Name: השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למד השתלת עדשה ב-Danio rerio לחקירת אינטראקציות רקמות בעין. שיטה זו מאפשרת לקבוע האם מוטציות משפיעות על העדשה באופן אוטונומי או תלוי סביבה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הליך זה כדלקמן במידה רבה את טכניקת השתלת שפותחה עבור דג המערה על ידי המעבדה של ביל ג&#39;פרי.

חלק 1: הכנת עוברים בפרוטוקול זה, נשתמש בסמל JJ xy לציון מוטציה היפותטי העדשה דג הזברה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זני דג הזברה נשמרים בתנאים מתקן סטנדרטי דגים ב-C 28.5 על מחזור light/10h 14h כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בערב, זכרים ונקבות מקום של ג&#39;יי ג&#39;יי זן דג הזברה xy: AB / TU; TG (mGFP) במיכל עם מחיצה כדי להפריד אותם אחד מהשני. הצאצאים של צלב זה יבטא את transgene GFP ברקמות כולם, ישמש תורמים. במקביל, השתמש בפרוצדורה זהה כדי להגדיר חוצה בין הלא מהונדס wild-type בעלי חיים. בהתאם לצורך ניסוי זה, אפשר לחצות את חיות הבר מסוג ב מוקד JJ xy כמו תורמים או המארחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שעה אחת לאחר שהאור נדלק בבוקר, להסיר את המחיצות כדי לאפשר דגים להזדווג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15-30 דקות לאסוף עוברים 100 x 15 מ&quot;מ צלחות פטרי, לנקות אותם, ולשנות את המדיום (מים ביצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העוברים 28.5 C החממה עד הזמן הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן להשתלה, להסיר את סיסית ידני עם שני זוגות מלקחיים חדים, דגירה עוברים EDTA 0.2% ב-ZFR סידן חינם במשך 30 דקות. </li></ol> חלק 2: הכנת מחטים לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך ההשתלה דורשת שני סוגים של מחטים: אחת חידד, המשמש לחתוך הרקמות הסובבות את העדשה, להסיר את סיסית, ועוברים שחרור agarose וכן מחט קהה המשמש כדי להזיז את העדשה התורם להכניס אותו לתוך המחשב המארח. כאן אנו יראה לכם כיצד לעשות את המחטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, קצה פיפטה פסטר חייבים להיות מנותקים באמצעות סכין יהלום. ואז להוסיף כוס נימי אל קצה פיפטה פסטר כך כמחצית אורכו בתוכו. זה יקל לשתק את החוט טונגסטן על ידי המסת אותו לתוך הכוס בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להוסיף תיל טונגסטן דק לתוך סוף הפתוחים של נימי. ממיסים את הכוס על חוט עם מבער בונזן. בעזרת מלקחיים, להחזיק בסוף יציב את הכוס עם חוט המתכת תוך פיתול את הקצה השני של המחט עם היד שלך. הזכוכית מרוככת ספירלה סביב המתכת צריך מרתק אותו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה עושה מחט קצה קהה, אז זה הסוף של ההליך. כדי ליצור מחט חידד, החזק את החוט טונגסטן מעל מבער בונזן עבור 1-1.5 דקות, שורף את המתכת כך טיפ יפה מאוד נוצר. בדוק את איכות טיפ על ידי microscropy.It הוא רעיון טוב לעקר הן מחטים הלהבה לכמה שניות מיד לפני ההשתלה. </li></ol> חלק 3: הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידן חינם (ZFR) דג הזברה Ringer של פתרונות (116 mM NaCl, KCl mM 2.9, 5 HEPES מ&quot;מ, pH 7.2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.2% EDTA בסידן ללא פתרונות דג הזברה של רינגר (pH 7.2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.2% agarose (נקודת התכה נמוכה) ב-ZFR סידן חינם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.2% agarose (נקודת התכה נמוכה) ב-ZFR סידן חינם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני עובריים (pH 7.0, לליטר מכיל: 10 מ&quot;ל פתרון הנקס # 1, 1ml פתרון הנקס # 2, פתרון 10ml הנקס # 4, הפתרון 10ml הנקס # 5, 0.35 גרם נתרן ביקרבונט, 300 UL של 2M HCl, פניצילין, סטרפטומיצין 500.000 U) כפי שמתואר בספר דג הזברה (אוניברסיטת אורגון Press, 2000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיל טונגסטן, מצופה זהב, בקוטר של 0.1mm, אלפא Aesar </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור נימי, בקוטר של 1.0mm, Precision Instruments העולם </li></ol> חלק 4: הליך השתלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור פלסטיק צנטריפוגות, להכין 1.2% נמוך נקודת התכה agarose ב-ZFR סידן חופשי שחומם מראש ל-C 40 באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הרצוי (30 hpf, למשל), לקחת את העוברים פיפטה פסטר, לאט לגרש אותם לתוך הצינור צנטריפוגות, ולאט לאט לגרש אותם לתוך הצינור צנטריפוגות ו דגירה במשך כ 5 שניות. התורמים ומארחים צריך להיות מודגרות בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טפטפת, לקחת את העוברים agarose 1.2% מהצינור צנטריפוגות ומסדרים אותם בשתי שורות מקבילות צלחת פטרי 100mm קלקר, שמירה המארחים ותורמים נפרד. עד pipetting אותם לאט ובזהירות, רוב העוברים ישקר על צדם של agarose. יהיה עליך לכוון את אלה שאינם שוכבים בתנוחה זו באמצעות מחט קהה כך העין כלפי מעלה לפני agarose מתמצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן agarose 1.2% לחזק ולאחר מכן כיסוי זה עם 0.2% נקודת התכה נמוכה פתרון agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט חידד, להסיר כל agarose סביב העיניים, מאוד בזהירות לחתוך את העדשה מן המארח עוברים התורם באמצעות משיכות קטנות. הקפד לחתוך מספיק קרובים העדשה כדי לא לקרוע אותו, אבל גם אז אתה לא להסיר רקמה מדי משאר עין המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע חופשי, עדשות יצוף במדיום. באמצעות מחט בוטה, בזהירות לדחוף את התורםהעדשה בדיוק מעל המיקום של איפה לארח את העדשה יהיה כרגיל, ולאחר מכן לדחוף אותו לתוך העין עם המחט קהה. העדשה עשויה לארח להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר עוברים התורם המארח agarose 1.2% עבור 30-60 דקות, ואז לשחרר אותם מן agarose באמצעות מחט חדה, ולהעביר אותם לתוך צלחת של 24 באר עם המדיום העובר. כל העובר צריך לכבוש גם נפרדים. הקפד לתייג את בארות כראוי כך ברור אשר מתאים לארח אשר תורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב 28.5 ג התורם הנגזרות העדשה ניתן להבחין בין העדשה מארח בצד unoperated של החיה אותו מבוסס על ה-GFP פלואורסצנטי. מדורים אפשר גם למדוד את גודל העדשה כדי לקבוע אם הוא מבדיל כראוי. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig1.jpg" alt="דמות 1" /> איור. 1 תמונה בהגדלה נמוכה של מחט חידד המשמש השתלת עדשה. זכוכית נימי (ב) מוכנס לתוך פיפטה פסטר (א), וכן חוט דק טונגסטן (C) מוכנס לתוך סוף הפתוחים של נימי. הזכוכית מעל החוט הוא התרכך עם מבער בונזן. בעזרת מלקחיים, להחזיק בסוף יציב את הכוס עם חוט המתכת תוך סובב את הקצה השני של פיפטה פסטר עם היד שלך. הזכוכית מרוככת צריך ספירלה סביב המתכת, לופת אותו במקום. <img src="/files/ftp_upload/1258/fig2 1258.png" alt="" width="600" height="204" /> איור. 2 טיפים של שני סוגים של מחטים המשמשים השתלת עדשה. <img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig3.jpg" alt="דמות 3" /> איור. 3 עוברים עברה השתלת עדשה ב 30hpf. המוצגים הם עובר התורם (A, B), עין מארח עם עדשה המושתלים (C, D), ואת הצד מלאה של העובר מארח (E, F). כל עין מוצג באור הן מועבר תאורה UV כמצוין. התמונות צולמו ב hpf 48. Q01 [9] קו מהונדס נעשה שימוש בניסוי הזה.

<ol><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289, 631-633 (2000).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+vision+in+the+zebrafish%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of vision in the zebrafish(Danio rerio).</a> Dev Biol. 180, 646-663 (1996).</li>
<li>Schmitt, E., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+morphogenesis+in+the+zebrafish.+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.comp.+Neuro%22%5BJournal%5D)">Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio.</a> J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).</li>
<li>Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+forward+genetics--analysis+of+neuronal+diversity+and+patterning+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina.</a> Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).</li>
<li>Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+to+the+analysis+of+eye+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish.</a> Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+study+neurogenesis+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina.</a> Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutagenesis+yields+eye+morphological+mutants+with+retinal+and+lens+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects.</a> Vision Res. 42, 535-540 (2002).</li>
<li>Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).</li>
</ol>

צעדים אחדים דורשים תשומת לב מיוחדת במהלך השתלות העדשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חידד מחטים: עדיף להכין מחטים מספר לפני ביצוע השתלת עדשה, וקצה מחטים צריך להיות דק ככל האפשר. מחט עבה יקרע רקמות יותר בגלל קוטר רחב יותר שלה, גורם לכישלון בעין לרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידור עוברי: ממש לפני השתלת אתה חייב למקם את העוברים ולכן הם שוכבים על צדם. כאשר מיקום, agarose 1.2% להקשיח יכול מהר מאוד....

<table><tbody><tr><td>חוט טונגסטן בקוטר 0.1mm</td><td>A Johnson Matthey</td><td>45086</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (נקודת התכה נמוכה)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346</td><td></td></tr><tr><td>קפילרות זכוכית בורוסיליקט</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW 100-4</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת פסטור</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>משאבת פיפטה</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Cardinal Health</td><td>D1906</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלת עדשה של דג הזברה application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

העדשה משחק תפקיד חשוב בהתפתחות של כוס הראייה [1,2]. השימוש דג הזברה כמודל אורגניזם, שאלות לגבי התפתחות העדשה ניתן לטפל. דג הזברה הוא שימושי עבור מחקרים גנטיים בשל יתרון מאפיינים, ובהם גודל קטן, פוריות גבוהה, מחזור חיים קצר, וקלות לטיפול. פיתוח עדשה מתרחשת במהירות דג הזברה. עד hpf 72, העדשה דג הזברה הוא בוגר תפקודית [3]. משאבים גנטיים מולקולריים שופע זמינים כדי לתמוך במחקר דג הזברה. בנוסף, הדמיון של העין דג הזברה לאלה של חוליות אחרים מספק בסיס השימוש בו במודל חיה מעולה של פגמים אנושיים [4-7]. מוטנטים דג הזברה מספר מפגינים ליקויים העדשה, כולל רמות גבוהות של מוות של תאים, אשר בחלק מהמקרים גורמת לניוון מוחלט של רקמות העדשה [8]. כדי לקבוע אם הפרעות העדשה הן בשל גורם פנימי או פגום אינטראקציות עם הרקמות הסובבות, השתלת עדשה לתוך העין מוטציה wild-type מבוצע. באמצעות אש מלוטש מחטים מתכת, עדשות מוטנטי או wild-type הם גזור בקפידה מן החי התורם, והועבר לתוך המארח. כדי להבדיל בין הרקמות wild-type ו - מוטציה, קו מהונדס משמש התורם. קו זה מבטא קרום הנכנס GFP ברקמות, כולל העדשה. טכניקה זו השתלה היא כלי חיוני במחקרים של מוטנטים דג הזברה העדשה.

העדשה כוללת פיתוח אינטראקציות עם רקמות אחרות. מספר מוטציות עין דג הזברה מתאפיינים בגודל העדשה קטן באופן חריג. כאן אנו מדגימים השתלת עדשה הניסוי כדי לקבוע אם פנוטיפ זה נובע גורם פנימי או אינטראקציות עם רקמות פגומות המקיפים את העדשה.

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

העדשה ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות הגביע האופטי[1,2]. באמצעות שימוש בדג הזברה כאורגניזם מודל, שאלות הנוגעות להתפתחות העדשה...

כדי להתחיל בהשתלת עדשה בדגי זהב, תורמים טרנסגניים המבטאים GFP ומקבלים מסוג wild type מודגרו תחילה למשך 30 דקות בצלחות פטרי נפרדות המכילות תמיסת ריינגר לדגי זהב נטולת סידן. לאחר מכן, זחלי הדגים נטמעו בשתי שורות מקבילות באגרוז בנקודת התכה נמוכה. שורה אחת, A, מיועדת לתורמים והשנייה, B, למקבלים. עבור המקבלים, העין כולה מוסרת מהתורם, בעוד שמהמקבל מוסרת רק העדשה.הרקמות המקיפות את העדשה התורמת מוסרות לפני השמת העדשה בעין המאחסת. לאחר ההשתלה, הדגים נשמרים בפלטות 24 בארות מסומנות. העדשה המושתלת אמורה להפגין פלואורסצנציית GFP במאחסת.באופן טבעי, העין הנגדית של המארח לא עברה ניתוח ואינה מבטאת GFP. היי, אני Yj. ואני Kaya McCullough, ואנחנו מהמעבדה של Dr.Yma Maki במחלקה לפתלוגיה של העין בבית הספר לרפואה של הרווארד. היום נדגים לכם פרוצדורה להשתלת עדשה בדגי zebrafish מסוג wild type בשם Daniel Rio.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי להשתיל עדשות מבעלי טיפוס פרא לבעלי מוטציה ולהיפך. דבר זה מאפשר לנו לקבוע האם גנים מוטנטיים פועלים בעדשה באופן אוטונומי או לא אוטונומי. אז בואו נתחיל.זני דגי זברה מתוחזקים בתנאי מתקן דגים סטנדרטיים בטמפרטורה של 28.5 °C במחזור של 14 שעות אור ו-10 שעות חושך. בערב שלפני הניסוי המתוכנן, מניחים זכרים ונקבות במכל עם מחיצה המפרידה ביניהם. הגנוטיפ של דגים אלה צריך להניב צאצאים עם ביטוי GFP וכל מוטציה רלוונטית. במקביל, השתמש באותו הליך להקמת הכלאות בין בעלי סוג בר (wild type) שאינם טרנסגניים בתוך שעה אחת.לאחר הדלקת האור בבוקר, יש להסיר את המחיצות כדי לאפשר לדגים להתרבות. לאחר 15 עד 30 דקות, יש לשפוך את מי האקווריום למסננת כדי לאסוף את העוברים, ולאחר מכן לשטוף אותם בעזרת התזת מי ביצים מבקבוק שטיפה לתוך צלחת פטרי של 100 על 15 מילימטר. לאחר מכן, יש לנקות את הביצים על ידי שאיבה בפיפטה של ביצים לא מופרות ושל כל שארית פסולת.החליפו את מי הביצים הישנים במי ביצים חדשים. ניתן לאחסן את העוברים באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 degree C לפני השתלת העדשה. כאשר תהיו מוכנים להמשיך בהשתלה, הכינו את העוברים על ידי הסרה ידנית של הכוריון.באמצעות מחט מתכת ופינצטה, יש להדגיר כעת את העובריים שעברו הסרת דף ביצוי (dec coated) ב-0.2% EDTA ב-ZFR נטול סידן למשך 30 דקות. במהלך ההדגרה, ניתן להכין את המחטים הדרושות לדיסקציה. הליך ההשתלה דורש מחט מחודדת כדי לחתוך את הרקמות הסובבות את העדשה ולהוציא את העובריים מהמקור.נדרשת גם מחט קהה כדי להזיז את העדשה התורמת ולהחדירה למקבל. כדי להכין כל אחת מהמחטים, ראשית יש לחתוך את קצהו של פסטור-פיפט באמצעות סכין יהלום. לאחר מכן, יש להחדיר קפילרה מזכוכית לתוך קצה הפסטור-פיפט כך שכשמחצית מאורכה תהיה בתוכו. יש להחדיר בזהירות תיל טונגסטן דק לתוך הקצה הפתוח של הקפילרה באמצעות להבה.המיסו את הזכוכית מעל התיל; החזיקו את קצה הזכוכית ביציבות באמצעות פינצטה עם תיל מתכת תוך כדי סיבוב של הקצה השני של המחט. הזכוכית הרכה אמורה להסתובב סביב המתכת ולהינעל עליה. פעולה זו יוצרת מחט קהה כדי להכין מחט מחודדת.החזקו את תיל הטונגסטן מעל להבה למשך דקה עד 1.5 דקות כדי לשרוף את המתכת, כך שייווצר חוד עדין מאוד. בדקו את איכות החוד באמצעות מיקרוסקופיה.קצה טוב לא צריך להיות כפוף או מעוקל ועליו להסתייים בחישוב הדרגתי לנקודה דקה, שקוטרה אינו עולה על 50 micrometers. סטריליזציה של שתי המחטים בלהבה למשך מספר שניות, והמתנה לקירורן לפני תחילת הפרוצדורה בתוך מבחנת צנטריפוגה מפלסטיק; הכן 1.2% low melting point aros ו-ZFR נטול סידן שחומם מראש ל-40 degree C במקלחית. בשלב הרצוי, שאב את העוברי התורם באמצעות פיפט פסטור והזרק אותם לאט למבחנת הצנטריפוגה המכילה aros. דגרי את הביצים ב-aros למשך כחמש שניות.הוציאו את העוברים באמצעות הפיפט וסדרו אותם בשורה בתוך צלחת פטרי מפוליסטירן בקוטר מאה מילימטר על ידי פיפטור איטי וזהיר; רוב העוברים יונחו על צדם כאשר העין פונה כלפי מעלה. כעת חזרו על תהליך זה עם ביצי המארח וסדרו אותן בשורה מקבילה לביצי התורם לפני שהאגרוס יתמצב. השתמשו במחט קהה כדי לסובב עוברים שאינם oriented כראוי, כך שהעין תפנה כלפי מעלה לאחר שהאגרוס התמצב.כסו את הדגימה בפתרון aro בנקודה נמוכה של התכה בריכוז 0.2%. באמצעות מחט מחודדת, הסירו את ה-aros מסביב לעיניים וגזרו בזהירות רבה את עינית התורם כולה, שצפה על פני הנוזל. לאחר מכן, שחררו את העדשה מהעין.פעולה זו מתבצעת על ידי גרירת המחט דרך רקמת העין מלמטה למעלה. עבור המארח בלבד. העדשה נחתכת באמצעות תנועות קצרות של מחט מחודדת, תוך חיתוך קרוב ככל האפשר לעדשה מבלי לקרוע אותה.הימנעו מהסרה מרובה מדי של רקמה משאר עין המארח. לאחר השחרור, העדשות יצופו בתווך. בעזרת מחט קהה, דחפו בזהירות את עדשת התורח למיקום שמעל למיקום של עדשת המארח, ולאחר מכן דחפו אותה למטה אל תוך המיקום בעזרת מחט קהה.ניתן להשליך את עדשת המארח. השאר את עוברים התורם והמארח ב-1.2%Aros למשך 30 עד 60 דקות. מדיום עוברים יסייע בריפוי הפצע.לאחר מכן, שחררו אותם מה-agros באמצעות מחט מתכת מחודדת. העבירו את העובריים לפלטה של 24 בארות עם תווך גידול לעוברים. כל עובר צריך להיות בבאר נפרדת.יש לוודא שסימון הבארות מדויק, כך שיהיה ברור איזה מאכסן מקביל לאיזה תורם לאחר השלמת העברת העדשה. יש לאפשר לעוברים להתפתח בטמפרטורה של 28.5 °C עד לזמן הרצוי. לצורך תצפית פנוטיפית, אנו בוחנים בדרך כלל את בידול העדשה בתוך יום עד יומיים.העדשה שהופקה מהתורם צריכה לשמור על ביטוי GFP לאחר השתלה לעין המאחס. אם פנוטיפ מוטנטי אינו מחליץ בסביבת טיפוס פרא (wild type), הדבר מעיד על כך שהפנוטיפ הוא אוטונומי. עם זאת, אם הוא מחליץ, הפנוטיפ נחשב לבלתי-אוטונומי.ולכך יש השלכות חשובות על תפקוד הגן שבבסיס התהליך. הרגע הדגמנו בפניכם כיצד לבצע השתלה של העדשה בעובר דג הזברה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להיות זהירים מאוד באופן שבו מעצבים את המחטים ובאופן שבו מבודדים את העדשה עצמה.בנוסף, יש לסדר את העוברים במהירות לפני שיתרחש גלגול של הביצה עם השלמת ההשתלה. אין לשכוח להוסיף מצע גידול לעוברים לשמונה מבחנות אינקובציה. זהו התהליך.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

lens-transplantation-zebrafish-its-application-analysis-eye

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול שפותח כדי לנתח עדשות של דגי זברה בוגרים וזחלים כדי לנתח את המורפולוגיה של העדשה הקורטיקלית ואת השלמות המבנית של תפרי העדשה.

דיסקציה של עדשת העין: טכניקה לצפייה במורפולוגיה של עדשת דג הזברה

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור היא כלי מצוין להדמיית התפתחות עוברית. הוא מאפשר הקלטה של סרטוני זמן-lapse ארוכים של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. אנו מדגימים את היישום שלו להדמיית התפתחות עין דג הזברה על פני קני מידה רחבים מרחביים-זמניים ומציגים צינור לאיחוי ודה-קונבולוציה של מערכי נתונים מרובי תצוגות.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

כאן, אנו נדון פרוטוקול השיטה אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה neoangiogenesis ושינויים מבניים.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

פרוטוקולים אלה פותחו כדי לנתח מורפולוגיה עדשה קורטיקלית, שלמות מבנית של התפרים העדשה דג זברה בעדשות קבועות וחיות למדוד את המיקום של גרעין העדשה דג זברה לאורך הציר האחורי הקדמי.

הערכה של השפות הגרעין של העדשה Zebrafish ושלמות הsutural

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

למד השתלת עדשה ב-Danio rerio לחקירת אינטראקציות רקמות בעין. שיטה זו מאפשרת לקבוע האם מוטציות משפיעות על העדשה באופן אוטונומי או תלוי סביבה.

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

גלה סרטונים נוספים