנו ממליצים על ניתוח תוכן של חלבון aliquots לעיל על ידי המערב סופג באמצעות נוגדן אנטי מכתים TAP או כסף כדי לשקף את היעילות מחייב משחררי הניסוי. דוגמאות של ג&#39;ל מוכתם כסף כתם מוצגים באיור 1. מאז SILAC מספק לנו מדידות משוחדת לכמת השותפים חלבון מחייב, אנחנו רק עושים את השלב הראשון של טיהור TAP כדי...

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

ליפידים הם אבני הבניין של ממברנות הסלולר המתפקדים מחסומים ועל מידור של תהליכים תאיים, ולאחרונה, כפי חשוב מולקולות איתות תאיים. עם זאת, בניגוד חלבונים, שומנים הם מולקולות הידרופוביות קטנות תעבורה בעיקר על ידי נתיבי nonvesicular תיאר גרוע, שהם שיערו להתרחש בכל מגע אתרים קרום (MCSs). MCSs הם אזורים שבהם reticulum endoplasmic (ER) עושה מגע פיזי ישיר עם אברון משתפת פעולה, למשל, פלזמה הממברנה (PM). החלק המיון של ER-PM MCSs הוא מועשר ב שומנים לסנתז אנזימים, טוען כי סינתזה השומנים מופנית לאותם אתרים רומז כי MCSs חשובים תנועה השומנים. שמרים הוא מודל אידיאלי ללמוד ER-PM MCSs בגלל השפע שלהם, עם למעלה מ 1000 אנשי קשר לכל תא, טבע נשמרת שלהם כל אאוקריוטים. חשיפת חלבונים המהווים MCSs הוא קריטי כדי להבין כיצד תנועה שומנים נעשית בתאים, וכיצד הם פועלים כמו מולקולות איתות. מצאנו כי ER נקרא Scs2p למקם את ER-PM ו MCSs חשוב היווצרותם. אנו מתמקדים בחשיפת השותפים המולקולרי של Scs2p. זיהוי של קומפלקסים חלבונים מסורתי מסתמך על הראשון לפתרון דגימות חלבון מטוהרים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה, ואחריו עיכול ג&#39;ל של להקות החלבון ואנליזה של פפטידים על ידי ספקטרומטריית מסה. זה לעתים קרובות מגביל את לימוד בקבוצה קטנה של חלבונים. כמו כן, קומפלקסים חלבונים נחשפים denaturing או לא תנאים פיזיולוגיים במהלך ההליך. כדי לעקוף את הבעיות הללו, יישמנו בקנה מידה גדול טכניקה proteomics כמותיים כדי לחלץ נתונים משוחדת לכמת. אנו משתמשים תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) לשלב גרעינים איזוטופ מצרך חלבונים זן פקד לא מתוייגת. כמויות שוות של התרבות מתויג לא מתוייגת, תרבות SILAC שכותרתו מעורבבים יחד lysed על ידי שחיקה של חנקן נוזלי. לאחר מכן, אנו לבצע הליך טיהור זיקה לנתץ קומפלקסים חלבונים. לבסוף, אנו לזרז את המדגם חלבון, שהוא מוכן לניתוח על ידי כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי / ספקטרומטריית מסה טנדם. והחשוב מכל, חלבונים זן הבקרה מסומנים על ידי האיזוטופ הכבד יהיה לייצר שינוי מסה / מטען, כי ניתן לכמת נגד חלבונים ללא תווית בזן את הפיתיון. לכן, מזהמים, או מחייב נוקבים ניתן לבטל בקלות. על ידי שימוש בגישה זו, זיהינו חלבונים הרומן מספר למקם את ER-PM MCSs. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הגישה שלנו.

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

ליפידים הם אבני הבניין של קרומי התאים, המשמשים כמחסומים ובמדפר התהליכים התאיים, ולאחרונה, כ...

הליך זה מתחיל בגידול של זן הפיתיון במצע המכיל חומצות אמינו רגילות בזן הביקורת של ה-SLAC, ובליזין וארגינין עם איזוטופים כבדים. כמויות שוות של שני הזנים מעורבבות ומולחשות על ידי טחינה וחנקן נוזלי. ליזטים גולמיים, אשר תחילה הועברו למשקע על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן נוקו על ידי קישור לחרוזי spheros. לאחר מכן, ליזט התאים נקשר לחרוזי IgG.החלבונים הקשורים לחרוזי IgG מעוייבים על ידי פרוטאז, מנוסחים ומשוקעים. הדגימה מוכנה כעת לניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות. שלום, אני ג'סי צ'או מהמעבדה של Lone במחלקה לביולוגיה סביבתית של התא במכון למדעי החיים של אוניברסיטת הבריטיש קולומביה.היום נדגים לכם פרוצדורה לאנליזה פרוטאומיקה כמותית הנקראת SILAC, בשילוב עם טיהור באמצעות זיקה (affinity purification). אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור קומפלקסים של חלבונים.נתחיל בתהליך. בפרוצדורה זו, זן הפיתיון (bait strain) מכיל חומצות אמינו רגילות, בעוד שזן הביקורת מסוג SLAC מכיל ליזין וארגינין עם איזוטופים כבדים. כדי להתחיל, גרשו תחילה ליטר אחד של זן הפיתיון וליטר אחד של זן הביקורת בנפרד, עד להגעה לערך המוצג על המסך. לאחר מכן, שפכו את התרבית למבחנות צנטריפוגה של Nalgene בנפח 500 מיליליטר.יש לאזן את העומס בתאי המשקע ב-2,580 RCF, למזג את המדיום ולסספנד מחדש את המשקע ב-50 milliliters של D H2O קר, תוך העברת התאים למבחנות צנטריפוגה של 50 milliliters. צנטריפוגה את המבחנות כדי לשקיע את התאים ב-3000 RCF. בשלב זה, ניתן להקפיא את המשקע בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.חשוב לזכור להתאים את תרבית זן הביקורת לתרבית זן הפיתיון ביחס של אחד לאחד לפי משקל הכדור היבש. השעה מחדש כל כדור תאים ב-10 milliliters של NP 40 buffer עם תערובת מעכבי פרוטאז ביחס של אחד ל-2000. ערבב את שתי תרביות התאים על ידי העברה ישירה של תוכן מבחנה אחת לשנייה.כדי להתחיל בגריסת התאים, שפכו תחילה חנקן נוזלי לתוך המכתש שקולל מראש והמתינו עד שיתאדה לחלוטין. לאחר מכן, הוסיפו למכתש שני מיליליטר של תאים. שפכו כמות של חנקן נוזלי כדי להקפיא את התאים.גרס את התאים עד שהתאים יהפכו לאבקה דקה. חזור על התהליך עד שכל התאים יגרסו. הקפד לא לאפשר לתאים להפשיר.הוסיפו חנקן נוזלי בעת הצורך. לאחר מכן, העבירו את האבקה לכלי ביקר קר מאוד (בטמפרטורת קרח) והפשירה בטמפרטורת החדר. כאשר השוליים יתחילו להפשיר, הוסיפו 20 milliliters של NP 40 buffer עם PIC בדילול של 1:200 לאחר ההפשרה.העבירו את הליסאט הגולמי למבחנות Nalgene בנפח 40 מיליליטר וסובבו במהירות של 16,000 RPM ברוטור Sovos SA 600 למשך 30 דקות. בזמן ההמתנה, קחו 300 מיקרוליטר של חרוזי SROs two B ושטפו את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של בופר NP 40 שלוש פעמים. לאחר מכן, השביו את החרוזים ב-300 מיקרוליטר בופרים כך שיהיו בתמיסת סלרי (slurry) ביחס של אחד לאחד.השלב הבא הוא ביצוע ניקוי מקדים (pre-clear) לליזט התאים. לשם כך, העבירו תחילה את הסופרנאט למבחנה חדשה והוסיפו את חרוזי ה-Spheros two B. דגרו על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך 30 דקות.במהלך הדגירה, קחו 300 µL של חרוזי IgG SROs six ושטפו את החרוזים ב-300 µL של NP 40 buffer שלוש פעמים. לאחר מכן, השעיקו מחדש את החרוזים ב-300 µL buffers כך שיתקבלו תרחיף ביחס של אחד ለአחד. לאחר הדגירה, השקיעו את ה-SROs.הכנס שני חרוזי מגנט. העבר את הנוזל העליון למבחנה חדשה. זכור לשמור מנה (aliquot) של ליזאט התאים עבור Western blotting מאוחר יותר.לאחר מכן הוסיפו את חרוזי ה-IgG. חלקו את התוכן לשתי מבחנות כדי להשיג קישור יעיל יותר, והדגירו על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, אספו את החרוזים בעמודת כרומטוגרפיה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הקפידו לשמור מנה (aliquot) של הפракציה שאינה קשורה. שטפו את החרוצים עם 10 milliliters של NP 40 buffer.בשלב הבא, שטפו את החרוזים עם שלושה מיליליטר של בופר TEVC. שוב, זכרו לשמור אליקוט של החרוזים.דבר זה ישקף את יעילות הקישור לשחרור החרוזים. ראשית, הוסיפו 5 µL של A-C-T-E-V ל-1 mL של בופר TEVC. הוסיפו בופר TEVC לחרוזים ועבדו את התמיסה.העבירו את התכנים לשתי פחלוני EINOR בנפח 1.5 מיליליטר לצורך ערבוב יעיל יותר, והדגירו על פלטפורמה מסתובבת בחדר קרר למשך לילה. לאחר מכן, סובבו את החרוזיים למטה והעבירו את התסנין לפחלוני 1.5 מיליליטר חדש. שטפו את החרוזיים ב-0.5 מיליליטר נוספים של באפר TEVC לאחר השטיפה.שילו את שמונת דגימות ה-ELU eight במבחנה אחת. סך הכל צריכים להיות 1.5 milliliters של ELU eight. שמרו אליקוט של ה-TEV Elu eight לצורך שקיעה.כוון את המנות ל-25% TCA באמצעות TCA בריכוז מאה אחוז. לשם כך, חלק את 1.5 מיליליטר של LU שמונה לשתי מבחנות של 750 מיקרוליטר כל אחת. הוסף 250 מיקרוליטר של 100% TCA למבחנה.התמיסה צריכה להפוך לעכורה. לאחר מכן, הניחו אותה על קרח למשך 30 דקות, תוך ערבוב תקופתי של התערובת במכשיר vortex לאחר האינקובציה.סבב במהירות מקסימלית בצנטריפוגת שולחן בחדר קר למשך 30 דקות. שטוף פעם אחת עם 500 microliters של אצטון קר במיוחד המכיל 0.05 normal של חומצה כלורית. לאחר מכן, סבב למשך חמש דקות במהירות מקסימלית בטמפרטורה של four degrees Celsius.בשלב הבא, שטפו פעם אחת עם 500 µL של אצטון קר מאוד, וסובבו במשך חמש דקות במהירות מקסימלית בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסובבוב, הסירו בזהירות את האצטון ויבשו את המשקע לצורך צביעה בכסף. השעיקו מחדש את המשקע ב-50 µL של SDS sample buffer בריכוז של פי 1.אם בכוונתכם להשתמש בחלבון שהשקעתם לצורך אנליזה מבוססת ספקטרומטריית מסות, מומלץ לבצע את ההשקעה באמצעות אתנול. לשם כך, הוסיפו תחילה 20 micrograms של גליקוגן, לאחר מכן דללו את הדגימות פי חמישה עם אתנול בריכוז מאה אחוז והביאו את הריכוז ל-50 millimolar של סודיום ביקרבונט באמצעות תמיסת סטוק בריכוז 2.5 molar ב-pH 5.0. ערבבו את התמיסה על ידי היפוך המבחנה.השאירו את התוכן למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לבסוף, חלקו את התוכן לשתי מבחנות Eppendorf. השקיעו את החלבון שהשקיע באמצעות סרכזים למשך 10 דקות ב-12,000 GS בטמפרטורת החדר.האליקוויט שנשמר במהלך הליך הטיהור צריך לכלול את ליזאט התאים שעבר ניקוי מקדמי (pre-cleared), את הפראקציה הקשורה, את הפראקציה הבלתי קשורה ואת הפראקציה שנשטפה (eluded). אנו ממליצים לנתח את תכולת החלבונים של האליקוויטים שלעיל באמצעות Western blotting באמצעות נוגדן Anti-TAP או צביעת כסף, כדי לשקף את יעילות הקשירה והשטיפה של הניסוי. בג'ל צביעת כסף זה, נראו SCS two tap מטוהר יחד עם השותפים האינטראקטיביים שלו, והם הושוו לביקורת ללא תג (untagged) ב-Western blot זה.שברים שונים שנלקחו במהלך טיהור SCS two tap נותחו באמצעות Western blotting באמצעות נוגדן Antit tap. שימו לב כי SCS two tap נדידה במשקל מולקולרי נמוך יותר לאחר אלואוציה על ידי שסוע TEV protease, ולא נותר S SCS two tap על חרוזי ה-IgG לאחר האלואוציה. דבר זה אישש כי הטיהור היה יעיל ביותר.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לטהר קומפלקסים של חלבונים באמצעות טיהור זיקה (affinity purification) עם חרוזי IgG. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא כי זן הבסיס וזן הביקורת תואמים במשקל הפלט היבש (dry pellet weight) לפני תחילת הליך הטיהור. מכיוון ש-LAC מספק לנו מדידות לא מוטיות ומדויקות של השותפים לקשירה של החלבון, אנו מבצעים רק את השלב הראשון של טיהור ה-tap כדי למזער את אובדן הדגימה.אם אתם חווים כמויות משמעותיות של קישור לא ספציפי, ייתכן שתרצו לבצע את הפרוטוקול המלא, שניתן למצוא במדריך של Cold Spring Harbor. זהו כל הפרוטוקול. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.היי, קדימה, מארק. אה, לך.

identification-protein-complexes-with-quantitative-proteomics-s

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

הפרוטוקול BN-MS רב-תכליתי באמצעות מיקרוטומה מוצג ברזולוציה גבוהה complexome פרופיל.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

למד שיטת SILAC לזיהוי קומפלקסים חלבוניים ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות טיהור אפיניות וספקטרומטריית מסה. טכניקה זו מאפשרת זיהוי שותפי קשירה של חלבון Scs2p ברמת רגישות גבוהה.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

גלה סרטונים נוספים