Name: השער המוח: בניתוח עיניים הפרימאטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למד את שיטת ניתוח הרשתית בפרימטים לא-אנושיים לחקר אנטומיה רטינלית ומחלות עיניים אנושיות. השיטה כוללת חילוץ כדורי העין, הסרת קרנית ועדשה, והשטחת הרשתית לניתוח מורפולוגי מפורט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות Ikiel Ptito עבור התמיכה הטכנית שלו. אנו מודים פרנק ארווין, רוברטה Palmour ואנשי מדעי ההתנהגות קרן מעבדות ממוקם בסנט קיטס, הודו המערבית, על המשך התמיכה עבודתם הפרימטים שלנו.

חלק 1: טרום עיבוד של רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות צריך להיות perfused היטב עם paraformaldehyde, glutaraldehyde, או פורמלין. זו יכולה להיות מושגת באמצעות זלוף transcardial הסטנדרטית המשמשת בדרך כלל כדי לקצור איברים אחרים. מומלץ כי זמן קצר לאחר להקריב את העיניים להיות מוזרק עם מקבע רק תחת עדשת ומאוחסנים מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחקר הנוכחי הנושא היה מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ&quot;ג / ק&quot;ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד exsanguinated לחלוטין. זה ואחריו פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר). </li></ol> חלק 2: הסרת גלגל העין מחלל מסלולית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור גישה קלה יותר גלגל העין מומלץ להסיר תחילה את המוח. לאחר במוח הוסרה עצם דק דופן במסלול היא ברורה ממבט ראשון. השתמש rongeurs העצם לאט לפורר את החומה של מסלול. לחתוך את שרירי העין עם אזמל ולהסיר את רקמת החיבור של גלגל העין. לחתוך בזהירות את עצב הראייה, זה יכול לשמש במחקרים מיקרוסקופיה אלקטרונית. גלגל העין אמור כעת להשתחרר חלל מסלולית. </li></ol> חלק 3: מנתחים את הרשתית מן עיינית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העין לתוך צלחת פטרי עם PBS לשמור על הרשתית מפני התייבשות. מיקרוסקופ לנתח או שולחן רכוב מגדלת לעמוד באור שימושי לנתיחה, אך לא הכרח. הסר את הקרנית על ידי חיתוך sclera הדוק למתחם של הקרנית ברמה של serrata אורה עם זוג מספריים באביב ולהסיר את העדשה עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכחול, מלקחיים, ומספריים באביב כדי להסיר את הרשתית מן בלובן העין. הדבר נעשה על ידי הפרדת הרשתית מן בלובן העין ולאחר מכן חיתוך sclera משם עם המספריים. צריך לבצע את התהליך הזה במרווחים קטנים כדי לא לגרום נזק או לקרוע את רקמת הרשתית. בלובן העין אינו מופרד בקלות מן העצב שריד אופטיים כך בזהירות לחתוך את sclera סביב עצב הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו הרשתית שמרה צורה מעוגלת שלה צריך להיות שטוח לדגימה. לפני משטחת את הרשתית, שבזגוגיות, אשר יש לו את העקביות של ג&#39;לי, ניתן להסיר גוש. כדי לשטח את הרשתית על גבי שקופית, לבצע חתכים רדיאליים עם להב מספר אזמל. שבזגוגיות שיורית כעת ניתן להסיר עם נייר סינון רגיל במכחול. השכבה הרשתית תא גנגליון נחשף בשלב זה, כך קיים הכרח להיות עדין כאשר הסרת הומור זגוגי. אם עצב הראייה מחוברת עדיין דיסק אופטי, להסיר את עצב הראייה בלי לקרוע את הרשתית באמצעות להב אזמל מספריים האביב. זהו עכשיו הרשתית הר שטוח (איור 1) ואת הגומה צריך להיות ברור ככתם כהה לכיוון הזמני / הגחון מדיסק אופטי. </li></ol> חלק 4: דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישנן מספר אפשרויות עבור הדגימה את הרשתית. כאן נתאר את ההכנות flatmount ודגימה isodentric. עבור פרוצדורות הן flatmount הרשתית עם שכבת סיבים אופטיים מן השקופית. אם הכוונה היא לבחון את תא הגנגליון ברשתית השכבה בהכנת flatmount, יש צורך להסיר או להלבין את פיגמנט אפיתל. כדי להסיר את האפיתל פיגמנט להשתמש במכחול קל להסיר חלק של שכבה זו, זה נוטה לגרום נזק לשכבת photoreceptor. הלבנה כולל השריית הרשתית בפתרון permanganate אשלגן (0.25%) במשך שעה 1, שטיפה במים מזוקקים, וסליקה, חומצה אוקסלית (5%) במשך 5 דקות. 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הכוונה היא לבחון את חלוקת התא המורפולוגיה של כל שכבה בכל הרשתית, ולאחר מכן אנו מציעים דגימה איזומטרי של הרשתית. הרשתית יש flatmounted בשקופית והמשיך לח עם PBS. עבור דגימה איזומטרי לחתוך חתיכות קטנות של רקמה במרחק שווה מדיסק אופטי ב, כיוונים האף הזמני, העליון והתחתון (איור 1). אין זה הכרחי כדי להלבין את האפיתל פיגמנט בהכנה זו. חלקים אלה יכולים עכשיו להיות מחולק במישור העטרה עם cryostat, vibratome, או ultramicrotome בהתאם שאלת המחקר. עבור חתך cryostat, החלקים צריכים להיות cryoprotected ב סוכרוז 30% בין לילה קפוא בהקשר של מדיום גובר על קרח יבש. לחלופין, הדגימות יכול להיות מוטבע אגר ופרוסים על vibratome. Cryostat וההכנות vibratome יהיה אמין תשואה סעיפים רזה כמו 4 מטר אם הסעיפים רזה נדרשים (למשל להכנת מיקרוסקופ אלקטרונים), יש צורך להכין את דגימות ultramicrotome. כדי לעשות זאת, הסעיפים צריך להיות פוסט קבוע tetroxide אוסמיום שעה 1 תחת fumehood. זה ואחריו התייבשות בסדרה אתנול מדורגים (50, 70, 95, 95, 100, 100%) ותחמוצת פרופילן 100%. הרקמהמוטבע אז EPON (שבץ-812 ערכת הטבעה). </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: במעבדה שלנו, אנו מבצעים באופן שגרתי אימונוהיסטוכימיה על רשתיות cryosectioned (איור 2). במקרה זה אנו מעוניינים isodensity של קולטנים קנבינואידים (CB1) ברשתית הפרימטים. יש לנו גם לבחון את ההשפעות של החשיפה אתנול טרום לידתי על מערכת הראייה הפרימטים. לשם כך, אנו מעוניינים צפיפות התאים ואת עובי השכבה ואת הגומה ברשתית ההיקפית. כדי להשיג זאת, עלינו להטביע פיסות של הרשתית ב EPON, פרוסה ב 700nm על ultramicrotome, ואת הכתם עם 1% toluidine כחול (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="דמות 1" /> איור 1 רשתית Flatmount. חתכים מחוגי משמשים לשטח את הרשתית. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2 Immunostaining. Cryosection של הרשתית ההיקפית immunostained עבור CB1 שבו תאים הגנגליון ברשתית מסומנים בכבדות עם תיוג כמה בשכבות הגרעין הפנימי לחיצוני. העובי של סעיף זה הוא 14 מ &#39;ומוכתמת בשקופית. RG - שכבת הגנגליון ברשתית; IP - השכבה הפנימית plexiform; ב - שכבת הגרעין הפנימית; OP - השכבה החיצונית plexiform; על - השכבה החיצונית גרעיני. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="דמות 3" /> איור 3 הגומה. סעיף דרך הגומה שהיה מוטבע EPON ופרוסים על ultramicrotrome ב 700nm. השכבה photoreceptor (PR) שימש כדי ליישר את הסעיפים. שימו לב עד כמה כל photoreceptors ניתן לזהות המציין זווית המתאים המטוס העטרה. מדידות צפיפות צולמו 300 מ &#39;, 500 מ&#39;, ו - 800 מ &#39;ממרכז הבור foveal באמצעות מערכת דימות Bioquant. RG - שכבת הגנגליון ברשתית; IP - השכבה הפנימית plexiform; ב - שכבת הגרעין הפנימית; OP - השכבה החיצונית plexiform; על - השכבה החיצונית גרעיני; בר בקנה מידה = 50 מ &#39;

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

ההכנה של הרשתית כמו wholemount מאפשר ניתוח של הטופוגרפיה ואת הפריסה המרחבית של השכבה או תא גנגליון או לתאי אנדותל של כלי הדם ברשתית 3. כימות צפיפות התאים בפריפריה של הרשתית הפרימטים מושגת בקלות. עם זאת, באזורים perifoveal ו foveal, הערימה של שכבות מרובות בשכבה תא גנגליון מונעת כימות. כדי לעקוף זאת הטיה פוטנציאלית, הגומה ובאזור perifoveal יכול להיות גזור מתוך הכנת wholemount, מוטבע EPON ו מחולק סדרתי באמצעות ultramicrotome לקבל חצי דקה סעיפים במישור העטרה 2,4....

<table><tbody><tr><td>סקלפל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>להבי סקלפל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>מספרי קפיץ</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>כל מספריים כירורגיים יספיקו</td></tr><tr><td>רונגאורים</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>מברשת צבע משערת גמל או שועל (Sable)</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

השער המוח: בניתוח עיניים הפרימאטים

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

מערכת הראייה בבני אדם נחשב השער העולם, משחקת תפקיד עיקרי שפע של תהליכים חושית תפיסתית וקוגניטיבית. לכן זה לא מפתיע כי איכות הראייה קשורה איכות החיים. למרות מחקר קליני ובסיסי נרחב המקיף את הסיבות של הפרעות ראייה, צורות רבות של ליקויי ראייה, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה ניוון מקולרי, העדר טיפולים יעילים. Non-אנושי הפרימטים יש תכונות כלליות הקרוב של התפתחות העין לזו של בני האדם. לא רק שיש להם אנטומיה של כלי הדם דומה, אבל בקרב יונקים אחרים, יונקים יש מאפיין ייחודי של בעל האזור ברשתית הזמני מיוחדים עבור חדות הראייה גבוהה, את הגומה<sup&gt; 1</sup&gt;. כאן אנו מתארים טכניקה כללית לנתח את הרשתית הפרימטים לספק רקמה היסטולוגיה אימונוהיסטוכימיה רשתית, microdissection לייזר ללכוד, כמו גם אור במיקרוסקופ אלקטרונים. עם השימוש המורחבת של פרימטים לא אנושיים כמודל translational, תקוותנו היא כי הבנה משופרת של הרשתית יספק תובנות גישות יעיל לקראת הפחתת או להפוך את ההשפעה השלילית של הפרעות ראייה על איכות החיים של אנשים מושפעים.

פרימטים שאינם בני אדם היא מין translational חשוב להבנת התפתחות והזדקנות. הארגון האנטומי של הרשתית הפרימטים עשויה לספק תובנות חשובות בתנאים נורמליים ופתולוגיים אצל בני אדם.

המערכת החזותית בבני אדם נחשבת לשער לעולם וממלאת תפקיד מרכזי בשפע של תהליכים תחושתיים, תפיסתיים וקוגניטיביים...

הליך זה מתחיל בראש של קוף עם אספקת דם טובה. לאחר הסרת המוח, מוצאים את גלובוסי העין ומחברים אותם. לאחר ניקוי הרקמות, מסירים בזהירות את הקרנית, העדשה, הלובן ונוזל הזגוגית, ובכך משחררים את הרשתית.את הרשתית מניחים בצורה שטוחה על תבנית זכוכית, ומסלקים את שארית הנוזל הזגגי. לאחר מכן לוקחים דגימות של Iso Dentrix ומבצעים להן הגנה בקירור (cryoprotection). שלום, אני ד"ר מארק ברק מהמעבדה למדעי העצבים הראייתיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול.שלום, אני ד"ר שאהין זור, גם אני מהמעבדה למדעי העצב הראייתיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול. שלום, אני ד"ר טיטו, מנהל המעבדה למדעי העצב הראייתיים בבית הספר לאופטומטריה, אוניברסיטת מונטריאול. היום נראה לכם הליך לניתוח רשתית של פרימט שאינו אדם.אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור היבטים שונים של ארגון הרשתית בהתפתחות נורמלית ובתגובה להפרעות התפתחותיות. אז בואו נתחיל. התחילו את הפרוטוקול עם ראש של פרימט, אשר ביצעתם לו פרפוזיה מראש.בשימוש בחומר מקבע כגון Paraformaldehyde, הרשתית שתשמש להדיסקציה כאן תהיה מופקת מקוף ורווט. כדי להבטיח את שימור העין, ניתן להזריק חומר מקבע כגון paraformaldehyde ממש מתחת לעדשה. יש לשמור את הראש במקבע או ב-PBS לפני השלב של הוצאת גלגוליות העיניים, על מנת להקל על הגישה אליהן.ראשית, הוצא את המוח. כדי לצפו

the-gateway-to-the-brain-dissecting-the-primate-eye

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרימטים שאינם בני אדם היא מין translational חשוב להבנת עיבוד תקין של המוח. הארגון האנטומי של המוח הפרימטים יכול לספק תובנות חשובות בתנאים נורמליים ופתולוגיים אצל בני אדם.

בניתוח מוח בלתי אנושי הפרימאטים בחלל Stereotaxic

הפגנה רשמית של דיסקציה של העין עכבר, וכתוצאה מכך הר שלם של אפיתל הפיגמנט ברשתית.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

מצגת וידאו זה מציגה שיטה של ​​קצירת שני המבנים החשובים ביותר בכלי הדם גבוה התומכים תפקוד מוח קדמי. הם המשטח המוחי (שטחי) vasculature יחד עם קרומי מוח קשורים (MAV) ודמה עין המקלעת שהנן הכרחיים לזרימת דם במוח ונוזל שדרה (CSF) הומאוסטזיס.

תיאור חזותי של Dissection של מערכת כלי הדם המוחית ומשטח קרום המוח הקשורים ודמה עין המקלעת ממוח חולדה

סרטון זה מתאר כיצד לנתח ולבודד את מוח הדרוזופילה הבוגר – הליך הכרחי לדמיון האיבר, שאחרת מוסתר על ידי הקוטיקולה, העין ורקמת קנה הנשימה. הפרוטוקול לדוגמה מראה הדגמה מפורטת המניבה תכשירים באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהם לשיטות אימונוסטיין והדמיה בנוירוביולוגיה של דרוזופילה.

דרוזופילה דיסקציה מוחית של מבוגרים: שיטה בנוירוביולוגיה של זבובים

סרטון זה מתאר כיצד לנתח ולבודד את קומפלקס עין-מוח מגלמי דרוזופילה. הפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך המניב רקמות באיכות גבוהה, התואמות, למשל, immunostaining, כמו גם, ניסויים אחרים ביטוי גנים.

דיסקציה של קומפלקס עין-מוח מגלמי זבובים: שיטה לבידוד רקמת רשתית

הסרת עיניים, המכונות גם אנוקלאציה, מספקת אסטרטגיה שימושית ללמוד היבטים של מודלי חוצי חזותיים,, ופלסטיות התפתחותית לאורך מערכת הראייה של יונקים שכן הוא גורם בלתי הפיך חלקית (משקפת) או אובדן ראייה (משקפת) מלא. כאן אנו מתארים גישה לשחזור וברורה מאוד לביצוע באנוקלאציה vivo.

שיטה מאוד לשחזור וישיר לביצוע בVivo Ocular Enucleation בעכבר לאחר פתיחת העיניים

מטרת נייר זה סרט הדרכה היא לתאר כיצד לחשוף ולהסיר את מוח חזיר לאחר המוות ואת בלוטת יותרת מוח במצב שלם, מתאים לניתוח מקרוסקופית היסטולוגית עוקב.

הסרת &quot;חוברת הדרכת עריפת הראש, פתיחת גולגולת, ו Brain: חשיפה של החזיר CNS לניתוח היסטולוגית

הבעות פנים הם מצב של תקשורת חזותית המיוצר על ידי השרירים מימטי. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור טכניקות הרומן של דיסקציה הפוכה ו- DiceCT כדי להמחיש באופן מלא להעריך מימטי השרירים. טכניקות משולבות אלה ניתן לבחון היבטים מורפולוגיים פיזיולוגיים של מערכת השרירים מימטי כדי לקבוע היבטים פונקציונליים.

הפוך לנתיחה ונתונים DiceCT לחשוף אחרת מוסתרים באבולוציה של הפנים הפרימטים

פרוטוקול זה מתאר ביצוע כריתת גולגולת באמצעות מקדחה פניאומטית במהירות גבוהה על חזיר דני בן 3 חודשים. הגישה נעשית דרך העצם הקדמית וחושפת את הדורה מאטר הגחוני ואת ההמיספרות המוחיות שמתחתיו. הליך זה מאפשר גישה לחלק גדול של מוח החזיר.

גישה למוח החזירי באמצעות כריתת מקדח פניאומטי במהירות גבוהה

חתך יסודי וסטנדרטי של גלובוס לא ניאופלסטי חשוב להשגת חתכים היסטופתולוגיים איכותיים הניתנים לשחזור. הנחיות להכנסה סטנדרטית של גלובוס לא ניאופלסטי למבוגרים ועוברים ניתנות כאן. אפשרויות שונות לחיתוך כדור הארץ מודגמות ונדונות, כולל קריטריונים לקבלת החלטות מבוססות מקרה.

ברוטו של גלובוס לא ניאופלסטי, כולל עיני עובר

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

למד את שיטת ניתוח הרשתית בפרימטים לא-אנושיים לחקר אנטומיה רטינלית ומחלות עיניים אנושיות. השיטה כוללת חילוץ כדורי העין, הסרת קרנית ועדשה, והשטחת הרשתית לניתוח מורפולוגי מפורט.

השער המוח: בניתוח עיניים הפרימאטים

גלה סרטונים נוספים