מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק
29 ביוני 2009
פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה Ca 2 + הדמיה של שריר חלק בתוך איברים מבודדים, לרבות: הכנת הרכישה, תמונה רקמות וניתוח נתונים.
ראשית, מכינים תמיסת טעינת סידן, מחממים אותה ומנפחים אותה בבועות גז. השלפוחית השתןית מבודדת בדיסקציה, נפתחת, נמתחת בעזרת סיכות, ונלקח רצועה של שריר הדטרוסור. רצועת הדטרוסור מתווספת לתמיסת הטעינה, עוברת אינקובציה ושטיפה, ונמתחת בעזרת סיכות.
רמת הרקע של הסידן ברקמה מעוררת על ידי אור לייזר והאור הנפלט נלכד. סרטים המורכבים מפריימים בודדים מנותחים על ידי השוואה בין פריימים עוקבים. הרקע מופחת.
סף קצה התא קובע היכן ניתן למצוא אירועים, ונלקח יחס בין מוחות עוקבים. אם האירועים שנותרו תואמים לקריטריונים שהוגדרו מראש, הם מודגשים ומסומנים. שלום, שמי ג'ון יאנג מהמעבדות של קית' בריין וטום קיניין במחלקה לפרמקולוגיה, אוניברסיטת אוקספורד.
אני רוב אמוס, גם אני ממעבדת Brain ו-Canne, ושמי קית' בראיין. היום, ג'ון ורוב יראו לכם טכניקה של דימות סידן בשריר חלק. אנו משתמשים בשיטה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את שחרור המוליכים העצביים מעצבים אוטונומיים ואת השפעתם על השריר החלק.
בואו נתחיל. אינדיקטור הסידן organ green, 488 BAFTA 1:00 AM מגיע בבקבוקונים של 500 µL המכילים 50 µg של אבקה. כדי להכין את אינדיקטור הסידן, הוסיפו 40 µL של תמיסת Onic F1 27 לאבקה ונערערו בעדינות למשך 30 שניות; לאחר מכן, הוסיפו 460 µL של תמיסת סליין פיזיולוגית (PSS), ונערערו בעדינות למשך 30 שניות נוספות.
התמיסה הסופית, 10 µM של organ green 488 BAFTA, מספקת ארבע מנות (aliquots) של 125 µL כל אחת. יש למנוע חשיפה לאור ולאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 20- °C לפני הפריקה של הרקמה הרלוונטית.
הוצא את אינדיקטור הסידן מהמקפיא והפשר בטמפרטורת החדר עד להמסה מלאה. העבר 1 mL של PSS למבחנה והנח במקלחת מים בטמפרטורה של 33 °C. חבר מבעבע למבחנה באמצעות פקק, או לחלופין השתמש בפרפיל (perfil), ולאחר מכן בצע בועבוע של תערובת של 95% oxygen ו-5% carbon dioxide בקצב של בועה אחת בשנייה בקירוב.
בצעו דיסקציה של איבר השריר החלק מהחיה. במקרה זה, מדובר בשלפוחית השתן של עכבר. הניחו את האיבר בערך ב-50 millimeters של PSS לשטיפה. לאחר שטיפת הרקמה, הסירו בזהירות את רקמת השומן ורקמת החיבור.
בצעו דיסקציה לפתיחת שלפוחית השתן בהתאם לסוג השריר החלק (laurean type). פתחו לאורכה מצוואר השלפוחית, מהקצה העגול ועד לראש כיפת השלפוחית. בקצה הקרניאל, הכינו ארבעה רצועות, באורך 6 עד 8 מילימטרים וברוחב 1 עד 2 מילימטרים, לאורך המשטח הגבי של הרסר (resser), תוך חיתוך בכיוון צרורות השריר הדומיננטיות.
הנח את הרקמה המנוסחאת ואת ה-PSS המבעבע והמחומם מראש להעמסת אינדיקטור הסידן, עם 125 µL של 10 µM organ green 488B, אל הרקמה שבמבחנה ונער אותה קלות ביד כדי לערבב. החזר את המבחנה למקלחים. חזור להבעבוע וכסה את המקלחים בגיליון נייר אלומיניום.
הזמן הדרוש כדי שספיק רקמה תספוג את אינדיקטור הסידן משתנה בהתאם לגודל הרקמה ולעובי שכבת השריר החלק. לדוגמה, עבור ה-detrusor של עכבר ו-oxs של חולדה, הזמן הוא 70 דקות. לעומת זאת, עבור ה-detrusor של חולדה ו-VAs deens של עכבר, אנו מדגירים למשך 120 דקות.
לאחר שטענו את הרקמה במחוון הסידן, ניתן להכינה למיקרוסקופיה. ראשית, שטפו את הרקמה ב-PSS מאוורר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הצמידו את הרקמה לצלחת הכנה עם מעקי S.
מתיחה קלה של הרקמה ליצירת גיליון שטוח. הצמדת הרקמה באמצעות קטעים קצרים, למשל, של 2 mm של חוט כסף בקוטר 25 to 50 µm, והחדרת הסיכות בזווית.
הימנעו משימוש בסיכות שאורכן עולה על מספר מילימטרים, שכן הן עלולות לשרוט את העדשה. קיבוע זהיר של הרקמה באמצעות סיכות הוא חשוב כדי למזער תזוזות ספונטניות של הרקמה וכדי להקל על איתור אתר מתאים לדימות. לאחר קיבוע הרקמה, מקמו את צלחת ההכנה על בסיס המיקרוסקופ.
יש להיזהר ש-PSS לא יגלוש מחוץ לאזור המגנה מסיליקון של הצלחת, שכן הדבר עלול להוביל לכיסוי של שטח נרחב ב-PSS. כאשר תחל הסופרפוזיה לצורכי הדגמה, השלבים הבאים יבוצעו באור.
שימו לב שניסויים אלו מבוצעים בדרך כלל בחשיכה. הפעילו את המשאבה כדי לבצע perfuse למכינה. ב-PSS, נעשה שימוש בשיעור של 100 milliliters per hour לרוב.
הפעילו את יחידת החימום, הניחו את צינורות הכניסה והיציאה ואת חיישן הטמפרטורה על צלחת ההכנה וקבעו כל אחד מהם לפס המתכת באמצעות המגנט שבבסיסו. גובה הקצה של צינור היציאה יקבע את עומק ה-PSS. הקפידו לוודא שצינור היציאה אכן מסלק את ה-PSS, שכן לעיתים הדבר אינו קורה.
בתחילה, הגדירו את הטמפרטורה ביחידת החימום כך שתגיע לטמפרטורה הרצויה שבין 33 ל-35 °C. אפשרו לרקמה להגיע לשיווי משקל למשך 10 דקות לפחות תחת עדשה בעלת הגדלה נמוכה, 10 או 20 פעמים.
השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה בשיטת epi או בעירור באמצעות אור כחול כדי לצפות בשריר החלק ולזהות אזור מתאים למעקב. מכיוון שהחשיפה לעירור וההארה יגרמו להבהרה פוטוכימית (photobleaching) של האינדיקטור, הימנעו משימוש למשך יותר מכמה שניות בכל פעם.
הימנעו מבחירת אזורים עם מבנים בהירים, שכן הם עלולים לגרום למספר רב של תוצאות חיוביות שגויות באלגוריתם זיהוי התמונות. נסו לבחור אתר עם תנועה מינימלית ומספר רב של תאי שריר חלק בשדה הראייה. לאחר שבחרתם את האתר לצילום, עברו לעדשה עם הגדלה גבוהה יותר, כגון 40 x.
סובב את הבמה או את הציר האופטי כך שתאי השריר החלק יעמדו במצב אופקי. כלומר, במקביל לציר הסריקה המהירה. תאי השריר החלק מוכנים כעת לדימוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי אנכי מסוג Leica SP two. סגרו את ה-pinhole לרדיוס של דיסק אוורי (airy disc) אחד. הגדירו את עוצמת הלייזר בין 25% ל-35% במסנן הניתן לכיוונון של custo optic.
ערך זה מהווה פשרה בין בהירות לבין פוטו-בליץ'ינג (photo bleaching). כדי להיערך לניתוח הנתונים, הורד והתקן את תוכנת ImageJ. הורד את הגרסה המתאימה למערכת ההפעלה שלך, ולאחר מכן עדכן לגרסה האחרונה על ידי הורדת קובץ ה-jar העדכני ביותר של ImageJ להחלפת הקובץ הישן. לאחר מכן, הורד את קובץ ה-jar של Excel writer והתקנו בתיקיית ה-plugins jar.
העתק קבצים אלה לספריית ה-plugins. התקן כל אחד מהסקריפטים הללו באמצעות מאקרו ה-plugins. השתמש בפונקציית ההתקנה של image J. התוכנה עבור מיקרוסקופ הקונפוקלי Leica SP two שבו אנו משתמשים נקראת Leica.
LCS שומר פריימים בודדים של כל סדרה כקובץ נפרד. כדי לשחזר את הסדרה, ודאו שכל הפריימים המיועדים לשחזור נמצאים בתיקייה אחת.
לדוגמה, תיקיית נתונים tiffs. לאחר מכן, בחרו במקרו Leica SP two stacker מתפריט ה-plugins macros. בחרו את ספריית השורש, ובמקרה זה את תיקיית הנתונים.
בחר את התיקייה הרצויה מרשימת הבחירה. במקרה זה, בחר תיקיית פלט לקבצי tiffs או צור תיקייה חדשה. לדוגמה, תיקיית data folder stacks.
לאחר מכן, הסקריפט ישחזר סדרות מפריימים בודדים כדי לתקן תזוזות. אנו משתמשים באלגוריתם הזמין בחינם המיישר או מתאים פריימים בתוך ערימת הורדות של סדרה, rig ו-turbo reg. העתיקו את הקבצים של כל אחד מהם לתיקיית ה-stacks.
טענו ערימה (stack) לעיבוד ולאחר מכן עברו לפריים (frame) המראה בבירור את שדה העניין. פריימים אחרים ייושרו לפי פריים ייחוס זה. לאחר מכן, עברו לתפריט plugins stacks.
רישום ערימה (Stack Reg). נסו כל אחת מהטרנספורמציות השונות כדי לקבוע מה הכי יעיל עבור כל אתר. גורמים המצולמים המשפיעים על זיהוי מעברים של סידן ישתנו על ידי מדידה של תכונות מסוימות, פרמטרי חלקיקים של כל אתר.
הרגישות והסגוליות של הזיהוי עולות. לכן, עבור כל אתר, נחשב את סף החיסור עבור היחס ואת סף קצה התא. כדי להתחיל, עברו ל-plugins, לאחר מכן ל-macros, לבחירה ב-install ובחרו ב-jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. לאחר מכן עברו ל-plugins, ל-macros ול-load stack.
בחרו סדרה וחשבו את פרמטרי החלקיקים הבאים. כדי לחשב את הסף עבור הסרה (subtracted), בחרו אזור עניין מלבני מעל מה שנראה כמדידת הרקע. רשמו את הממוצע. כדי לחשב את הסף עבור יחס (ratio), בחרו אזור עניין מלבני סביב אזור שטוח מבחינה אופטית של תא שריר חלק או תאי שריר חלק.
מדדו ורשמו את הממוצע ואת סטיית התקן. חזרו על התהליך פעמיים נוספות, או שתוכלו לצייר שלושה תיבות בבת אחת על ידי לחיצה על shift. חשבו ורשמו את סף היחס.
חשב את סטיית התקן חלקי הממוצע ועליה הוסף אחד, ולאחר מכן הכפל את התוצאה ב-32. בעת חישוב ממוצע של ערכים משלו חזרות, מקדם ה-32 נחוץ כדי להתחשב באלגוריתם היחס, שבו חוסר שינוי מהפריים הקודם ממופה לערך שלם של 32. דבר זה מעניק טווח דינמי טוב לגילוי עליות וירידות ביחס.
עבור תמונה של שמונה ביטים, בחרו ב-image adjust threshold. בחרו ב-black and white. הגדירו את הגבול התחתון של הסרגל העליון ורשמו את הערך המתאים.
זה נמצא מימין למכוון (slider). רק אירועים המתרחשים באזורים השחורים ייספרו. לחץ על איפוס.
כעת, לאחר שחושבו סף ההחסרה עבור היחס וסף שולי התא, ניתן לנתח את מחסניות התמונות. קבעו את מיקום המחסניות שיועמדו לניתוח. בשלב זה, בחרו סדרה אחת בלבד.
זהו הקובץ הראשון, והקובץ האחרון צריך להיות זהה. לאחר מכן, בחרו מיקום עבור פלט קובצי הנתונים והמחסניות (stacks). לדוגמה, תיקיית פלט הנתונים.
הזינו ערכים לסף להחסרה (threshold for subtracted), לסף ליחס (threshold for ratio) ולסף קצה תא (cell edge threshold). השאירו את שאר ההגדרות בערכי ברירת המחדל שלהן. האלגוריתם יפיק חלון עם שני חלונות תצוגה, שבו הסדרה המעובדת מוצגת משמאל והמקורית מימין.
פתחו קובץ זה מתיקיית הפלט ועברו עליו בקפידה כדי להעריך את מספר התוצאות החיוביות השגויות ואת המקרים שבהם אירועים הנראים לעין לא זוהו. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel המפרט מאפיינים של האירוע שזוהה, כגון amplitude, שטח ומיקום; ניתן להסיר ידנית מקובץ Excel זה תוצאות חיוביות שגויות שזוהו באמצעות סקירת קובצי התמונה שהאלגוריתם פלט. עם זאת, עליכם להגדיר קריטריונים מחמירים לצורך ביצוע פעולה זו.
זהו סרטון של תנודות סידן (calcium transience) בשריר חלק. בדוגמה זו, הסרטון מורכב מ-100 פריימים בודדים שנרכשו בתדר של five hertz. נרכוש סרטונים רבים כאלה לכל ניסוי כאשר אנו בוחנים, למשל, את ההשפעה של תרופה מסוימת על תדירות תנודות הסידן.
כאן אנו רואים מספר רב של תנודות סידן ספונטניות בתאי השריר החלק. תוצאת אלגוריתם זיהוי החלקיקים מוצגת כאן. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel המפרט מאפיינים של האירוע שזוהה, כגון אמפליטודה, שטח ומיקום.
הדגמנו שיטה לדימות מעברי סידן באיברי שריר חלק, כגון שלפוחית השתן, והצגנו דרך לניתוח מעברי סידן אלו באמצעות אלגוריתם שפיתחנו במעבדה. הדברים החשובים לזכור הם להכין היטב את הרקמה לצורך דימוי הסידן. במקרה של הרקמה שהדגמנו היום, הדבר כולל הסרה של רקמה חיבורית והסרה של כל שומן שעלול להסתיר את שדה הראייה.
חשוב גם להקבע את הרקמה כגיליון שטוח. ובכן, בהצלחה בניסוייכם ותודה שצפיתם.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט שיטות לדימות Ca2+ ברזולוציה גבוהה של שריר חלק בתוך איברים מבודדים. הוא עוסק בהכנת רקמות, ברכישת תמונות ובניתוח נתונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה
- טכניקות דימות
רקע
- דימות סידן הוא חיוני להבנת תפקוד השריר החלק.
- הוא מאפשר לחוקרים ללמוד על שחרור מתווכי חוליה עצבית והשפעותיהם.
- טכניקות דימות ברזולוציה גבוהה משפרות את דיוק הנתונים.
- הכנות של איברים מבודדים מספקות תנאים ניסיוניים מבוקרים.
מטרת המחקר
- להדגים טכניקה של דימות סידן בשריר חלק.
- לנתח את השפעותיהם של מוליכים עצביים על פעילות השריר החלק.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים בתחום.
שיטות בשימוש
- הכנת תמיסת טעינה של סידן.
- דיסקציה והכנה של רקמת שריר חלק.
- טעינה ודגירה של אינדיקטור לסידן.
- טכניקות מיקרוסקופיה לדימוג וניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- טעינה מוצלחת של אינדיקטורים לסידן ברקמת שריר חלק.
- דמויות ברזולוציה גבוהה שצולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- ניתוח הנתונים חשף אירועי איתות סידן משמעותיים.
- הפרוטוקול תוקף לשימוש במחקרים נוספים של פיזיולוגיה של השריר החלק.
מסקנות
- השיטות המתוארות מאפשרות מחקר מפורט של תפקוד השריר החלק.
- דימוי סידן יעיל לניתוח השפעות של מוליכים עצביים.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה לרקמות שריר חלק שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
שיטה זו מאפשרת זיהוי ברזולוציה גבוהה של מעברים קצרים (transients) מוקדיים של Ca2+ בשריר חלק, ומספקת קריאה אופטית ישירה של שחרור מוליכים עצביים מעצבים אוטונומיים. על ידי לכידה של אירועי Ca2+ תת-תאיים בדיוק מרחבי-זמני, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף מטרות עבור מודולטורים של GPCR ותעלות יונים המשפיעים על השריר הדטרוסור, צינור הד deferens ורקמות סינציטליות אחרות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור סיגנל פורינרגי לתגובות רקמתיות תפקודיות, ללא הסתמכות על אלקטרופיזיולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני שחרור מוליכים עצביים פורנינרגיים באמצעות זיהוי רגעי של Ca2+ מקומי בשריר חלק.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של רספטורי P2X1 ומסלולי איתות פורנינרגיים קשורים ברקמה רלוונטית למחלה.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור מעורבות ליגנד-רספטור לאיתות Ca2+ במורד המסלול בהקשר של רקמה טבעית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים (תדירות, מיקום, אמפליטודה) של תנודות Ca2+ לצורך אפיון השפעת תרכובות.
- שחזוריות: משתמש ביישור תמונות אוטומטי ובזיהוי מבוסס סף כדי למזער שונות בין מפגשי הדמיה.
- יכולת הרחבה: מאפשר ניטור סימולטני של מספר אתרי שחרור בשדה ראייה אחד, ובכך מגביר את התפוקה להערכת פעילות ספציפית לאתר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל סיגנלינג נוירו-אפקטורי במערכת השתן התחתונה וברקמות רבייתיות, שבהן קוטרנסמיסיה פורינית מווסתת את כושר התכווצות השריר.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין אירועי שחרור מ neurotransmitter אקוטיים לבין תגובות תפקודיות של רקמות במודלים פרה-קליניים של שלפוחית שתן פעילה יתר ומחלות מוטיליות.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות go/no-go על ידי כימות תדירות הטרנזיאנטים של Ca2+ המושרים על ידי אגוניסט, כסמן ביולוגי למעורבות של המסלול.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת מעורבות המטרה ועד לתיקוף תפקודי ברקמה טבעית, ובמיוחד עבור מווסתים של מערכת העצבים האוטונומית ותרופיתים המכוונים לשריר חלק.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנוני שחרור מוליכים עצביים ואותות Ca2+ ספציפיים למסלול ברקמה שלמה.
- סריקה: מאפשרת פיתוח של בדיקות לזיהוי השפעות של תרכובות על פרמטרים של מעברים זמניים של Ca2+, ספונטניים ומעוררים.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות (אמפליטודה, שטח, מיקום) המאפשרות השוואה בין תנאים ניסיוניים לבין יעילות התרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין טרגט מולקולרי לתוצאות תפקודיות ברמת הרקמה בהכנות של שריר חלק הרלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לדימוי ואנליזה לצורך חקר תמסורת נוירו-אפקטורית במספר מיטות של שריר חלק.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בצימוד שבין מוליכים עצביים לשריר חלק, על ידי אספקת ראיות אופטיות ישירות למקורם של תהליכי Ca2+ חולפים (transients).
- ערך תפעולי: מספק גילוי סטנדרטי ו可שחזור של אירועי Ca2+ סטוכסטיים באמצעות סף אלגוריתמי ויישור פריימים.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי קישור מודולציה של המטרה לאירועי איתות מדידים ברמת הרקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות בהתאם לסיכון, בהסתמך על יעילותן בהשראת או עיכוב של תהליכי Ca2+ פורינרגיים חולפים.
שיקולי יישום
- מומחיות בטעינה של אינדיקטורים ל-Ca2+, בדיסקציה של רקמות ובהגדרת מיקרוסקופ קונפוקאלי.
- גישה למיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר ובקרת סביבה עבור פרפוזיה של רקמות.
- סטנדרטיזציה של תהליכי ניתוח תמונות, כולל חיסור רקע, תיקון תנועה וכיול סף (threshold).
- שיקולי התאמה עבור סוגים שונים של שריר חלק (למשל, צינור הד deferredens, עורק) בהתבסס על עובי הרקמה וקינטיקת הטעינה.
- מגבלה: תדירות אירועים חולפים ספונטניים עשויה לדרוש ייצוב של קו הבסיס ונורמליזציה של השפעת התרופה.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Introduction
1:30
Preparing the Ca2+ Indicator, Dissecting the Tissue, and Loading the Ca2+ Indicator
5:05
Preparing the 'Ca2+ Loaded' Tissue for Microscopy
8:44
Preparing for Analysis and Correcting for Movement
11:57
Particle Detection Algorithm
16:53
Conclusion
