זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס
March 4th, 2009
כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.
הליך זה מתחיל בתרבית זן הפיתיון במצע המכיל חומצות אמינו רגילות בזן הבקרה SLAC וליזין איזוטופי כבד וארגינין. כמויות שוות של שני הזנים מעורבבות ועוברים ליזה על ידי טחינה וחנקן נוזלי ליזטים גולמיים, תחילה מגולגלים על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן מנוקים על ידי קשירה לחרוזי ספרוס. לאחר מכן, ליזאט התא נקשר לחרוזי IgG.
החלבונים הקשורים לחרוזי IgG נרמזים על ידי פרוטאז, מחשוף ומשקעים. הדגימה מוכנה כעת לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה. היי, אני ג'סי צ'או מהמעבדה הבודדת במחלקה לביולוגיה סביבתית של התא במכון למדעי החיים באוניברסיטת קולומביה הבריטית.
היום הראו לכם נוהל לניתוח פרוטאומי כמותי הנקרא סילאק. בשילוב עם טיהור אהדה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור קומפלקסים של חלבונים.
אז בואו נתחיל בהליך זה, זן הפיתיון מכיל חומצות אמינו רגילות בעוד שזן בקרת SLAC מכיל איזוטופים כבדים, ליזין וארגינין. כדי להתחיל, ראשית, גדל ליטר אחד, כל אחד ממתח הפיתיון וזן הבקרה בנפרד לערך המוצג על המסך שלך. לאחר מכן, שפכו את התרבית לצינורות צנטריפוגה של 500 מיליליטר.
אזנו את העומס בתאי הגלולה ב-2, 580 RCF שפכו את המדיה והשעו מחדש את הגלולה. עם 50 מיליליטר D H2O קר תוך העברת התאים ל-50 מיליליטר, צינורות צנטריפוגה, צנטריפוגה את הצינורות כדי לגלול את התאים ב-3000 RCF. בשלב זה, ניתן להקפיא את הכדור בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.
חשוב לזכור להתאים את תרבית זן הביקורת לתרבית זן הפיתיון אחד לאחד לפי משקל גלולה יבשה. השעו מחדש כל כדור תא ב-10 מיליליטר של מאגר NP 40 עם קוקטייל מעכב פרוטאז אחד עד 2000. מערבבים את שתי תרביות התאים על ידי הזרקה ישירה של צינור אחד לשני.
כדי להתחיל לטחון את התאים תחילה, שפכו חנקן נוזלי לתוך המרגמה שהתקררה מראש ואפשרו לו להתאדות לחלוטין. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר תאים למרגמה. יוצקים מעט חנקן נוזלי כדי להקפיא את התאים.
טוחנים את התאים עד שהתאים נעשים תקינים. אבקה. חזור על התהליך עד שכל התאים נטחנים. הקפד לא לאפשר לתאים להפשיר.
הוסף חנקן נוזלי במידת הצורך. לאחר מכן, העבירו את האבקה לכוס קרה כקרח והפשירו בטמפרטורת החדר. כאשר הקצוות מתחילים להפשיר, הוסף 20 מיליליטר של מאגר NP 40 עם אחד עד 200 PIC לאחר ההפשרה.
העבירו את הליזאט הגולמי לצינורות Nalgene של 40 מיליליטר וסובבו במהירות של 16,000 סל"ד ברוטור Sovos SA 600 למשך 30 דקות. בזמן ההמתנה, קח 300 מיקרוליטר משני חרוזי ה-SROs B ושטוף את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של מאגר NP 40 שלוש פעמים. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים במאגרים של 300 מיקרוליטר כך שיהיו בתרחיץ אחד לאחד.
השלב הבא הוא לנקות מראש את הליזאט של התא. כדי לעשות זאת תחילה, העבירו את הסופר נטין לצינור חדש והוסיפו את שני חרוזי ה-B של Spheros. דגירה על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך 30 דקות.
בזמן הדגירה, קח 300 מיקרוליטר של IgG SROs שישה חרוזים ושטוף את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של מאגר NP 40 שלוש פעמים. לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים במאגרים של 300 מיקרוליטר כך שיהיו בתרחיץ אחד לאחד. לאחר הדגירה, גלולה את ה-SROs.
שניים להיות חרוזים ב. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. זכור לשמור אליקוט של ליזאט התא לכתמים מערביים מאוחר יותר.
לאחר מכן הוסף את חרוזי ה-IgG. הפרד את התכולה לשני צינורות לכריכה יעילה יותר, דגירה על פלטפורמה מסתובבת בחדר קירור למשך שעתיים. לאחר הדגירה אוספים את החרוזים בעמודת כרומטוגרפיה בארבע מעלות צלזיוס.
הקפד לשמור אליקוט של הפלג הלא מאוגד. שוטפים את החרוזים עם 10 מיליליטר. מאגר NP 40.
לאחר מכן, שטפו את החרוזים בשלושה מיליליטר. מאגר TEVC. שוב, זכור לשמור חלק מהחרוזים.
זה ישקף את יעילות הכריכה כדי לסלק את החרוזים. ראשית, הוסף חמישה מיקרוליטר של A-C-T-E-V למיליליטר אחד של מאגר TEVC. הוסף מאגר TEVC לחרוזים וערבב.
העבירו את התכולה לשני צינורות EINOR של 1.5 מיליליטר מערבוב יעיל יותר ודגרו על פלטפורמה מסתובבת בחדר קירור למשך הלילה. לאחר מכן, סובב את החרוזים והעביר את האלואט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. שוטפים את החרוזים עם 0.5 מיליליטר נוספים של מאגר TEVC לאחר הכביסה.
שלב את השמונה בשפופרת אחת. אתה צריך להיות 1.5 מיליליטר של ELU שמונה בסך הכל. שמור ציטוט של שמונה TEV Elu כדי לזרז.
התאם את הציטוטים ל-25% TCA עם מאה אחוז TCA. לשם כך, הפרד את שמונה ה- LU בנפח 1.5 מיליליטר לשני צינורות של 750 מיקרוליטר כל אחד. הוסף 250 מיקרוליטר של 100% TCA לשפופרת.
התמיסה שלך צריכה להפוך לחלבית. לאחר מכן, הניחו אותו על קרח למשך 30 דקות. מערבולת מעת לעת של התערובת לאחר הדגירה.
סובב במהירות מרבית בצנטריפוגה השולחנית בחדר קר למשך 30 דקות. יש לשטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר אצטון קר כקרח המכיל 0.05 חומצה הידרוכלורית רגילה. לאחר מכן סובב במשך חמש דקות במהירות מקסימלית בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, יש לשטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר קר כקרח, אצטון ולהסתובב במשך חמש דקות במהירות מקסימלית בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, הסר בזהירות את האצטון והגלולה היבשה להכתמת כסף. השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של פעם אחת ממאגר דגימת ה-SDS.
אם אתם מתכננים להשתמש בחלבון המשקע לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסה, מומלץ לזרז באמצעות אתנול. כדי לעשות זאת תחילה, הוסף 20 מיקרוגרם של גליקוגן לאחר מכן דגימות מדללות חמש פעמים עם מאה אחוז אתנול והתאימו ל-50 מילי-מולרי נתרן ביקרבונט עם מלאי של 2.5 מולארי ב-pH 5.0. מערבבים את התמיסה על ידי היפוך הצינור.
תן לזה לעמוד שעתיים בטמפרטורת החדר. לבסוף, פצלו את התכולה לשני צינורות עינור. גלולה את החלבון המשקע על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 12, 000 GS בטמפרטורת החדר.
ה-aliquot שנשמר במהלך הליך הטיהור צריך לכלול את ליזט התא שנוקה מראש, השבר הקשור, השבר הלא קשור והשבר החמקמק. אנו ממליצים לנתח את תכולת החלבון של האליקוטים הנ"ל על ידי Western Blotting באמצעות נוגדן Antit TAP או צביעת כסף כדי לשקף את יעילות הקישור וההרחקה של הניסוי. בג'ל כתם כסף זה מטוהר SCS שתי ברזים באינטראקציה שלו, השותפים הודגמו והושוו לבקרה לא מתויגת בכתם המערבי הזה.
פלגים שונים שנלקחו במהלך הטיהור של SCS שני ברזים נותחו על ידי Western Blotting באמצעות נוגדן אנטיט ברז. שימו לב ש-SCS שני ברז נדד במשקל מולקולרי נמוך יותר לאחר אלוסיאן על ידי מחשוף פרוטאז TEV, ולא נותרו שני ברזים של S SCS על חרוזי ה-IgG לאחר הפליטה. זה אישר שהטיהור היה יעיל ביותר.
זה עתה הראינו לכם כיצד לטהר קומפלקסים של חלבונים על ידי טיהור זיקה עם חרוזי IgG. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להקפיד להתאים את מתח הבסיס ואת מתח הבקרה על ידי משקל פלה יבש לפני שתתחיל בהליך הטיהור. מכיוון ש-LAC מספק לנו מדידות בלתי מוטות ו-qued של שותפים לקשירת חלבונים, אנו מבצעים רק את השלב הראשון של טיהור הברז כדי למזער את אובדן הדגימה.
אם אתה חווה כמויות משמעותיות של כריכה לא ספציפית, ייתכן שתרצה לבצע את הפרוטוקול כולו, אותו ניתן למצוא במדריך לנמל האביב הקר. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
היי, בחייך, מארק. אה, לך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג טכניקת פרוטאומיקה כמותית לזיהוי מתחמי חלבון ב-Saccharomyces cerevisiae. המחקר משתמש בשיטת SILAC בשילוב עם טיהור באפיניות וספקטרומטריית מסה טנדם כדי לאתר את שותפי הקישור של חלבון ER Scs2p.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- פרוטאומיקה
- ביולוגיה של תאים
- ספקטרומטריית מסה
רקע
- הבנת אינטראקציות חלבון חיונית להבהרת פונקציות תאיות.
- SILAC (תיוג איזוטופי יציב על ידי חומצות אמינו בתרבית תאים) היא שיטה רבת עוצמה לפרוטאומיקה כמותית.
- טכניקות טיהור באפיניות משפרות את הספציפיות של זיהוי מתחמי חלבון.
- ספקטרומטריית מסה טנדם מאפשרת ניתוח מפורט של אינטראקציות חלבון.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה חזקה לזיהוי מתחמי חלבון בשמרים.
- לחקור את שותפי הקישור של חלבון ER Scs2p.
- לשפר את הספציפיות והרגישות של ניתוחים פרוטאומיים.
שיטות ששימשו
- גידול זני נבילה במדיום עם חומצות אמינו איזוטופיות רגילות וכבדות.
- ערבוב והריסה של זנים כדי להשיג ליזטים גולמיים.
- פינוי ליזטים באמצעות כדורי ספרוס והקשור לכדורי IgG.
- פינוי חלבונים מכדורי IgG לניתוח ספקטרומטריית מסה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של שותפי הקישור של Scs2p.
- הוכחת יעילות שיטת SILAC בפרוטאומיקה.
- השגת ספציפיות גבוהה בזיהוי מתחמי חלבון.
- תובנות לגבי תפקידו של Scs2p בתהליכים תאיים.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה משפרת את ההבנה של אינטראקציות חלבון בשמרים.
- התוצאות תורמות לתחום הרחב יותר של פרוטאומיקה וביולוגיה של תאים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לאוגניזמים ומתחמי חלבון נוספים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative proteomics enables unbiased identification of protein interaction networks, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By distinguishing specific binding partners from contaminants through isotopic labeling, the method enhances predictive confidence in protein complex analysis. This approach addresses a key challenge in studying membrane contact sites and lipid trafficking mechanisms relevant to cellular signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping protein-protein interactions at ER-PM membrane contact sites.
- Operational Value: Reduces false positives through SILAC-based quantification, improving target validation reliability.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying the molecular composition of lipid trafficking complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining the protein composition of ER-PM MCSs.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative interaction data suitable for assay standardization and scalability.
- Scientific Value: Facilitates preparation of disease-relevant models by identifying conserved eukaryotic proteins involved in lipid signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into lipid trafficking and signaling, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through reproducible complex identification across experimental replicates.
- Scientific Value: Supports preclinical model development by defining conserved protein complexes in yeast applicable to higher eukaryotes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing quantitative interaction data that informs target prioritization and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying Scs2p interaction partners in lipid trafficking networks.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein interaction profiles with quantitative readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Enables condition comparison through SILAC-based quantification, allowing teams to distinguish specific binding from background noise.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by identifying conserved eukaryotic proteins involved in membrane contact site function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics platform for studying protein complexes across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized SILAC labeling and affinity purification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative interaction data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction network confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative proteomics, mass spectrometry, and yeast culture techniques.
- Depends on instrumentation for SILAC labeling, affinity purification, and high-resolution LC-MS/MS analysis.
- Necessitates cross-team standardization of labeling efficiency, lysis protocols, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-yeast model systems or alternative lysis conditions.
- Includes practical limitations related to the dynamic range of detection and the need for high-abundance bait expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:45
Introduction
1:17
Preparation of the Bait and SILAC Control Strain
2:44
Grinding of Cells
4:05
Pre-clearing Cell Lysate
5:51
Eluting From IgG Beads by TEV Protease Cleavage
6:45
Trichloroacetic Acid (TCA) Precipitation
9:00
Sample Analysis by Western Blotting and/ or Silver Staining
8:11
EtOH/ Acetate Precipitation
9:30
Representative Results/ Outcome
10:15
Conclusion
