השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין
1 ביוני 2009
העדשה כוללת פיתוח אינטראקציות עם רקמות אחרות. מספר מוטציות עין דג הזברה מתאפיינים בגודל העדשה קטן באופן חריג. כאן אנו מדגימים השתלת עדשה הניסוי כדי לקבוע אם פנוטיפ זה נובע גורם פנימי או אינטראקציות עם רקמות פגומות המקיפים את העדשה.
כדי להתחיל בהשתלת עדשה בדגי זהב, תורמים טרנסגניים המבטאים GFP ומקבלים מסוג wild type מודגרו תחילה למשך 30 דקות בצלחות פטרי נפרדות המכילות תמיסת ריינגר לדגי זהב נטולת סידן. לאחר מכן, זחלי הדגים נטמעו בשתי שורות מקבילות באגרוז בנקודת התכה נמוכה. שורה אחת, A, מיועדת לתורמים והשנייה, B, למקבלים. עבור המקבלים, העין כולה מוסרת מהתורם, בעוד שמהמקבל מוסרת רק העדשה.
הרקמות המקיפות את העדשה התורמת מוסרות לפני השמת העדשה בעין המאחסת. לאחר ההשתלה, הדגים נשמרים בפלטות 24 בארות מסומנות. העדשה המושתלת אמורה להפגין פלואורסצנציית GFP במאחסת.
באופן טבעי, העין הנגדית של המארח לא עברה ניתוח ואינה מבטאת GFP. היי, אני Yj. ואני Kaya McCullough, ואנחנו מהמעבדה של Dr.Yma Maki במחלקה לפתלוגיה של העין בבית הספר לרפואה של הרווארד. היום נדגים לכם פרוצדורה להשתלת עדשה בדגי zebrafish מסוג wild type בשם Daniel Rio.
אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי להשתיל עדשות מבעלי טיפוס פרא לבעלי מוטציה ולהיפך. דבר זה מאפשר לנו לקבוע האם גנים מוטנטיים פועלים בעדשה באופן אוטונומי או לא אוטונומי. אז בואו נתחיל.
זני דגי זברה מתוחזקים בתנאי מתקן דגים סטנדרטיים בטמפרטורה של 28.5 °C במחזור של 14 שעות אור ו-10 שעות חושך. בערב שלפני הניסוי המתוכנן, מניחים זכרים ונקבות במכל עם מחיצה המפרידה ביניהם. הגנוטיפ של דגים אלה צריך להניב צאצאים עם ביטוי GFP וכל מוטציה רלוונטית. במקביל, השתמש באותו הליך להקמת הכלאות בין בעלי סוג בר (wild type) שאינם טרנסגניים בתוך שעה אחת.
לאחר הדלקת האור בבוקר, יש להסיר את המחיצות כדי לאפשר לדגים להתרבות. לאחר 15 עד 30 דקות, יש לשפוך את מי האקווריום למסננת כדי לאסוף את העוברים, ולאחר מכן לשטוף אותם בעזרת התזת מי ביצים מבקבוק שטיפה לתוך צלחת פטרי של 100 על 15 מילימטר. לאחר מכן, יש לנקות את הביצים על ידי שאיבה בפיפטה של ביצים לא מופרות ושל כל שארית פסולת.
החליפו את מי הביצים הישנים במי ביצים חדשים. ניתן לאחסן את העוברים באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 degree C לפני השתלת העדשה. כאשר תהיו מוכנים להמשיך בהשתלה, הכינו את העוברים על ידי הסרה ידנית של הכוריון.
באמצעות מחט מתכת ופינצטה, יש להדגיר כעת את העובריים שעברו הסרת דף ביצוי (dec coated) ב-0.2% EDTA ב-ZFR נטול סידן למשך 30 דקות. במהלך ההדגרה, ניתן להכין את המחטים הדרושות לדיסקציה. הליך ההשתלה דורש מחט מחודדת כדי לחתוך את הרקמות הסובבות את העדשה ולהוציא את העובריים מהמקור.
נדרשת גם מחט קהה כדי להזיז את העדשה התורמת ולהחדירה למקבל. כדי להכין כל אחת מהמחטים, ראשית יש לחתוך את קצהו של פסטור-פיפט באמצעות סכין יהלום. לאחר מכן, יש להחדיר קפילרה מזכוכית לתוך קצה הפסטור-פיפט כך שכשמחצית מאורכה תהיה בתוכו. יש להחדיר בזהירות תיל טונגסטן דק לתוך הקצה הפתוח של הקפילרה באמצעות להבה.
המיסו את הזכוכית מעל התיל; החזיקו את קצה הזכוכית ביציבות באמצעות פינצטה עם תיל מתכת תוך כדי סיבוב של הקצה השני של המחט. הזכוכית הרכה אמורה להסתובב סביב המתכת ולהינעל עליה. פעולה זו יוצרת מחט קהה כדי להכין מחט מחודדת.
החזקו את תיל הטונגסטן מעל להבה למשך דקה עד 1.5 דקות כדי לשרוף את המתכת, כך שייווצר חוד עדין מאוד. בדקו את איכות החוד באמצעות מיקרוסקופיה.
קצה טוב לא צריך להיות כפוף או מעוקל ועליו להסתייים בחישוב הדרגתי לנקודה דקה, שקוטרה אינו עולה על 50 micrometers. סטריליזציה של שתי המחטים בלהבה למשך מספר שניות, והמתנה לקירורן לפני תחילת הפרוצדורה בתוך מבחנת צנטריפוגה מפלסטיק; הכן 1.2% low melting point aros ו-ZFR נטול סידן שחומם מראש ל-40 degree C במקלחית. בשלב הרצוי, שאב את העוברי התורם באמצעות פיפט פסטור והזרק אותם לאט למבחנת הצנטריפוגה המכילה aros. דגרי את הביצים ב-aros למשך כחמש שניות.
הוציאו את העוברים באמצעות הפיפט וסדרו אותם בשורה בתוך צלחת פטרי מפוליסטירן בקוטר מאה מילימטר על ידי פיפטור איטי וזהיר; רוב העוברים יונחו על צדם כאשר העין פונה כלפי מעלה. כעת חזרו על תהליך זה עם ביצי המארח וסדרו אותן בשורה מקבילה לביצי התורם לפני שהאגרוס יתמצב. השתמשו במחט קהה כדי לסובב עוברים שאינם oriented כראוי, כך שהעין תפנה כלפי מעלה לאחר שהאגרוס התמצב.
כסו את הדגימה בפתרון aro בנקודה נמוכה של התכה בריכוז 0.2%. באמצעות מחט מחודדת, הסירו את ה-aros מסביב לעיניים וגזרו בזהירות רבה את עינית התורם כולה, שצפה על פני הנוזל. לאחר מכן, שחררו את העדשה מהעין.
פעולה זו מתבצעת על ידי גרירת המחט דרך רקמת העין מלמטה למעלה. עבור המארח בלבד. העדשה נחתכת באמצעות תנועות קצרות של מחט מחודדת, תוך חיתוך קרוב ככל האפשר לעדשה מבלי לקרוע אותה.
הימנעו מהסרה מרובה מדי של רקמה משאר עין המארח. לאחר השחרור, העדשות יצופו בתווך. בעזרת מחט קהה, דחפו בזהירות את עדשת התורח למיקום שמעל למיקום של עדשת המארח, ולאחר מכן דחפו אותה למטה אל תוך המיקום בעזרת מחט קהה.
ניתן להשליך את עדשת המארח. השאר את עוברים התורם והמארח ב-1.2%Aros למשך 30 עד 60 דקות. מדיום עוברים יסייע בריפוי הפצע.
לאחר מכן, שחררו אותם מה-agros באמצעות מחט מתכת מחודדת. העבירו את העובריים לפלטה של 24 בארות עם תווך גידול לעוברים. כל עובר צריך להיות בבאר נפרדת.
יש לוודא שסימון הבארות מדויק, כך שיהיה ברור איזה מאכסן מקביל לאיזה תורם לאחר השלמת העברת העדשה. יש לאפשר לעוברים להתפתח בטמפרטורה של 28.5 °C עד לזמן הרצוי. לצורך תצפית פנוטיפית, אנו בוחנים בדרך כלל את בידול העדשה בתוך יום עד יומיים.
העדשה שהופקה מהתורם צריכה לשמור על ביטוי GFP לאחר השתלה לעין המאחס. אם פנוטיפ מוטנטי אינו מחליץ בסביבת טיפוס פרא (wild type), הדבר מעיד על כך שהפנוטיפ הוא אוטונומי. עם זאת, אם הוא מחליץ, הפנוטיפ נחשב לבלתי-אוטונומי.
ולכך יש השלכות חשובות על תפקוד הגן שבבסיס התהליך. הרגע הדגמנו בפניכם כיצד לבצע השתלה של העדשה בעובר דג הזברה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להיות זהירים מאוד באופן שבו מעצבים את המחטים ובאופן שבו מבודדים את העדשה עצמה.
בנוסף, יש לסדר את העוברים במהירות לפני שיתרחש גלגול של הביצה עם השלמת ההשתלה. אין לשכוח להוסיף מצע גידול לעוברים לשמונה מבחנות אינקובציה. זהו התהליך.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את התפתחות העדשה בדגי zebrafish, תוך התמקדות באינטראקציות בין העדשה לרקמות הסובבות אותה. ניסוי להשתלת עדשה מבוצע כדי לקבוע אם הגודל הרדוד של העדשה שנצפה במוטציות מסוימות של zebrafish נובע מגורמים פנימיים או מאינטראקציות לקויות של הרקמות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- גנטיקה
רקע
- דגי זברה משמשים כבעל חיים מודל לחקר התפתחות העין.
- מוטציות בדגי זברה עלולות להוביל לפגמים שונים בעין, כולל חריגות בגודל העדשה.
- הבנת האינטראקציות בין העדשה לרקמות היא קריטית להשגת תובנות על תהליכי התפתחות.
- ניסויי השתלה יכולים לסייע בבירור הגורמים לפגמים אלו.
מטרת המחקר
- לבחון האם הגודל המצומצם של העדשה במוטציות של דגי זברה נובע מתכונות פנימיות של העדשה.
- להעריך את תפקידן של הרקמות הסובבות בהתפתחות העדשה.
- להשתמש בהשתלת עדשה כשיטה לחקירת אינטראקציות אלו.
שיטות שנמצאו בשימוש
- דגי זברה טרנסגניים המבטאים GFP שימשו כתורמי עדשה.
- דגי זברה מסוג בר (wild-type) שימשו כמאפחים להשתלת עדשה.
- הדגים הוכשרו בתוך תמיסה נטולת סידן לפני הניתוח.
- השתלת העדשה כללה את הסרת העדשה מהתורם והצבתה בעין המאפח.
תוצאות עיקריות
- העדשה המשתולה הראתה פלואורסצנציית GFP במארח, מה שאישר את הצלחת ההשתלה.
- התוצאות מעידות כי הפרעות בגודל העדשה עשויות להיות מושפעות מרקמות סביב.
- מתודולוגיית ההשתלה הוכחה כיעילה לחקר התפתחות העדשה.
- נדרש ניתוח נוסף כדי לבחון את המכניזמים העומדים מאחורי הפנוטיפים שנצפו.
מסקנות
- השתלת עדשה היא טכניקה בעלת ערך לחקר ביולוגיה התפתחותית.
- אינטראקציות בין העדשה לרקמות סביבתיות הן קריטיות להתפתחות תקינה של העדשה.
- מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בזיהוי גורמים ספציפיים המעורבים באינטראקציות אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרגי ניהול
השתלה של עדשה בדגי zebrafish מאפשרת הפרדה מדויקת בין השפעות גנטיות אוטונומיות לתא לבין השפעות לא אוטונומיות בהתפתחות העין, ובכך מספקת מידע ישיר לאסטרטגיות של תיקוף מטרות עבור הפרעות התפתחותיות של העין. גישה זו מעניקה ביטחון ניבוי בהבחנה בין פגמים פנימיים של העדשה לבין פגמים הנובעים מאינטראקציות בין רקמות, ובכך תומכת בקבלת החלטות מותאמות סיכון בשלבי הגילוי המוקדמים ובבחירת מודלים פרה-קליניים. יכולתה של השיטה להסיר עמימות מכניסטית משפרת את תעדוף הפורטפוליו עבור תוכניות טיפוליות פתולוגיות של העין.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה פונקציונלית של אוטונומיה גנטית בפיתוח העדשה באמצעות שילובים של רקמות מוטנטיות ורקמות מסוג פראי (wild-type).
- תומך בהסרה של סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין מניעים פנימיים למניעים חיצוניים של פנוטיפים מוטנטיים.
- מסייע בביטחון חזוי בבחירת מטרות עבור מודלים של מחלות עיניות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקיים מערכות של דגי זברה, המוגדרות גנטית ומאומתות, לצורך סריקה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- מאפשר הערכה כמותית הניתנת לשחזור של תוצאות התמיינות העדשה והצלה (rescue) באמצעות סימון GFP.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך הערכת התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות בהתפתחות העין.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פנוטיפים של עדשת דג הזברה לביולוגיה של עין חולייתים, ובכך תומכת בפיתוח של סמנים ביולוגים תרגומיים.
- מספקת רציפות מגילוי גנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות מועמדות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- מפחיתה סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי הבהרת תפקוד הגן בהקשר של אורגניזם שלם.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת השתלה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, ומגשרת בין תיקוף מטרות גנטיות לבין פנוטיפ פונקציונלי במודל של בעלי חולחולות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי אוטונומיה גנטית ואינטראקציה בין רקמות בהתפתחות העדשה.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של הצלה של העדשה או התמדה של פנוטיפים מוטנטיים.
- אנליזה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תוצאות פנוטיפיות בין קבוצות ניסוי באמצעות סמני GFP.
- מחקר תרגומי: מסייע בהתאמה של פנוטיפים של דגי זברה למנגנונים של מחלות עיניים אנושיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכת מוטציות גנטיות מגוונות והתערבויות מועמדות בהתפתחות העין.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות להפרעות עיניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי השתלה ופנוטיפיקה עבור מחקרים הניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הבהרת תפקוד הגנים ואינטראקציות רקמתיות בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות גנטיות ומערכות מודל למחקר ופיתוח אופתלמולוגי, תוך התחשבנות בסיכונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, מיקרו-דיסקציה ואפיון פנוטיפי מבוסס פלואורסצנציה.
- דורש מכשור ייעודי למניפולציה של עוברים ודימות של רקמות המסומנות ב-GFP.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרוטוקולי השתלה ודירוג.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול ופיתוח כלים גנטיים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות טכנית בהצלחת ההשתלה ובהערכה הפנוטיפית.
