מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק
29 ביוני 2009
פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה Ca 2 + הדמיה של שריר חלק בתוך איברים מבודדים, לרבות: הכנת הרכישה, תמונה רקמות וניתוח נתונים.
ראשית, מכינים תמיסת העמסת סידן, מחממים ומבעבעים. שלפוחית השתן מנותחת, נפתחת, מוצמדת שטוחה ולוקחים רצועה של דטרוסור. רצועת הדטרוזור מתווספת לתמיסת הטעינה, מודגרת ונשטפת, מוצמדת שטוחה.
רצפת הסידן ארבע בתוך הרקמה מעוררת על ידי אור לייזר והאור הנפלט נלכד כתוצאה מכך. סרטים המורכבים ממסגרות בודדות מנותחים על ידי השוואת פריימים עוקבים. הרקע מופחת.
סף קצה התא קובע היכן ניתן למצוא אירועים ונלקח יחס בין מוחות עוקבים. אם האירועים הנותרים תואמים לקריטריונים שהוגדרו מראש, הם מודגשים ומסומנים בתווית. שלום, שמי ג'ון יאנג מהמעבדות של קית' בריין וטום קינן במחלקה לפרמקולוגיה באוניברסיטת אוקספורד.
אני רוב עמוס, גם הוא ממעבדות המוח והקאן ושמי קית' ברין. היום, ג'ון ורוב יראו לכם טכניקת הדמיית סידן בשריר חלק. אנו משתמשים בזה במעבדה שלנו כדי לחקור את שחרור המוליך העצבי מהעצבים האוטונומיים והשפעתו על שרירים חלקים.
אז בואו נתחיל. מחוון הסידן איבר ירוק, 4 88 BAFTA 1:00 AM מגיע בבקבוקונים של 500 מיקרוליטר המכילים 50 מיקרוגרם אבקה. להכנת מחוון הסידן ב-40 מיקרוליטר של תמיסת Onic F1 27 לאבקה ולנער בעדינות במשך 30 שניות לאחר מכן ב-460 מיקרוליטר של תמיסת מלח פיזיולוגית PSS, ולנער בעדינות למשך 30 שניות נוספות.
הפתרון הסופי, 10 מיקרו טוחנות של איבר ירוק. 4 88 BAFTA 1:00 AM מספק ארבע שיניים של 125 מיקרוליטר כל אחת. הימנע מחשיפה לאור ואחסן את התמיסה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לפני ניתוח הרקמה המעניינת.
הסר את מחוון הסידן מהמקפיא והפשיר בטמפרטורת החדר בזמן שמחוון הסידן הוא שלך. הניחו מיליליטר אחד של PSS במבחנה ובאמבט מים בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס. אבטח מבעבע לתוך המבחנה עם באנג, או שאתה יכול גם להשתמש בפרפיל ואז לבעבע עם תערובת של 95% חמצן עד 5% פחמן דו חמצני בקצב של בערך בועה אחת המופיעה בשנייה.
נתח את איבר השריר החלק מהחיה. במקרה זה, מדובר בשלפוחית השתן של עכבר. הנח את האיבר בכ-50 מילימטרים של PSS כדי לשטוף אותו לאחר שטיפת הרקמה, הסר בזהירות את רקמת השומן ורקמת החיבור.
נתח פתוח לפי סוג לוריאן השריר החלק עבור שלפוחית השתן. פתוח לאורך מצוואר שלפוחית השתן, קצה הפינוק לראש הכיפה. קצה הגולגולת הכן ארבע רצועות, באורך שישה עד שמונה מילימטרים ורוחב של מילימטר עד שני מילימטרים לאורך המשטח הגבי של חיתוך הריסר לכיוון צרורות השרירים הדומיננטיים.
הנח את הרקמה המנותחת ואת ה-PSS שלפני המלחמה והמבעבע כדי לטעון את מחוון הסידן ב-125 מיקרוליטר של 10 איברים מיקרו-מולאריים ירוקים, 4 88 B עד 1:00 AM לרקמה במבחנה ונער אותה מעט ביד כדי לערבב. החזר את הצינור לאמבט המים. המשיכו לבעבע וכסו את אמבט המים בדף נייר כסף.
הזמן שלוקח לרקמה מספקת לתפוס את מחוון הסידן משתנה בהתאם לגודל הרקמה ולעובי שכבת השריר החלק. לדוגמה, עבור העכבר דטרוזור ושורי העכברוש, זה 70 דקות. בעוד שעבור החולדה וה-VA של העכבר, אנו דוגרים במשך 120 דקות.
לאחר שהרקמה נטענה במחוון הסידן, ניתן להכין אותה למיקרוסקופיה. ראשית, שטפו את הטישו ב-PSS מבעבע למשך 10 דקות. לאחר מכן, הרכיבו את הטישו בכלי הכנה מרופד בשומר S.
מותח אותו מעט ליצירת יריעה שטוחה. הצמד את הרקמה באורכים קצרים. לדוגמא, שני מילימטר של חוט כסף בקוטר 25 עד 50 מיקרומטר והכנס את הפינים בזווית.
הימנע משימוש בפינים שאורכם עולה על כמה מילימטרים מכיוון שהם עלולים לשרוט את המטרה. הצמדה זהירה של הרקמה חשובה ממזעור הספונטניות של הרקמה וכדי להקל על איתור אתר מתאים להדמיה. לאחר הצמדת הרקמה, מקם את צלחת ההכנה על שלב המיקרוסקופ.
היזהר שה-PSS לא יברח מהאזור המרופד במגן הסיל של הצלחת. מכיוון שהדבר עלול להוביל לכיסוי שטח גדול ב-PSS. כאשר הסופר-פיוז'ן יתחיל למטרות הדגמה, השלבים הבאים יבוצעו באור.
שימו לב שניסויים אלה מבוצעים בדרך כלל בחושך. הפעל את המשאבה על מנת להתיך את התכשיר. עם PSS משתמשים לעתים קרובות בקצב של 100 מיליליטר לשעה.
הפעל את יחידת החימום, הנח את צינורות הזרימה והיציאה ובדיקת הטמפרטורה על צלחת ההכנה של קיבוע כל אחד לרצועת המתכת על ידי המגנט בבסיסו. גובה קצה צינור היציאה יקבע את עומק ה-PSS. הקפד לוודא שהזרם היוצא אכן מסיר PSS מכיוון שלפעמים הוא לא.
בתחילה הגדר את הטמפרטורה ביחידת החימום כך שתגיע לטמפרטורת הרצויה של בין 33 ל -35 מעלות צלזיוס. אפשר לרקמה להתאזן למשך 10 דקות לפחות עם יעד הספק נמוך. 10 או 20 פעמים.
השתמש ב-epi fluorescence או מרגש עם אור כחול כדי לראות את השריר החלק ולזהות אזור מתאים לניטור. מאז חשיפה לעירור, תאורה תהפוך את המחוון לפוטו. הימנע משימוש במשך יותר מכמה שניות בכל פעם.
הימנע מראייה עם מבנים בהירים מכיוון שהם עלולים לגרום למספר גבוה של תוצאות חיוביות שגויות באלגוריתם זיהוי התמונה. נסו לבחור אתר עם מינימום תנועה ומספר רב של תאי שריר חלק בשטח. לאחר שבחרת את האתר לתמונה, עבור למטרה בעלת עוצמה גבוהה יותר כגון 40 x.
סובב את הבמה או את הציר האופטי כך שתא השריר החלק או התאים יהיו אופקיים. זה מקביל לציר הסריקה המהירה. תאי השריר החלק מוכנים כעת להדמיה במיקרוסקופיה קונפוקלית.
בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי שני זקופים של Leica SP. סגור את חור הסיכה לדיסק אוורירי אחד. הגדר את עוצמת הלייזר בין 25 ל-35% במסנן הניתן לכוונון של custo.
ערך זה הוא פשרה בין בהירות להלבנת תמונות. כדי להתכונן לניתוח נתונים, הורד והתקן את image J.הורד את הגרסה הספציפית לפלטפורמה ולאחר מכן עדכן לגרסה העדכנית ביותר על ידי הורדת קובץ ה-jar העדכני ביותר של ImageJ כדי להחליף את הקובץ הישן. לאחר מכן, הורד את קובץ צנצנת הסופר של Excel והתקן בספריית צנצנת התוספים.
העתק קבצים אלה לספריית התוספים. התקן כל אחד מקבצי ה- Script הללו באמצעות פקודות המאקרו של התוספים. התקנת פונקציה של תמונה J.התוכנה עבור Leica SP שני מיקרוסקופ קונפוקלי שאנו משתמשים בהם נקרא Leica.
LCS שומרת פריימים בודדים של כל סדרה כקובץ נפרד. לשחזר את הסדרה. ודא שכל המסגרות שיש לשחזר נמצאות בתיקיה אחת.
לדוגמה, tiffs של תיקיית נתונים. לאחר מכן בחר את המאקרו Leica SP two stacker מתפריט פקודות המאקרו של התוספים. בחר את ספריית הבסיס בתיקיית הנתונים של מקרה זה.
בחר את התיקיה הרצויה מהרשימה הנפתחת. במקרה זה, tiffs בוחרים ספריית פלט או יוצרים ספרייה חדשה. לדוגמה, ערימות של תיקיות נתונים.
לאחר מכן התסריט ישחזר סדרות מפריימים בודדים כדי לתקן מתנועה. אנו משתמשים באלגוריתם זמין בחינם שמיישר או מתאים פריימים בתוך מחסנית הורדות סדרה, אסדה וטורבו רג. העתק/י את הקבצים עבור כל אחד מהם לתיקיית האוספים.
טען ערימה לעיבוד ולאחר מכן עבור למסגרת המציגה בבירור את תחום העניין. מסגרות אחרות יושרו למסגרת ייחוס זו. לאחר מכן, עבור לערימות תוספים.
רישום מחסנית. נסה כל אחת מהטרנספורמציות השונות כדי לקבוע מה הכי יעיל עבור כל אתר. גורמים מדומים המשפיעים על זיהוי מעברי סידן ישתנו על ידי מדידת תכונות מסוימות, פרמטרים חלקיקים של כל אתר.
הרגישות והספציפיות של הזיהוי מוגברות. לפיכך, עבור כל אתר, נחשב סף לסף מופחת עבור יחס וסף קצה התא. כדי להתחיל, עבור אל תוספים, פקודות מאקרו, התקן ובחר jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. לאחר מכן עבור לערימת טעינת פקודות מאקרו של תוספים.
בחר סדרה וחשב את פרמטרי החלקיקים הבאים. כדי לחשב את הסף לחיסור, בחר אזור עניין מלבני על פני מה שאתה מאמין שהוא מדידת רקע. רשום את הממוצע כדי לחשב את סף היחס, בחר אזור עניין מלבני סביב אזור שטוח אופטית של תא השריר החלק או התאים.
מדוד, רשום, ממוצע וסטיית תקן. חזור על התהליך פעמיים נוספות, או שאתה יכול לצייר שלוש תיבות בבת אחת על ידי לחיצה על Shift. לחשב להוסיף הערה למטה את הסף ליחס.
חשב כסטיית התקן חלקי הממוצע הוסף אחד, ולאחר מכן הכפל את התוצאה ב- 32. חישוב ממוצע של ערכים משלושת השכפולים, הפקטור של 32 נחוץ כדי להסביר את אלגוריתם היחס שבו לא ממופה שינוי ממסגרת ההליך לערך שלם של 32. זה נותן טווח דינמי טוב לזיהוי עליות וירידות ביחס.
לתמונה של שמונה סיביות, בחרו סף התאמת תמונה. בחר שחור-לבן. הגדר מתחת למגבלת השקופית העליונה ורשום את הערך המתאים.
זה מימין למחוון. רק אירועים המתרחשים באזורים השחורים ייספרו. לחץ על איפוס.
כעת, לאחר שחושב הסף עבור סף הפחתת היחס וסף קצה המכירה, אנו יכולים לנתח את ערימות התמונות. קבע את מיקום הערימות שיש לנתח. בחר סדרה אחת בלבד בשלב זה.
זה הקובץ הראשון, והקובץ האחרון צריך להיות זהה. לאחר מכן בחר מיקום לפלט של קובצי נתונים ואוספים. לדוגמה, פלט תיקיית נתונים.
הזן ערכי סף עבור הפחתת הסף עבור יחס וסף קצה מכירה. השאר הגדרות אחרות בערכי ברירת המחדל שלהן. האלגוריתם יפיק חלון כפול שבו הסדרה המעובדת מוצגת משמאל והמקור מימין.
פתח קובץ זה מתיקיית הפלט ועבור עליו בזהירות כדי להעריך את מספר התוצאות החיוביות השגויות ואת המקרים שבהם לא זוהו אירועים הנראים לעין. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel המפרט את המאפיינים של האירוע שזוהה כגון אזור משרעת, ומיקום תוצאות חיוביות שגויות שזוהו על ידי סקירת קבצי התמונה שהאלגוריתם מוציא ניתן להסיר באופן ידני מקובץ Excel זה. למרות שצריכים להיות לך קריטריונים נוקשים לעשות זאת.
זהו סרט על ארעיות סידן בשריר חלק. בדוגמה זו, הסרט מורכב מ-100 פריימים בודדים שנרכשו בחמישה הרץ. היינו רוכשים רבים מהסרטים האלה בכל ניסוי כאשר נחקור, למשל, את ההשפעה של תרופה מסוימת על תדירות הסידן החולף.
כאן אנו רואים מספר רב של סידן חולף ספונטני בתאי השריר החלק. התוצאה של אלגוריתם זיהוי החלקיקים מוצגת כאן. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ אקסל המפרט את המאפיינים של האירוע שזוהה כגון שטח משרעת ומיקום.
לכן הדגמנו שיטה להדמיית סידן טראנס באיברי שריר חלק כמו שלפוחית השתן, והדגמנו דרך שבה אנו מנתחים את מעברי הסידן האלה באמצעות אלגוריתם שיצרנו במעבדה. הדברים החשובים שיש לזכור הם להכין את הרקמה היטב להדמיית הסידן. אז במקרה של הרקמה שהדגמנו היום, זה הסרת רקמת חיבור והסרת כל שומן שעלול לטשטש את התחום.
חשוב גם להצמיד את הרקמה לסדין שטוח. ובכן, בהצלחה בניסויים שלכם ותודה על הצפייה.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט שיטות לדימות Ca2+ ברזולוציה גבוהה של שריר חלק בתוך איברים מבודדים. הוא עוסק בהכנת רקמות, ברכישת תמונות ובניתוח נתונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה
- טכניקות דימות
רקע
- דימות סידן הוא חיוני להבנת תפקוד השריר החלק.
- הוא מאפשר לחוקרים ללמוד על שחרור מתווכי חוליה עצבית והשפעותיהם.
- טכניקות דימות ברזולוציה גבוהה משפרות את דיוק הנתונים.
- הכנות של איברים מבודדים מספקות תנאים ניסיוניים מבוקרים.
מטרת המחקר
- להדגים טכניקה של דימות סידן בשריר חלק.
- לנתח את השפעותיהם של מוליכים עצביים על פעילות השריר החלק.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים בתחום.
שיטות בשימוש
- הכנת תמיסת טעינה של סידן.
- דיסקציה והכנה של רקמת שריר חלק.
- טעינה ודגירה של אינדיקטור לסידן.
- טכניקות מיקרוסקופיה לדימוג וניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- טעינה מוצלחת של אינדיקטורים לסידן ברקמת שריר חלק.
- דמויות ברזולוציה גבוהה שצולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- ניתוח הנתונים חשף אירועי איתות סידן משמעותיים.
- הפרוטוקול תוקף לשימוש במחקרים נוספים של פיזיולוגיה של השריר החלק.
מסקנות
- השיטות המתוארות מאפשרות מחקר מפורט של תפקוד השריר החלק.
- דימוי סידן יעיל לניתוח השפעות של מוליכים עצביים.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה לרקמות שריר חלק שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
שיטה זו מאפשרת זיהוי ברזולוציה גבוהה של מעברים קצרים (transients) מוקדיים של Ca2+ בשריר חלק, ומספקת קריאה אופטית ישירה של שחרור מוליכים עצביים מעצבים אוטונומיים. על ידי לכידה של אירועי Ca2+ תת-תאיים בדיוק מרחבי-זמני, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף מטרות עבור מודולטורים של GPCR ותעלות יונים המשפיעים על השריר הדטרוסור, צינור הד deferens ורקמות סינציטליות אחרות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור סיגנל פורינרגי לתגובות רקמתיות תפקודיות, ללא הסתמכות על אלקטרופיזיולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני שחרור מוליכים עצביים פורנינרגיים באמצעות זיהוי רגעי של Ca2+ מקומי בשריר חלק.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של רספטורי P2X1 ומסלולי איתות פורנינרגיים קשורים ברקמה רלוונטית למחלה.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור מעורבות ליגנד-רספטור לאיתות Ca2+ במורד המסלול בהקשר של רקמה טבעית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים (תדירות, מיקום, אמפליטודה) של תנודות Ca2+ לצורך אפיון השפעת תרכובות.
- שחזוריות: משתמש ביישור תמונות אוטומטי ובזיהוי מבוסס סף כדי למזער שונות בין מפגשי הדמיה.
- יכולת הרחבה: מאפשר ניטור סימולטני של מספר אתרי שחרור בשדה ראייה אחד, ובכך מגביר את התפוקה להערכת פעילות ספציפית לאתר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל סיגנלינג נוירו-אפקטורי במערכת השתן התחתונה וברקמות רבייתיות, שבהן קוטרנסמיסיה פורינית מווסתת את כושר התכווצות השריר.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין אירועי שחרור מ neurotransmitter אקוטיים לבין תגובות תפקודיות של רקמות במודלים פרה-קליניים של שלפוחית שתן פעילה יתר ומחלות מוטיליות.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות go/no-go על ידי כימות תדירות הטרנזיאנטים של Ca2+ המושרים על ידי אגוניסט, כסמן ביולוגי למעורבות של המסלול.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת מעורבות המטרה ועד לתיקוף תפקודי ברקמה טבעית, ובמיוחד עבור מווסתים של מערכת העצבים האוטונומית ותרופיתים המכוונים לשריר חלק.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנוני שחרור מוליכים עצביים ואותות Ca2+ ספציפיים למסלול ברקמה שלמה.
- סריקה: מאפשרת פיתוח של בדיקות לזיהוי השפעות של תרכובות על פרמטרים של מעברים זמניים של Ca2+, ספונטניים ומעוררים.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות (אמפליטודה, שטח, מיקום) המאפשרות השוואה בין תנאים ניסיוניים לבין יעילות התרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין טרגט מולקולרי לתוצאות תפקודיות ברמת הרקמה בהכנות של שריר חלק הרלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לדימוי ואנליזה לצורך חקר תמסורת נוירו-אפקטורית במספר מיטות של שריר חלק.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בצימוד שבין מוליכים עצביים לשריר חלק, על ידי אספקת ראיות אופטיות ישירות למקורם של תהליכי Ca2+ חולפים (transients).
- ערך תפעולי: מספק גילוי סטנדרטי ו可שחזור של אירועי Ca2+ סטוכסטיים באמצעות סף אלגוריתמי ויישור פריימים.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי קישור מודולציה של המטרה לאירועי איתות מדידים ברמת הרקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות בהתאם לסיכון, בהסתמך על יעילותן בהשראת או עיכוב של תהליכי Ca2+ פורינרגיים חולפים.
שיקולי יישום
- מומחיות בטעינה של אינדיקטורים ל-Ca2+, בדיסקציה של רקמות ובהגדרת מיקרוסקופ קונפוקאלי.
- גישה למיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר ובקרת סביבה עבור פרפוזיה של רקמות.
- סטנדרטיזציה של תהליכי ניתוח תמונות, כולל חיסור רקע, תיקון תנועה וכיול סף (threshold).
- שיקולי התאמה עבור סוגים שונים של שריר חלק (למשל, צינור הד deferredens, עורק) בהתבסס על עובי הרקמה וקינטיקת הטעינה.
- מגבלה: תדירות אירועים חולפים ספונטניים עשויה לדרוש ייצוב של קו הבסיס ונורמליזציה של השפעת התרופה.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Introduction
1:30
Preparing the Ca2+ Indicator, Dissecting the Tissue, and Loading the Ca2+ Indicator
5:05
Preparing the 'Ca2+ Loaded' Tissue for Microscopy
8:44
Preparing for Analysis and Correcting for Movement
11:57
Particle Detection Algorithm
16:53
Conclusion
