Name: מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: למד טכניקת דימות סידן ברזולוציה גבוהה בשריר חלק של שלפוחית השתן מבודדת. הפרוטוקול מכסה הכנת רקמה, טעינת מדד סידן, מיקרוסקופיית קונפוקל וניתוח נתונים לאיתור אירועי סיגנל סידן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

האמון Wellcome סיפקה תמיכה כספית (פרס VIP כדי JSY ואת 074,128 עמיתי מחקר כדי KLB). המועצה למחקר רפואי מלגת הלימודים כדי RJA Leica_SP2_Stacker, אלגוריתם המשמש לייבוא ​​המריבות על &quot;שחזור&quot; לסדרה, המבוססת על Leica_tiff_sequence, תוסף לקריאה לייקה SP2 המריבות בתוך ImageJ, שפותחה על ידי טוני קולינס בשימוש באישורו שלו. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg ו TurboReg, אלגוריתמים המשמשים הנכון עבור התנועה של רקמות, המבוססים על ה &#39;venaz ועמיתיו (1998) 9. Excel_writer.jar נכתב על ידי קורט דה ווס (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, אלגוריתם זיהוי החלקיקים, מבוסס על אלגוריתם שנכתב על ידי המוח KL ומפורט בעבר 5.

חלק 1: הכנת Ca 2 + מדד (אורגון גרין 488 BAPTA, 01:00) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורגון גרין 488 BAPTA-01:00 מגיע 500 מבחנות μl כמו כמות קטנה (50 מיקרוגרם) של אבקה. הוסף 40 μl Pluronic F-127 הפתרון אבקה, מנערים בעדינות למשך 30 שניות, ולאחר מכן להוסיף 460 PSS μl, וללחוץ בעדינות במשך 30 s. הפתרון הסופי, 10 מיקרומטר אורגון גרין 488 BAPTA-01:00, מספק 4 x 125 aliquots μl. המנעו מחשיפה לאור החנות ב -20 C. </li></ol> חלק 2: Ca 2 + טעינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Ca 2 + מדד (אורגון גרין 488 BAPTA, 01:00) מהמקפיא (-20 C) ולאפשר להפשיר בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מ&quot;ל של PSS במבחנה ובמקום באמבט מים. הבועה עם 95% O 2 / 5% CO 2 בקצב של בועה סביב 1 המופיעים לשנייה. Bubbler צריך להיות מאובטח לתוך במבחנה, למשל עם פקק או עם Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את הרקמה מן החיה, בצלחת פטרי Sylgard מצופה, להסיר בזהירות רקמת חיבור. ללא קשר לסוג האיבר שריר חלק, PSS יש להחליף כל 10 דקות ורקמות יש לשטוף היטב (למשל על ידי החלפת PSS שלוש פעמים) לנתיחה שלאחר מכן. במשך הזרע הזרע: לשקול חיתוך איבר באורך דרכים לייצר גיליון של רקמות. עבור בשלפוחית ​​השתן: לפתוח longitudinally מהצוואר שלפוחית ​​השתן (האחורי) לחלק העליון של הכיפה (הקדמי). הכינו ארבעה פסים, 6 - 8 מ&quot;מ ארוך 1-2 מ&quot;מ רוחב, על פני השטח הגבי של detrusor, חיתוך לכיוון של חבילות השריר הדומיננטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום גזור רקמה ב &#39;טרום התחמם מבעבע &quot;PSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 125 μl של 10 מיקרומטר אורגון גרין 488 BAPTA-1 בבוקר עד במבחנה ולתת לנער קטן, ביד, לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות חיים מבעבע ולעזוב, מכוסה בנייר כסף. הפעם הוא לוקח רקמות מספיק לקחת את Ca 2 + אינדיקטור משתנה בהתאם לגודל של רקמות עובי שכבת השריר החלק. לדוגמה: 70 דקות (עכבר detrusor, anococcygeus חולדה) עד 120 דקות (detrusor חולדה, מוליכי הזרע העכבר). </li></ol> חלק 3: הכנת &quot;Ca 2 + טעון&quot; רקמה במיקרוסקופ זהירות מצמיד הרקמה הוא הכרחי על מנת לצמצם תנועה ספונטנית של הרקמות (תכונה של הדמיה של תאים שריר חלק מרקמת תמים יחסית) כדי להקל על מיקום האתר מתאים הדמיה (כמו פיסה שטוחה של רקמה ניתן שנסקרו בשני ממדים, במקום שלושה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הרקמה PSS מבעבע במשך לפחות 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בצלחת Sylgard מצופה הכנה, מתיחת הרקמה (במעט) כדי ליצור דף שטוח. הימנע משימוש ארוך &quot;סיכות&quot; שעלולים לשרוט את המטרה: להשתמש באורכים קצרים במקום 25-50 מיקרומטר קוטר חוט כסף כמו &quot;סיכות&quot; והכנס בזווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את צלחת הכנה על הבמה מיקרוסקופ, נזהר על מנת להבטיח כי PSS לא לברוח מהאזור Sylgard מצופה של המנה (כמו זה עשוי להוביל שטח גדול להיות מכוסה PSS, כאשר superfusion מתחיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה על מנת superfuse ההכנה עם PSS. קצב של 100 מ&quot;ל לשעה מועסק לעתים קרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את יחידת החימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את יבוא ו יצוא צינורות בדיקה הטמפרטורה על צלחת ההכנה (הדבקת לכל רצועת מתכת על ידי המגנט על בסיסו). גובה קצה הצינור יצוא יקבע את עומק PSS. תיזהר על מנת להבטיח כי יצוא הוא בעצם הסרת PSS (כפי שהיא עושה לעיתים לא בהתחלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה על יחידת החימום כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה, למשל 33-35 ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הרקמה לאזן לפחות 10 דקות. </li></ol> חלק 4: מבחר האתר תמונה חשיפה תאורה עירור יהיה photobleach מחוון, לכן הימנע משימוש במשך יותר מכמה שניות בכל פעם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מטרה צריכת חשמל נמוכה (10x או 20x) להשתמש epifluorescence, מרגש עם אור כחול, כדי להציג את שריר חלק לזיהוי אזור מתאים לפקח. נסו לבחור באתר מבוסס על: תנועה (שאמור להיות מינימלי) ומספר לתאי שריר חלק בתחום. &quot;מבנים&quot; ברייט עלול לגרום מספר גבוה של &quot;תוצאות חיוביות שגויות&quot; באלגוריתם זיהוי תמונה, כדי להימנע באתרים עם מספר גדול של (למשל) בתאי אפיתל או fibroblasts וביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר אל המטרה חשמל גבוה (40X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הבמה או את הציר האופטי כך תא שריר חלק (ים) שקרים האופקי (כלומר מקביל לציר סריקה מהירה). </li></ol> חלק 5: מיקרוסקופיה confocal הפרטים של איך מיקרוסקופ confocal הוא &quot;להקים&quot; הם ספציפיים לכל סוג המיקרוסקופ, אבלהשיקולים העיקריים הם: מהירות (מינימום של 5 הרץ נדרש רוב Ca 2 + הארעיים); רזולוציה וגודל השדה (שניהם נסחרים-off עם מהירות). חלק פרוטוקול הבאה היא ספציפית מיקרוסקופ הלייקה SP2 confocal זקוף. פרוטוקול טיפוסית: 100 סדרה מסגרת, רכשה ב 5 הרץ (256 x 256 פיקסלים, כ 100 x 100 מיקרומטר.) או 13.5 הרץ (256 x 64 פיקסלים, כ 100 x 25 מיקרומטר.). ראש סריקה להגדיר להעביר דו directionally (על מנת למקסם את מהירות הרכישה) ולרכוש ב 1000 הרץ בכל שורה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את חריר ל &#39;דיסק אוורירי&#39; אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת (488 ננומטר) לייזר הכוח בין 25 ו 35% על AOTF; ערך זה trade-off בין הבהירות photobleaching. (האחרון להיות בעיה מסוימת במהלך הקלטות ארוך.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת שש סדרות בכל אתר, 4-6 אתרים לכל &quot;טיפול&quot;. זה נפוץ לכוון לאותו צג שישה אתרים טרום תרופה (&quot;מלאה&quot; כלומר) ופוסט התרופה, למרות photobleaching משמעותי עלול לגרום הנסיין לסטות הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה חיוני עם Ca 2 + הדמיה כי &quot;שולטת זמן&quot; מבוצעות. </li></ol> חלק 6: הכנה לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד והתקן J תמונה מתוך: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. הורד את הגרסה פלטפורמה ספציפית, ולאחר מכן לעדכן לגרסה העדכנית ביותר על ידי הורדת הקובץ imageJ.jar האחרונים http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, להחליף את הקובץ הישן. Apple משתמשי מקינטוש: אם זה פועל לאט, ודא שאתה משתמש בגירסה העדכנית של מכונת ג&#39;אווה וירטואלית (JVM) זמין מ Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד Excel_writer.jar מ: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html ולהתקין לתוך תוספים [מדריך]&gt; מדריך צנצנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את הקבצים הבאים לתוך ספריית Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. התקן כל התסריטים הללו באמצעות תוספים [תפריט]&gt; מאקרו&gt; התקן ... פונקציה של ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים SP2 לייקה מיקרוסקופ confocal, התוכנה (לייקה LCS) אשר מייצר כל סדרה כמו &quot;סרט&quot; יחיד לצפייה בתוך התוכנה, אבל חוסך כמו מסגרות בודדים. כדי לשחזר מסגרות לסדרה: (i) יש לוודא כי כל &quot;מסגרות&quot; להיות משוחזר הם בתיקייה אחת (למשל &quot;DataFolder&gt; המריבות&quot;). (Ii) בחירת תוספים [תפריט]&gt; מאקרו&gt; Leica_SP2_Stacker. בחר את ספריית השורש (למשל &quot;DataFolder &#39;). בחר את התיקיה הרצויה מהרשימה הנפתחת (&quot;המריבות /&quot; למשל). בחר את ספריית הפלט או ליצור אחד חדש (&quot;DataFolder&gt; סטאקס&quot; למשל). התסריט אז יהיה לשחזר סדרה של מסגרות בודדים. </li></ol> חלק 7: תיקון לתנועה למרות התנועה של האתר הדמיה עשויה להיות ממוזער עם מצמיד טוב רקמות באופן שווה, מתוח, כמה איברים התכווצויות שריר חלק תערוכה ספונטנית כי לא ניתן לבטל על ידי זהיר מצמיד לבד. כאן אנו מתארים את השימוש של אלגוריתם זמין באופן חופשי כי מיישרת גפרורים או מסגרות בתוך שורה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד &quot;StackReg&quot; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ו &#39;TurboReg &quot;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן כל לתוך ספריית Plugins באמצעות תוספים&gt; פקודות מאקרו&gt; התקן ... </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען ערימה להיות מעובד (File&gt; Open ...) ולאחר מכן לעבור למסגרת זה מראה בבירור את תחום עניין. מסגרות אחרות יהיה מיושר מסגרת התייחסות זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוספים&gt; סטאקס&gt; StackReg. נסו כל אחד &quot;טרנספורמציות&quot; שונים (תרגום כלומר, גוף קשיח, סיבוב Scaled, המאוחד) כדי לקבוע מה הוא היעיל ביותר. (פרטים נוספים: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> חלק 8: אלגוריתם זיהוי חלקיקים עבור כל &quot;אתר&quot; צילמו, גורמים משתנים המשפיעים על זיהוי של Ca 2 + הארעיים. באמצעות מדידת מאפיינים מסוימים של כל אתר (&#39;פרמטרים החלקיקים &quot;- להלן מפורט), תהליך הזיהוי הקל. לכן עבור כל אתר, אחת מחשבת &quot;סף מופחתים&quot;, &quot;סף יחס &#39;ו&#39; קצה תא הסף&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוספים [תפריט]&gt; מאקרו&gt; התקן ... ובחר &#39;JNCT0.08Release.ijm &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוספים [תפריט]&gt; מאקרו&gt; לטעון מחסנית (קיצור: l). בחר סדרה ולחשב פרמטרים החלקיקים: <ol style="list-style:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א סף מופחתים (רקע =) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ROI מלבני על מה שאתה מאמין להיות &quot;רקע&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד (קיצור: מ &#39;). הערה למטה מתכוון. <ol style="list-style:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב חישוב סף עבור יחס </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מלבניההחזר על ההשקעה באזור שטוח אופטית של התא (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד (קיצור: מ &#39;). הערה סטייה ממוצעת ומטה סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור נוספת פעמיים או שאתה יכול לצייר שלוש קופסאות בבת אחת על ידי לחיצה על &quot;שינוי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב לרשום סף עבור יחס = (1 + SD / אומר) x 32, ממוצע הערכים משלושת משכפל / אתרים. <ol style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג קצה סלולריים הסף </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה&gt; סטאקס&gt; Z פרויקט ... בחר את סוג הקרנה: &quot;ממוצע עוצמת&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה&gt; התאם סף&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שחור ולבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת &quot;תחת&quot; (המחוון העליון) להגביל לרשום את הערך המתאים (מימין המחוון). רק אירועים המתרחשים באזורים שחור ייספרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;איפוס&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את ערימות (קיצור: 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר רק סדרה אחת בשלב זה, כלומר &quot;הקובץ הראשון &#39;ו&#39; הקובץ האחרון&quot; צריך להיות זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן ערכים של &#39;הסף מחוסר&#39; סף עבור יחס &#39;ו&#39; קצה תא הסף &quot;. עזוב הגדרות אחרות ב ערכי ברירת המחדל שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האלגוריתם יהיה לייצר חלון כפול חלונית שבה סדרה מעובד מוצג משמאל המקורית בצד ימין. בזהירות לעבור את זה כדי להעריך את מספר תוצאות חיוביות שגויות לבין מקרים שבהם האירועים, נראה בעין, לא זוהו. כדי לקבל זיהוי מדויק יותר של Ca 2 + הארעיים ייתכן שיהיה צורך להתאים במקצת חלק מה &#39;פרמטרים החלקיקים &quot;. אמנם התהליך עשוי להיראות &quot;פגע להחמיץ&quot; קצת על הניסיון הראשון, אחד במהירות מקבל תחושה לגבי מה הפרמטרים הם המפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel פרטים מאפיינים של האירוע זיהה (כגון אזור משרעת, ואת המיקום). &quot;תוצאות חיוביות שגויות&quot; - מזוהה על ידי בדיקת קבצי תמונה כי פלטי אלגוריתם (למשל צעד 8.17) - ניתן להסיר, ביד, זה מקובץ Excel. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

נעשו מאמצים לצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים והסבל שלהם; כל הניסויים בוצעו בהתאם בעלי חיים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986 ואת הקהילה האירופית Council Directive 86/09/EEC.

הבחירה של פלורסנט Ca 2 + אינדיקטור אורגון גרין 488 BAPTA-01:00 נבחר Ca 2 + אינדיקטור כי (i) הוא בהיר לעומת אינדיקטורים אחרים (למשל Fluo-4 ו הירוק סידן) 1 (ii) הוא רגיש לשינויים פיזיולוגיים ריכוז Ca 2 + עם ד K בסדר גודל דומה 1 אל תאיים Ca 2 + בריכוז [Ca 2 +] i (למשל של מוליכי הזרע 2) (iii) המון תאים רבים שריר חלק, מה שמאפשר לתא השריר החלק צימוד להיות במעקב. עם זאת, אורגון גרין 488 BAPTA-01:00 הוא לא ratioable Ca 2 + אינדיקטור, וככזה לא יכול בקלות לשמש כדי לקבוע המוחלט [Ca 2 +] אני. יתר על כן, היא עשויה גם חיץ Ca 2 + אם בריכוזים גבוהים הופך רווי שינויים משרעת גבוהה [Ca 2 +] אני. עיכוב של contractility ספונטני Contractility ספונטנית של איברים שריר חלק עשוי להיות מופחת פרמקולוגית, כגון על ידי חסימת התנועה של Ca 2 + דרך סוג L-Ca 2 + ערוצי (למשל על ידי: nifedipine 3; diltiazem 4). שים לב כי תרופות אלו יהיה לצמצם במידה ניכרת את המשרעת של כל תא Ca 2 + גלי / הארעיים. התכווצות של הזרע הזרע נובע משילוב של עצבית purinergic בעיקר noradrenergic. מיקוד Ca 2 + הארעיים ברקמה זו, עם זאת, רגישות המצור קולטן noradrenergic (למשל α 1 adrenoceptor, על ידי prazosin 5), כך התנועה עשוי להיות מופחת מבלי להשפיע על מוקדי Ca 2 + הארעיים. לחילופין, ניתן למנוע התכווצות &#39;במורד הזרם&#39; דרך עיכוב של שרירן למשל שרשרת אור קינאז ידי wortmannin 6. מסקנות ניטור Ca 2 + הקרינה בבית submicron רזולוציה היא טכניקה רבת עוצמה כדי לחקור את הפוסט junctional ההשפעות של שחרור הנוירוטרנסמיטר 5,7 ו שחרורו של Ca 2 + מחנויות פנימיים (למשל &quot;ניצוצות&quot; 8). הניתוח של Ca 2 + הארעיים באמצעות מתודולוגיה המפורטים כאן היא חסכונית בהשוואה, זמין מסחרית חבילות ניתוח התמונה ומאפשר תפורים אישית באמצעות ניתוח בכתב plugins Java עבור ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>תמיסת Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>תמיסה 20% ב-DMSO</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי אנכי Leica SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחן אוויר (&amp;#8216;עמדת עבודה מבודדת רעידות&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>אלסטומר Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מיקוד ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca 2 + הדמיה של שריר חלק מספק תובנה מנגנוני הסלולר כי לא עלולה לגרום לשינויים של פוטנציאל הממברנה, כמו שחרורו של Ca 2 + מחנויות פנימי, ומאפשר מספר תאים בו זמנית כדי להיות במעקב על מנת להעריך, למשל, צימוד סינסיציאלי רקמות. Subcellular Ca 2 + הארעיים נפוצים שריר חלק, אך קשה למדוד במדויק בגלל הבעיות שנגרמות על ידי התרחשות סטוכסטיים שלהם, על פני שדה רחב של נוף לעתים קרובות, באיבר שהוא נוטה להתכווץ. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו סדרה של פרוטוקולים הדמיה רוטינות ניתוח לרכוש ולאחר מכן לנתח, באופן אוטומטי, את תדירות, מיקום משרעת של אירועים כאלה. בעוד גישה זו ניתן להחיל בהקשרים אחרים, העבודה שלנו כרוך זיהוי של המקומיים purinergic Ca 2 + הארעיים לאיתור לשחרר משדר עם רזולוציה submicron. ה-ATP משוחרר כמו cotransmitter מן העצבים האוטונומית, שם הוא נקשר לקולטנים P2X1 על השריר החלק של detrusor ואת הזרע הזרע. Ca 2 + מזין את השרירים החלקים, וכתוצאה מכך purinergic neuroeffector Ca 2 + הארעיים (NCTs). מוקד Ca 2 + הארעיים לאפשר ניטור אופטי של שחרור הנוירוטרנסמיטר באופן יש יתרונות רבים על electrophysiology. מלבד ההחלטה מרחבית השתפרו מאוד, הקלטה אופטי יש יתרון נוסף המאפשר הקלטה של ​​שחרור משדר להבדיל מאתרים רבים בו זמנית. יתר על כן, מטוס אופטי של המוקד הוא קל יותר לתחזק או לתקן במהלך סדרת הקלטה ארוך יותר הוא מחדש של microelectrode חד תאיים. לסיכום, שיטת הדמיה של Ca 2 + הקרינה מתוארת בו פרטים הכנת הרקמה, ורכישת וניתוח של נתונים. אנו המתאר את השימוש של מספר תסריטים לניתוח כזה Ca 2 + הארעיים.

פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; הדמיה של שריר חלק בתוך איברים מבודדים, לרבות: הכנת הרכישה, תמונה רקמות וניתוח נתונים.

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

דימות Ca2+ של שריר חלק מספק תובנות לגבי מנגנונים תאיים שעשויים שלא להוביל לשינויים בפוטנציאל הממברנה, כגון שחרור של Ca2+ ...

ראשית, מכינים תמיסת טעינה של סידן, מחממים אותה ומבעבעים אותה. מבודדים את שלפוחית השתן, פותחים אותה, מקבעים אותה בצורה שטוחה בעזרת סיכות, וגוזרים פס רצועה של שריר הדטרוסור. מוסיפים את רצועת הדטרוסור לתמיסת הטעינה, מדגירים אותה, שוטפים אותה ומקבעים אותה בצורה שטוחה בעזרת סיכות.רמת הסידן הבסיסית ברקשה תעוררה על ידי אור לייזר, והאור הנפלט נקלט. סרטים המורכבים מפריימים בודדים מנותחים על ידי השוואה בין פריימים עוקבים. הרקע מופחת.סף קצה התא קובע היכן ניתן למצוא אירועים, ונלקח יחס בין מוחות עוקבים. אם האירועים שנותרו תואמים לקריטריונים שהוגדרו מראש, הם מודגשים ומסומנים. שלום, שמי ג'ון יאנג מהמעבדות של קית' בריין וטום קינאן במחלקה לפארמקולוגיה, אוניברסיטת אוקספורד.אני רוב אמוס, גם אני ממעבדות Brain ו-Canne, ושמי קית' בראיין. היום, ג'ון ורוב ידגימו לכם טכניקה של דימוי סידן בשריר חלק. אנו משתמשים בשיטה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את השחרור של מוליכים עצביים מעצבים אוטונומיים ואת השפעתם על השריר החלק.בואו נתחיל. האינדיקטור לסידן Organ Green 488 Bapta-1 AM מגיע בבקבוקונים של 500 µL המכילים 50 µg של אבקה. כדי להכין את האינדיקטור לסידן, הוסיפו 40 µL של תמיסת Onic F1 27 לאבקה ונערה בעדינות במשך 30 שניות. לאחר מכן, הוסיפו 460 µL של תמיסת סליין פיזיולוגית (PSS), ונערה בעדינות למשך 30 שניות נוספות.התמיסה הסופית, 10 µM של organ green 488 BAFTA, מספקת ארבע מנות (aliquots) של 125 µL כל אחת. יש למנוע חשיפה לאור ולאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 20- °C לפני דיסקציה של הרקמה הרלוונטית.הוצא את אינדיקטור הסידן מהמקפיא והפשר בטמפרטורת החדר בעוד אינדיקטור הסידן דליל. העבר מיליליטר אחד של PSS למבחנה ואמבט מים בטמפרטורה של 33 °C. הדק בורבולה למבחנה באמצעות פקק, או שניתן להשתמש בפילטר, ולאחר מכן בצע בובלינג עם תערובת של 95% oxygen ו-5% carbon dioxide בקצב של בועה אחת בערך לשנייה.בצעו דיסקציה של איבר השריר החלק מהבעל החיים. במקרה זה, מדובר בשלפוחית השתן של עכבר. הניחו את האיבר בערך ב-50 millimeters של PSS לשטיפה. לאחר שטיפת הרקמה, הסירו בזהירות את הרקמה השומנית ורקמת החיבור.בצעו דיסקציה ופתחו את שלפוחית השתן בהתאם לסוג השריר החלק של laurean. פתחו לאורכה מצוואר השלפוחית, הקצה העטוף (coddle end), ועד לראש כיפת השלפוחית (dome). בקצה הקרניאלי (cranial end), הכינו ארבעה רצועות, באורך 6 עד 8 מילימטרים וברוחב 1 עד 2 מילימטרים, לאורך המשטח הגבי של ה-resser, תוך חיתוך בכיוון צמעי השרירים הדומיננטיים.הניחו את הרקמה המנוסחת ואת ה-PSS שחומם מראש והובעבב כדי להטעין את אינדיקטור הסידן, על ידי הוספת 125 µL של organ green 488 B בריכוז 10 µM לרקמה בתוך מבחנה, ונערה קלות ביד כדי לערבב. החזירו את המבחנה לאמבט המים. חזרו להבעבוב וכסו את אמבט המים בגיליון נייר אלומיניום.הזמן הדרוש לספיגה מספקת של אינדיקטור הסידן ברקמה משתנה בהתאם לגודל הרקמה ולעובי שכבת השריר החלק. לדוגמה, עבור השריר הדטרוסור של עכבר ו-oxs של חולדה, הזמן הוא 70 דקות. לעומת זאת, עבור השריר הדטרוסור של חולדה ו-VAs deens של עכבר, אנו מדגירים במשך 120 דקות.לאחר טעינת הרקמה עם המדד לסידן (calcium indicator), ניתן להכינה למיקרוסקופיה. ראשית, שטפו את הרקמה ב-PSS מאוורר בבועות למשך 10 דקות. לאחר מכן, מקמו את הרקמה בתוך צלח הכנה עם הגנת S (S guard).מתוחו את הרקמה מעט כדי ליצור גיליון שטוח. 고בעצרו את הרקמה באמצעות קטעים קצרים, למשל, שני מילימטרים של חוט כסף בקוטר 25 עד 50 µm, והחדירו את הנעצים בזווית.הימנעו משימוש בסיכות שאורכן עולה על מספר מילימטרים, שכן הן עלולות לשרוט את העדשה. קיבוע זהיר של הרקמה באמצעות סיכות חשוב כדי למזער תנועה ספונטנית של הרקמה ולהקל על איתור אתר מתאים לדימות. לאחר קיבוע הרקמה, מקמו את צלחת ההכנה על במה המיקרוסקופ.הקפידו שה-PSS לא יחרוג מהאזור המגודר ב-sil guard של הצלחית, שכן הדבר עלול להוביל לכיסוי של שטח רב ב-PSS. כאשר תתחיל הסופרפוזיה למטרות הדגמה, השלבים הבאים יבוצעו באור.שימו לב שניסויים אלה מבוצעים בדרך כלל בחשכה. הפעילו את המשאבה כדי לבצע perfuse להכנה. עבור PSS, משתמשים לרוב בקצב של 100 milliliters per hour.הפעל את יחידת החימום, והנח את צינורות הכניסה והיציאה ואת חיישן הטמפרטורה על צלחת ההכנה, תוך קיבוע של כל אחד מהם לפס המתכת באמצעות המגנט שבבסיסו. גובה הקצה של צינור היציאה יקבע את עומק ה-PSS. הקפד לוודא שמעמד היציאה אכן מסיר את ה-PSS, שכן לעיתים הדבר אינו קורה.ראשית, הגדירו במכשיר החימום את הטמפרטורה הרצויה, שבין 33 ל-35 מעלות צלזיוס. אפשרו לרקמה להגיע לשיווי משקל למשך 10 דקות לפחות תחת עדשה בעלת הגדלה נמוכה, פי 10 או 20.השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית או בהערכה באמצעות אור כחול כדי לצפות בשריר החלק ולזהות אזור מתאים למעקב. מכיוון שחשיפה להערכה והארה תגרום לפחיתה פוטו-כימית (photobleaching) של האינדיקטור, הימנעו משימוש למשך יותר מכמה שניות בכל פעם.הימנעו מבחירה של אזורים עם מבנים בהירים, מכיוון שהם עלולים לגרום למספר גבוה של חיוביים שגויים באלגוריתם זיהוי התמונות. נסו לבחור אתר עם תנועה מינימלית ומספר רב של תאי שריר חלק בשדה הראייה. לאחר שבחרתם את האתר לצילום, עברו לעדשה בעלת הגדלה גבוהה יותר, כגון 40 x.סובב את השולחן או את הציר האופטי כך שתא השריר החלק או תאי השריר החלק יהיו במצב אופקי. כלומר, במקביל לציר הסריקה המהירה. תאי השריר החלק מוכנים כעת לדימות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף מסוג Leica SP two. סגרו את חור הפינהול (pinhole) לרדיוס של דיסקת אוויר אחת (one airy disc). הגדירו את עוצמת הלייזר בין 25% ל-35% במסנן הניתן לכוונון של custo optic.ערך זה מהווה פשרה בין בהירות לבין פוטו-bleaching. כדי להיערך לניתוח הנתונים, הורד והתקן את ImageJ. הורד את הגרסה המתאימה למערכת ההפעלה ולאחר מכן עדכן לגרסה האחרונה על ידי הורדת קובץ ה-jar העדכני ביותר של ImageJ כדי להחליף את הקובץ הישן. לאחר מכן, הורד את קובץ ה-jar של ה-Excel writer והתקן אותו בספריית ה-plugins jar.העתיקו את הקבצים הללו לספריית התוספים (plugins). התקינו כל אחד מהסקריפטים הללו באמצעות המאקרו של התוספים. השתמשו בפונקציית ההתקנה של image J. התוכנה עבור מיקרוסקופ הקונפוקאל Leica SP2 שבו אנו משתמשים נקראת Leica.LCS שומרת פרימות בודדות מכל סדרה כקובץ נפרד. כדי לשחזר את הסדרה, ודאו שכל הפרימות המיועדות לשחזור נמצאות בתיקייה אחת.לדוגמה, תיקייית נתוני tiffs. לאחר מכן, בחרו במקרו Leica SP two stacker מתוך תפריט ה-plugins macros. בחרו בתיקיית השורש, ובמקרה זה בתיקיית הנתונים.בחר את התיקייה הרצויה מרשימת הגלילה. במקרה זה, עבור קבצי tiffs, בחר תיקיית פלט או צור תיקייה חדשה. לדוגמה, תיקיית data folder stacks.הסקריפט ישחזר לאחר מכן סדרות מתוך פריימים בודדים כדי לתקן תזוזות. אנו משתמשים באלגוריתם הזמין בחינם המיישר או מתאים פריימים בתוך סדרת ערימה של הורדות (downloads stack), rig ו-turbo reg. העתיקו את הקבצים עבור כל אחד מהם לתיקיית ה-stacks.טענו ערימה (stack) לעיבוד ולאחר מכן עברו לפריים המראה בבירור את שדה העניין. פריימים אחרים ייושרו לפי פריים ייחוס זה. לאחר מכן, עברו ל-plugins stacks.רישום ערימה. נסו כל אחת מהטרנספורמציות השונות כדי לקבוע מהי היעילה ביותר עבור כל אתר. גורמים תמונה המשפיעים על זיהוי מעברים של סידן ישתנו בהתאם למדידה של תכונות מסוימות, פרמטרי חלקיקים של כל אתר.הרגישות והסגוליות של הזיהוי עולות. לכן, עבור כל אתר, נחשב סף למכסה של סף עבור היחס וסף לקצה התא. כדי להתחיל, עברו ל-plugins, לאחר מכן ל-macros, בחרו ב-install ובחרו ב-jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. לאחר מכן עברו ל-plugins, ל-macros ול-load stack.בחרו סדרה וחשבו את פרמטרי החלקיקים הבאים. כדי לחשב את סף החיתוך עבור הפחתה (subtracted), בחרו אזור עניין מלבני מעל מה שנראה כרעש הרקע. רשמו את הממוצע. כדי לחשב את סף החיתוך עבור יחס (ratio), בחרו אזור עניין מלבני סביב אזור שטוח מבחינה אופטית של תא או תאי שריר חלק.מדדו ורשמו את הממוצע וסטיית התקן. חזרו על התהליך פעמיים נוספות, או שתוכלו לשרטט שלושה מלבנים בבת אחת על ידי לחיצה על shift. חשבו ורשמו את סף היחס.חשב את סטיית התקן חלקי הממוצע פלוס אחד, ולאחר מכן הכפל את התוצאה ב-32. בחישוב ממוצע של ערכים משלוש חזרות, המקדם 32 נחוץ כדי להתחשב באלגוריתם היחס, שבו חוסר שינוי מהפריים הקודם ממופה לערך שלם של 32. דבר זה מספק טווח דינמי טוב לזיהוי עליות וירידות ביחס.עבור תמונה בעלת שמונה ביטים, בחרו ב-image adjust threshold. בחרו ב-black and white. הגדירו את הגבול העליון של המהלך (upper slide limit) ורשמו את הערך המתאים.זהו המיקום מימין למכוון. רק אירועים המתרחשים באזורים השחורים ייספרו. לחץ על איפוס.כעת, לאחר שחושבו סף ההחסרה עבור היחס וסף קצה התא, ניתן לנתח את ערימות התמונות. קבעו את מיקום הערימות המיועדות לניתוח. בשלב זה, בחרו סדרה אחת בלבד.זהו הקובץ הראשון, והקובץ האחרון צריך להיות זהה. לאחר מכן, בחרו מיקום עבור פלט קבצי הנתונים והמחסניות (stacks). לדוגמה, תיקיית פלט נתונים.הזינו ערכי סף עבור הסרת הסף (subtracted threshold), סף עבור היחס (ratio threshold) וסף קצוות התא (cell edge threshold). השאירו את שאר ההגדרות בערכי ברירת המחדל שלהן. האלגוריתם ייצור חלון בעל שני פאנלים, שבו הסדרה המעובדת תוצג משמאל והסדרה המקורית מימין.פתחו קובץ זה מתיקיית הפלט ועברו עליו בקפידה כדי להעריך את מספר התוצאות החיוביות השגויות ואת המקרים שבהם אירועים הנראים לעין לא זוהו. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel המפרט מאפיינים של האירוע שזוהה, כגון אמפליטודה, שטח ומיקום; תוצאות חיוביות שגויות שזוהו באמצעות סקירת קובצי התמונה שייצאו מהאלגוריתם ניתנות להסרה ידנית מקובץ Excel זה. עם זאת, עליכם להגדיר קריטריונים מחמירים לביצוע פעולה זו.זהו סרטון של תנודות סידן בשריר חלק. בדוגמה זו, הסרטון מורכב מ-100 פריימים בודדים שנרכשו בשיעור של חמישה הרץ. אנו נרכוש סרטונים רבים own מהסוג הזה לכל ניסוי כאשר אנו חוקרים, למשל, את ההשפעה של תרופה מסוימת על תדירות תנודות הסידן.כאן אנו רואים מספר רב של תנודות סידן ספונטניות בתאי השריר החלק. תוצאת אלגוריתם זיהוי החלקיקים מוצגת כאן. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel המפרט מאפיינים של האירוע שזוהה, כגון אמפליטודה, שטח ומיקום.הדגמנו שיטה לדימוי מעברי סידן באיברים בעלי שריר חלק, כגון שלפוחית השתן, והראינו דרך לניתוח מעברי סידן אלו באמצעות אלגוריתם שפיתחנו במעבדה. הדברים החשובים שדורשים התייחסות הם הכנה נאותה של הרקמה לדימוי הסידן. במקרה של הרקמה שהדגמנו היום, הכנה זו כוללת הסרה של רקמת חיבור והסרה של כל שומן שעלול להסתיר את שדה הראייה.חשוב גם להקבע את הרקמה כגיליא שטוח. ובכן, בהצלחה בניסויים שלכם ותודה שצפיתם.

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

אנו מציגים שיטה לבודד מהירה (מיקרו) האירועים סידן והנתיבים איטי יותר בתאים חיים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית confocal. שיטה מודד תנודות בעוצמת הקרינה של אינדיקטורים סידן על ידי קו סריקות הקלטה מאות פיקסלים מספר בתא. ניתוח היסטוגרמה מאפשר לנו לבודד את הכף זמן של והנתיבים סידן שונים.

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

תפקוד תאי כלי הדם תלוי בפעילות של שליחים תוך-תאיים.  מתוארת כאן שיטת הדמיית שני פוטונים ex vivo המאפשרת מדידה של רמות סידן ותחמוצת החנקן התוך תאיות בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים בתאי אנדותל ושריר חלק בודדים של אבי העורקים המבודד.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

נכון לעכשיו, רוב מדדי הסידן הזמינים משמשים לכימות מעברי סידן ציטופלזמיים כמדדים עקיפים של סידן המשתחרר מהרטיקולום הסרקופלזמי בתאי שריר חלק מתורבתים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באינדיקטור ספציפי מבוסס FRET המאפשר מדידה ישירה של אותות סידן בתוך לומן הרטיקולום הסרקופלזמי.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

מאמר זה מתאר פרוטוקול המעריך את השינויים ברגישות לשריר Ca2+ במהלך התכווצות במיוציטים לבביים מבודדים מלב חולדה. יחד עם אלקטרופיזיולוגיה של הלב, רמות ציטוזול סיסטולי/דיאסטולי Ca2+ והתכווצות/הרפיה, מדידה זו הכרחית בבסיס המנגנונים המתווכים צימוד עירור-התכווצות לב בלב בריא וחולה.

הערכת Myofilament Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; עירור-התכווצות לב ביסוד רגישה זיווגים

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

פרוטוקול זה מציג אוסף של נתונים גיאומטריים סרקומר, סידן ומקרוסקופיים מ trabecula ex vivoמתכווצת באופן פעיל . מדידות סימולטניות אלה מתאפשרות על ידי שילוב של שלוש שיטות הדמיה.

ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo

הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .

שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

מאמר זה מציג שיטה לניטור כמותי בזמן אמת של ריכוזי יוני סידן (Ca2+) בתאים באמצעות הדמיה חד-תאית Ca2+ עם צבע Fura-2/AM. טכניקה זו מאפשרת העמסת צבע יעילה וחישוב מדויק של רמות Ca2+ באמצעות יחסי עוצמת פלואורסצנטיות, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר.

דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

למד טכניקת דימות סידן ברזולוציה גבוהה בשריר חלק של שלפוחית השתן מבודדת. הפרוטוקול מכסה הכנת רקמה, טעינת מדד סידן, מיקרוסקופיית קונפוקל וניתוח נתונים לאיתור אירועי סיגנל סידן.

מיקוד Ca^{2 +} איתור חלוף של שריר חלק

גלה סרטונים נוספים