Name: מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למד שיטות למדידת התארכות דופן התא הצמחי (Creep) באמצעות אקסטנסומטר בכוח קבוע. חקור את השפעת חומציות וחלבוני אקספנסין על נמתנות הדופן במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

טכניקות המוצגים כאן פותחו במימון על ידי מענקים ממשרד האנרגיה (מדעי Bioenergy) ואת הקרן הלאומית למדע.

חלק 1: גידול ואחסון חומר צמחי מתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניסיוננו, hypocotyls צעירים שתילי מלפפון מולבן לשמש מקור נוח של החומר דופן התא עבור ניסויים אלו. זרעי מלפפון נזרעים על נייר רטוב בתיבה אור הוכחה, שהוא לשמור בארון חשוך בחדר טמפרטורה קבועה נקבע על 26 ° C. הטמפרטורה המדויקת אינה קריטית, כמו כל דבר בין 22 ° לבין 30 ° C אמור להיות בסדר, אבל הטמפרטורה תקבע כמה מהר השתילים מגיעים בשלב המתאים של התפתחות. חם הטמפרטורה, מהר יותר שתילים יפתחו. אנו משתמשים בדרך כלל השתילים כשהם גדלו על 5 ס&quot;מ אורך, אשר הגיעו 3-4 ימים לאחר הזריעה. חשוב כי שתיל להיות מבוגר בחושך, כמו גם כמויות קטנות של אור להשפיע הן על קצב התפתחות הנבט לבין הקיר תכונות התא אנו מודדים עם טכניקה זו. ביום 3 אתה יכול להציץ בתיבה, תוך שימוש באור עמום מסוננים ירוק, כדי לבדוק את התפתחות שתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילים נחתכים במהירות ארוזים בקופסאות פלסטיק קטנות, 100-150 שתילים בקרטון, ומאוחסנים ב -80 ° C. בטמפרטורה זו הם נשארים שימושי שבועות. </li></ol> חלק 2: הכנת קיר דגימות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצות קטנות (80-10) של שתילים חתך קפוא מועברים מהמקפיא למיכל מבודד המכיל לחסום במקפיא -80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לציפורן כיסוי hypocotyl היא הכתה עם carborundum. הדבר נעשה על ידי ציור hypocotyl שוב ושוב בין האגודל לאצבע המורה, אשר מצופה slurry עבה של אבקת carborundum רטוב. זה לוקח קצת ניסיון כדי לדעת את הסכום הנכון של הלחץ להשתמש: לחץ יותר מדי שכבת אפידרמיס מתחיל להיות גרוסים וקרוע, גם הלחץ קצת את הקוטיקולה לא יהיה permeabilized. אחת גם צריך לעבוד מהר, כי כמו מפשיר hypocotyl קפוא, הוא הופך להיות רפוי, וקשה לנהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hypocotyl הכתה הוא טבול במי קרח כדי להסיר את רוב carborundum דבקות ואז מאוחסן על מי קרח בעוד hypocotyls הנותרים מוכנים בצורה דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hypocotyls הם לחתוך לאורך הרצוי, בדרך כלל 1.2 ס&quot;מ, עם סכין גילוח הסינגל החדש קצוות, ואז התאימה בשקופית זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו אנחנו צריכים לשטח את הקירות כדי להסיר מוהל התא כדי להקל clamping. שקופיות הזכוכית השני הוא מונח על גבי קבוצה של 8-10 דגימות, ויוצרים כריך. משקל (400-500 גרם) ממוקם על גבי שקופיות הזכוכית דקות 5. עבור משקל אנו משתמשים באופן שגרתי וכוס המכילה כמות מתאימה של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונלי: בהתאם הניסוי, hypocotyls עשוי להיות מובטל עם טיפול חום קצר בשלב זה. לשם כך אנו נקשרים שקופיות הזכוכית יחד עם זוג גומיות, לשים את הרכבה במיכל עם 100 מ&quot;ל מים דה מיוננים בטמפרטורת החדר ולשים אותו במיקרוגל בעוצמה מלאה. עם מיקרוגל שלנו המים מתחיל לרתוח כ 50 שניות ואנחנו לעצור את מיקרוגל 15 s אחרי הרתיחה מתחיל. המים החמים זרמו במהירות את והחליפו עם מים קרים כדי לעצור denaturation. ייתכן שיהיה צורך להשתנות אלה תזמונים, כמו מיקרוגל שלך עשוי להיות שונה משלנו. עם חימום יתר הדגימות נעשים חלשים להישבר בקלות. עם חימום מספיק expansin אנדוגני אינו מומת לבין דגימות קיר לשמור כמה ההיענות pH חומצי. </li></ol> חלק 3: הגדרת Extensometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות הקיר הם הידק עכשיו extensometer כוח קבוע. זהו מכשיר שהותקן שמורכבת קובט פרספקס להחזקת סוף הבסיס של המדגם קיר מלחציים ניד המצורפת בסוף apical של המדגם. מהדק ניד הוא רכוב על קצה מוט שעובר דרך הסלילים פתוח של חיישן מיקום, LVDT או &quot;לינארי דיפרנציאלי משתנה Transformer&quot;, כי אלקטרונית מזהה את המיקום של גליל מתכת קטן, או &quot;הליבה&quot;, כלומר מחוברת למוט. הקצה העליון של המוט קשורה מנוף עם משקל נגד מתכווננת. מנוף זה מפעיל סכום מתכווננת של כוח כלפי מעלה על מדגם הקיר. הכוח מותאם ידי הוספה או הסרה משקולות מתכת מכויל בקצה הרחוק של הידית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרה מדגם הקיר - בסופו של דבר הבסיס של המדגם hypocotyl הוא הרים עם מלקחיים בסדר ~ 2-3 מ&quot;מ של סוף apical ממוקם בין הלסתות פתוח של מהדק ניד. מהדק זו מהדק קפיץ מתכת לסתות תנין אשר הם מצופים פלסטיק כדי למנוע מגע ישיר בין משטח המתכת הפתרון חיץ או מדגם הקיר. ב מתכת הניסיון שלנו יונים ליץ מ מהדק יכול ומעכבות את היכולת של קיר להאריך, ולכן אנחנו ממשיכים המתכת מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת הרכבה מהדק ניד ביד אחת, בסופו של דבר הבסיס של הדגימה הקיר הוא תמרן כעת בין שתי חתיכות צירים של קובט הפרספקס קובטהחלקים הם הביאו יחד קמוץ, ובכך לנעול את קצה התחתון של המדגם קיר קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האסיפה מהדק ניד עכשיו שוחרר בעדינות, המאפשר את מלוא עוצמתה של הנגד שיועברו הדגימה הקיר. אנו משתמשים באופן שגרתי משקל נגד סך של 20 גרם של דגימות קיר שהוכן hypocotyls מלפפון. קיר או חומרים אחרים עשויים לחייב ניסויים במשקלים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קובט מתמלא חיץ (200 UL) ואת המיקום של קובט עברה למעלה או למטה עם בורג התאמה, כך מהדק ניד מובא לקצה התחתון של טווח המדידה LVDT. LVDT שלנו מחוברת יחידת רכישת נתונים של המיקרו, ולכן אנו עוקבים אחר בעמדה LVDT דרך המחשב. יש לנו שמונה מכלולים LVDT מחוברים במקביל עם מחשב אחד, דבר המאפשר לנו לרוץ 8 דגימות הקיר בו זמנית. המחשב רושם את המיקום של כל אחד אסיפות LVDT פעם 30 s. </li></ol> חלק 4: תגובה הארכה כדי מדידת pH חומצי או expansin - תוצאות נציג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [הניסוי הראשון] עבור המדידה של הרחבה חומצה הנגרמת, אנחנו מתחילים עם דגימות קיר יליד (כלומר, לא מובטל בחום) ו חיץ נייטרלי מתווסף קובט. דגימות קיר להאריך במשך כמה דקות, בתגובה למתח נוסף, אך דועך הרחבה בשיעור נמוך אחרי כמה דקות. המחשב שלנו מאפשר לנו לפקח גם את השינוי באורך של המדגם (כלומר, את השינוי בעמדה של מהדק ניד, לאחר תחילת הניסוי) או שאנחנו יכולים לפקח על נגזרת של מיקום זמן, או במילים אחרות את שיעור הארכה . שיעור הארכה מייצב לערך נמוך עם הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 דקות ~, למאגר נייטרלי מוסר. אנחנו משתמשים בצינור מתכת דקה, עשוי מחט מד גדול המזרק, מחובר משאבת ואקום כדי להסיר את החיץ במהירות, עם הפרעה מינימלית של הקיר או הרכבה מכנית. חיץ חומציים הוא הוסיף אז, לפעמים עם 1-2 מהיר כדי להבטיח חילופי החליפין להשלים למאגר חומצי. אז לשבת בחיבוק ידיים ולראות את התגובה של הקיר. בדרך כלל אנחנו יכולים לזהות את קצב מהיר יותר של הרחבה תוך כמה דקות. אחרי 60 דקות בדרך כלל יש לנו מספיק מידע כדי להעריך את התגובה הרחבה, אך במקרים מסוימים המדידות עשוי להאריך את תקופות ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [ניסוי השנייה] עבור המדידה של הרחבה expansin-Induced דופן התא, אנחנו מתחילים עם חום מומת דגימות קיר חוצץ חומצי מתווסף קובט. כמו בניסוי הראשון, שיעור הארכה דופן התא בהדרגה מייצב לערך נמוך בגלל היעדר expansin תפקודית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 דקות ~, חלבון expansin מתווסף קובט על ידי &#39;spiking &quot;עם למאגר ב קובט עם UL 10-20 של פתרון expansin. Expansin במהירות חודר מדגם דופן התא ותוך כמה דקות אנו רואים כי שיעור הארכה גדל. תגובה זו יכולה להיות הרחבה במעקב במשך שעה או יותר. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> איור 1: מתאר נהלים להכנת קירות התא כדי להעריך חומצה הנגרמת או expansin-Induced הארכת הקיר.

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li>
<li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li>
<li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li>
<li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li>
</ol>

להדגמה זו השתמשנו קירות התא מן hypocotyls מלפפון כי הם הוכיחו להיות מקור אמין של דגימות הקיר כי הם קל לטפל כי להגיב ברגישות טוב. יש לנו גם הצלחה טובים עם קירות שתילים אחרים, כמו גם כמה חומרים מהסופרמרקט, כמו עלי תרד צעירים גבעולי סלרי. בעיקרון, צעיר, רך, רקמות הצמח גדל במהירות צפויות להימדד בקלות עם טכניקה זו, אבל קשוח, זקן, רקמות הצמח מחומצן או nongrowing צפויים להיות קשוב בגלל תא הקיר לחצות קישור. ישנם עוד כמה דברים להיזהר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li sty...

מדידת תא הצמח החומה הרחבה (creep) מושרה על ידי ה-ph חומצי על ידי alpha-expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

גידול הצמח קירות התא אופיינית התערוכה מאפיין בשם &quot;צמיחה חומצה&quot;, שבו אנו מתכוונים הם הרחבה יותר ב-pH נמוך (&lt;5) 1. האוקסין הורמון מגרה צמח במהירות התארכות התא נובעת צעירים ורקמות דומה לפחות חלקית על ידי מנגנון חומצה צמיחה 2, 3. אוקסין מפעיל משאבת H + בקרום פלזמה, גרימת החמצה של הפתרון דופן התא. החמצה הכותל מפעיל expansins, אשר אנדוגני קיר התרופפות התא חלבונים 4, בגרימת דופן התא להיכנע המתחים קיר שנוצר על ידי לחץ turgor התא. כתוצאה מכך, התא מתחיל להגדיל במהירות. תופעה זו &quot;צמיחה חומצה&quot; נמדדת בקלות מבודדים (הדומם) דגימות דופן התא. היכולת של קירות התא לעבור חומצה הנגרמת הארכה אינה רק תוצאה של הסדר המבני של קיר סוכרים תא (פקטינים למשל), אבל תלוי בפעילות של expansins 5. Expansins אין שום הפעילות האנזימטית ידוע שהדרך היחידה assay לפעילות expansin היא למדוד גיוסם של הרחבה דופן התא. דו&quot;ח זה מפרט את מקורות וידאו וטכניקות הכנה לקבלת חומרים קיר מתאים מבחני expansin וממשיך להראות חומצה הנגרמת הארכה expansin-Induced הרחבה של דגימות קיר שהוכן hypocotyls מלפפון גדל. כדי להשיג מתאים הקיר דגימות תאים, שתילי מלפפונים גדלים בחושך, hypocotyls נחתכים קפואים ב -80 ° C. Hypocotyls קפואים הם משופשפות, שטוח, והידק אז המתח המתמיד קובט מיוחד עבור מדידות extensometer. כדי למדוד חומצה הנגרמת הרחבה, הקירות שנאגרו בתחילה ב-pH נייטרלי, וכתוצאה מכך פעילות נמוכה של expansins כי הם מרכיבי דופן התא הילידים. עם חילופי חיץ pH חומצי, expansins מופעלים ואת קירות התא להרחיב במהירות. אנחנו גם מדגימים פעילות expansin ב assay הכינון מחדש. עבור חלק זה, אנו משתמשים טיפול בחום קצר לפגל expansins יליד בדגימות דופן התא. אלה קירות התא מומת לא להאריך גם חיץ חומציים, אך תוספת של expansins את קירות התא במהירות משחזר את יכולתם להאריך.

אנו מדגימים את השימוש extensometer כוח קבוע, למדוד לטווח ארוך הארכה (זחילה) של תא הדגימות צמח קיר המושרה על ידי מאגרים חומציים חלבון expansin.

מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin

דפנות תאי צמחים גדלים מציגות באופן מאפיין תכונה הידועה כ'צמיחה חומצית' (acid growth), שמשמעותה היא שהן בעלות יכולת התפשטות (extensibility) גבוהה יותר ב-pH נמוך (פחות מ-5) 1. ה...

כאן אנו מדגימים שיטות למדידת התפשטות ופעילות באמצעות גאומטריית התארכות של דופן התא. ניתן להכין דגימות דופן מתאימות מההיפוקוטילים של נבטי מלפפון שעברו טיפול ב-E TAT כדי למדוד התארכות מושרית בחומצה, המזורזת על ידי אקספנסינים אנדוגניים הקשורים לדפנות תא טבעיות. אנו מקבעים את הדפנות בבופר ניטרלי ובאקסטנסומטר; עם המעבר ל-pH חומצי, האקספנסינים מופעלים ודפנות התא מתארכות במהירות.אנו מדגימים גם בדיקת שחזור התפשטות. עבור חלק זה, אנו משתמשים בטיפול חום קצר כדי לדנטורציה של התפשטויות אנדוגניות. דפנות תאים שהושבתו בחום אינן נמתחות אפילו בבופר חומצי, אך הוספה של expandin מחזירה במהירות את יכולת הנתיקה של הדופן.שלום, אני דן דה רוקו מהמעבדה של ד"ר דניאל קוסגרוב במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת פנסילבניה (Penn State). היום נראה לכם פרוצדורה למדידת התארכות בלתי הפיכה או זחילה (creep) של דפנות תאים צמחיים מבודדים. אז בואו נתחיל.מניסיוננו, נבטי מלפפון צעים מהסוג המצוין משמשים כמקור נוח לחומרי דופן התא. עבור ניסויים אלה, זורעים זרעי מלפפון על נייר רטוב בתוך קופסה חסומה לאור, אשר נשמרת בארון חשוך ובחדר בעל טמפרטורה קבועה המכוון ל-26 degrees Celsius. טמפרטורות שבין 22 ל-30 degrees Celsius יעבדו גם הן, אך חשוב לציין כי הטמפרטורה תקבע את קצב הצמיחה.ככל שהטמפרטורה תהיה גבוהה יותר, כך השתילים יתפתחו במהירות רבה יותר. שמירה על סביבת גידול חשוכה היא קריטית, שכן אפילו כמויות קטנות של אור משפיעות הן על קצב התפתחות השתילים והן על תכונות דופן התא שאותן אנו מודדות בטכניקה זו. ביום השלישי, ניתן להציץ לתוך הקופסה באמצעות תאורה עמומה עם מסנן ירוק כדי לבדוק את התפתחות השתילים.בדרך כלל, כאשר בודקים את התיבה ביום השלישי או הרביעי, ימצאו שתלי נבטים שגדלו לאורך של כ-5 סנטימטרים, שזהו לרוב האורך שבו השתמשנו בניסויים שלנו. ניתן להקפיא נבטים אלו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לפני השימוש. כדי להתחיל בהכנת דגימות דופן התא, מעבירים קבוצות קטנות של 8 עד 10 נבטים חתוכים קפואים מהמקפיא למכל מבודד המכיל בלוק הקפאה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. באמצעות מריחה סמיכה של אבקת carbo run על האגודל והאצבע, מסירים את השכבה החיצונית המכסה את ההיפוקוטילי על ידי שפשוף חוזר של ההיפוקוטילי בין האגודל לאצבע.בעת ביצוע טכניקה זו, קריטי להפעיל את כמות הלחץ הנכונה שתבטיח חדירה של הקוטיקולה מבלי לפגוע בשכבת האפידרמיס. יש לעבוד במהירות, שכן ככל שה-hypo coddle קפוא מפשיר, הוא הופך רך וקשה לטיפול לצורך הסרת מרבית הקרום הדביק. את ה-hypo coddle ששחקתו נשחקת טובלים ולאחר מכן שומרים במי קרח, בזמן ששאר ה-hypo coddles מוכנים.לאחר הסרת הקוטיקולה מכל השתיליים, גוזמים אותם לאורך הרצוי, בדרך כלל 1.2 centimeters, באמצעות להב תער חד-להב חדש, ולאחר מכן מסדרים אותם על תבנית זכוכית. תבנית זכוכית שנייה מונחת מעל קבוצת הדגימות, המונה שמונה עד 10 דגימות, ומשקולת של 400 to 500 grams מונחת מעל תבנית הזכוכית למשך חמש דקות. בדרך כלל אנו משתמשים בכלי כימי (beaker) מלא בכמות מתאימה של מים.משקל הכלי יגעץ את דפנות התא כדי להסיר את מי התא ולהקל על ההידוק. בהתאם לניסוי, ניתן לנטרל את ה-hypo coddles באמצעות טיפול תרמי קצר בשלב זה. לשם כך, נקשור את לוחות הזכוכית יחד באמצעות זוג גומיות, נניח את המכלול בתוך מיכל המכיל 100 mL של מים דאיוניים בטמפרטורת החדר ונכניס אותו למיקרוגל בהספק מלא.המים מתחילים לרתוח בערך לאחר 50 שניות ואנו עוצרים את המיקרוגל 15 שניות לאחר תחילת הרתיחה; המים החמים נשפכים במהירות ומוחלפים במים קרים כדי להפסיק את הדנטורציה. חימום אופטימלי יגרום לכך שהדגימות יהיו חסרות תגובתיות ל-pH נמוך, ובו בזמן לא יהפכו חלשות ויישברו בקלות. דגימות הדופן מהודקות כעת במד מאמץ X בעל כוח קבוע.זהו מכשיר שנבנה בהתאמה אישית המורכב מקוביית פרספקס להחזקת הקצה הבזאלי של דגימת הדופן ומסבך נייד המחובר לקצה ה-APIC של הדגימה. המסבך הנייד מורכב על קצהו של מוט העובר דרך הסלילים הפתוחים של חיישן מיקום LVDT (linear variable differential transformer), אשר מזהה באופן אלקטרוני את מיקומו של גליל מתכת קטן או ליבה המחוברים למוט.הקצה העליון של המוט מקושר למנוף עם משקולת נגד ניתנת לכיוונון. מנוף זה מפעיל כוח כלפי מעלה בכמות ניתנת לכיוונון על דגימת הדופן. הכוח מכוון על ידי הוספה או הסרה של משקולות מתכת מכויילות לקצה הרחוק של המנוף, כדי להכין דגימות למדידה של התרחבות דופן התא.את הקצה הבסאלי של דגימת ההיפוקוטיל תופסים בעזרת פינצטה עדינה בטווח של שתיים עד שלוש מילימטרים מהקצה האפיקלי, ומניחים אותו בין הלסנאות הפתוחות של התפס הנייד. תפס זה הוא תפס תנימית בעל קפיץ. הלסנאות המתכתיות מצופות בפלסטיק כדי למנוע מגע ישיר בין פני המתכת לבין תמיסת הבאפר או דגימת הדופן.מניסיוננו, יוני מתכת עלולים לדלוף מהמהדק ולעכב את יכולת ההתרחבות של הדופן, ולכן אנו שומרים על המתכת מכוסה. בעוד שמחזיקים את מכלול המהדק הנייד ביד אחת, מנחים את הקצה הבסיסלי של דגימת הדופן בין שני חלקי הציר של ה-vete מפלקסיגלאס, ולאחר מכן מקרבים את חלקי ה-vete ומהדקים אותם בברגים, ובכך נועלים את הקצה התחתון של דגימת הדופן בתוך ה-vete. כעת משחררים בעדינות את מכלול המהדק הנייד, מה שמאפשר למשקל המלא של משקולות האיזון לעבור אל דגימת הדופן. אנו משתמשים באופן שגרתי במשקל איזון כולל של 20 grams עבור דגימות דופן שהוכנו ממלפפון, hypo coddles.חומרי דופן אחרים או ניסויים אחרים עשויים לדרוש משקלים שונים. את ה-qve ממלאים בבופר, ואת מיקום ה-QVE מזיזים מעלה או מטה באמצעות בורג כיוון, כך שהסוגר הנייד יגיע לקצה התחתון של טווח המדידה של ה-LVDT. ה-LVDT שלנו מחובר ליחידה לרכישת נתונים של המחשב.יש לנו שמונה מכלולי LVDT המחוברים במקביל למחשב אחד, המאפשר לנו לבחון שמונה דגימות דופן בו-זמנית. המחשב מתעד את המיקום של כל אחד ממכלולי ה-LVDT פעם ב-30 שניות למדידת התארכות מושרית חומצה. אנו מתחילים עם דגימות דופן טבעיות שאינן מנוטרלות בחום, ומוסיפים באפר ניטרלי למבחנה.מדגמי הדופן מתארכים במשך מספר דקות בתגובה למתיחה שהתווספה, אך קצב ההתארכות דועך. לאחר מספר דקות, המחשב מאפשר לנו לנטר או את השינוי באורך המדגם, שהוא השינוי במיקום של התפס הנייד לאחר תחילת הניסוי, או שניתן לנטר את הנגזרת של המיקום לפי הזמן. במילים אחרות, את קצב ההתארכות.קצב ההארכה מתייצב לערך נמוך עם הזמן. לאחר כ-20 דקות, מסירים את הבופר הנייטרלי באמצעות צינור מתכת דק העשוי ממחט היפודרמית בעלת קוטר גדול, המחוברת למשאבת ואקום, כדי להסיר את הבופר במהירות.המערך מאפשר להסיר את התמיסן במינימום הפרעה לדופן או למכלול המכני. לאחר מכן מוסיפים תמיסן חומצי, לעיתים עם אחד עד שני חילופים מהירים כדי להבטיח חליפה מלאה לתמיסן חומצי. לאחר מכן אנו ממתינים ועוקבים אחר תגובת הדופן.בדרך כלל, ניתן לזהות את קצב ההארכה המהיר יותר תוך מספר דקות. לאחר 60 דקות, יש לנו בדרך כלל מספיק מידע כדי להעריך את תגובת ההארכה, אם כי במקרים מסוימים המדידות עשויות להימשך לפרקי זמן ארוכים יותר. למדידת הארכה של דופן התא המושרה על ידי התפשטות, אנו מתחילים עם דגימות דופן המופעלות בחום, ומוסיפים בופר חומצי ל-qve.כפי שקרה בניסוי הראשון, קצב התארכות דופן התא מתייצב בהדרגה לערך נמוך בשל היעדרה של התפשטות תפקודית. לאחר כ-20 דקות של התפשטות, מוסיפים חלבון ל-Q vet על ידי הזרקה של 10 עד 20 µL מתמיס התפשטות אל תוך הבאפר ב-Q vet. מכיוון שהקוטיקולה הוסרה, התפשטות חודרת במהירות למדגם דופן התא, ותוך דקות ספורות נראה שקצב ההתארכות עלה.ניתן לעקוב אחר תגובת ההארכה הזו במשך שעה או יותר. הרגע הצגנו כיצד למדוד את הארכת דופן התא עקב אקספנסינים אנדוגניים ועקב הוספת אקספנסינים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לצמצם למינימום רעידות מכניות ותנודות בטמפרטורה, שכן אלו ייצרו רעש בעקומות ההארכה.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה עם בדיקות ההארכה שלכם.

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה למיפוי תכונות מכניות של רקמות צמחים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). אנו מתמקדים כיצד לתעד שינויים מכניים המתרחשים בדפנות התא במהלך התפתחות הצמח בקנה מידה בינוני בשדה רחב, מה שמאפשר לתאם את השינויים האלה עם גדילה ומורפוגנזה.

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

פרוטוקול הדמיה חדשני פותח באמצעות מפעיל מכני מונע מנוע מותאם אישית כדי לאפשר מדידה של תגובות בזמן אמת למתח מכני בתאים חיים. רלוונטית למכניוביולוגיה, המערכת יכולה ליישם זנים של עד 20% תוך שהיא מאפשרת הדמיה כמעט בזמן אמת עם מיקרוסקופ כוח קונפוקלי או אטומי.

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

תאית גבישית היא מרכיב חשוב בדופן התא של הצמח. עם זאת, הכימות שלו ברזולוציה סלולרית הוא מאתגר מבחינה טכנית.  כאן, אנו מדווחים על שימוש בטכנולוגיית אור מקוטב וחתכי שורש כדי לקבל מידע על הרכב דופן התא ברזולוציה מרחבית-זמנית.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

הפרוטוקולים המתוארים כאן מקלים על החקירה הנוחה של תגובות אתילן חיידקיות על ידי שימוש בחומצה 2-כלורואתילפוספונית (CEPA).  אתילן מיוצר באתרו באמצעות פירוק CEPA במצע גידול חיידקים מימי, תוך עקיפת הדרישה לגז אתילן טהור.

ניצול במגרש משחררים אתילן, 2-Chloroethylphosphonic חומצה, ככלי לחקר תגובה אתילן בחיידקים

כאן, אנו מציגים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מופעל ככלי ננו ומיקרו לכניסה על תאים ורקמות. המכשיר מאפשר רכישת סימולטני של טופוגרפיה של פני השטח 3D של המדגם ואת התכונות המכאניות שלה, כולל קיר התא מודולוס של יאנג, כמו גם לחץ טורגור.

שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים חיים של השלד המיקרו-טבובול הקליפתי ב"ירי" ומנטר את תגובתו לשינויים בכוחות הפיזיים.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

פרוטוקול הכניסה למיקרוסקופיה של הכוח האטומי מציע את האפשרות לנתח את תפקיד התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תא מסוים ברקמה או באיבר במהלך גדילה רגילה או מוגבלת (כלומר, תחת גירעון מים).

מיקרוסקופיית כוח אטומי לחקר התכונות הפיזיקליות של תאי אפידרמיס של שורשי ערבידופסיס חיים

מחקרים על ביומכניקה של דופן התא חיוניים להבנת גדילת צמחים ומורפוגנזה. הפרוטוקול הבא מוצע לחקור דפנות תאים ראשוניות דקות ברקמות הפנימיות של איברים צמחיים צעירים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי.

אפיון תכונות מכניות של דופן התא הראשוני באיברים חיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

דוח זה מתאר את השיטות הבסיסיות המשמשות לתרבית ולמניפולציה ניסויית של אצת הסטרפטופיטים החד-תאית, Penium margaritaceum. הוא גם מספק פרוטוקולים בסיסיים של הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה, כולל תיוג תאים חיים עם נוגדנים חד-שבטיים ובדיקות פלואורסצנטיות אחרות ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

פרוטוקולי סינון ניסיוניים, אימונוציטוכימיה וטכניקות הדמיה מבוססות מיקרוסקופיה עבור Penium margaritaceum

למד שיטות למדידת התארכות דופן התא הצמחי (Creep) באמצעות אקסטנסומטר בכוח קבוע. חקור את השפעת חומציות וחלבוני אקספנסין על נמתנות הדופן במחקר ביולוגי.

מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin

גלה סרטונים נוספים