Name: תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: למדו כיצד ליצור mammospheres מתאי אפיתל חלב עכבר HC11 כדי לחקור התמיינות לקטוגנית. פרוטוקול זה מספק מודל אמין ללימוד אפקטים של הורמונים ורגולציה של תאי חלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

קרנות מ בימוי congressionally למחקר רפואי הקרן מענק (DAMD17-01-0264) ל ML קטלר ארצות הברית הצבאית מכון הסרטן כדי ML ​​קטלר נתמך העבודה.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HC11 התאים גדלו על מפגש עבור 6 ימים בינוני 1640 RPMI בתוספת סרום 10% עגל עוברית, אינסולין 5μg/ml, HEPES 10 מ&quot;מ, צמיחה 10ng/ml גורם אפידרמיס (EGF) להקים יכולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים נשטפו עם PBS ומתוחזק בתקשורת צמיחה ללא EGF למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשרות התמיינות lactogenic התאים הודגרו בתקשורת בידול, כלומר RPMI עם dexamethasone (10 -6 M), אינסולין (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ופרולקטין (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) המכונה מח&quot;ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף לכל פוסט מח&quot;ש פעמים כאמור, mammospheres צולמו המנויים על ידי מיקרוסקופית השלב בניגוד באמצעות מיקרוסקופ IX71 אולימפוס עם מצלמה דיגיטלית. </li></ol> נציג תוצאות: הגדלה חשמל נמוכה של החלב monolayers נורמלי לתא אפיתל mammospheres מרובים, כמו גם הגדלה של מתח גבוה mammosphere יחיד מוצגים באיור 1, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="" /> באיור 1. Mammospheres. (א) רגיל monolayers החלב תא אפיתל צריך להיות מוצג כשכבת שטוחה של תאים ומחוברות. (ב) לאחר 3-5 ימים של גירוי מח&quot;ש mammospheres מרובים תופיע. צולם 5 ימים הודעה מח&quot;ש בנוסף. (ג) הגדלה גבוהה של שדה יחיד המכיל mammospheres ב 5 ימים שלאחר בנוסף מח&quot;ש.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

על מנת הטכניקה הזו להיות מוצלחת באיכות הטובה ביותר, את לתאי האפיתל יש לשמור על מפגש קודם להיות מושרה עם הורמונים lactogenic. ייתכנו מצבים שבהם יש mammospheres רבים, מה שהופך את כימות קשה. לפיכך, למטרות כמותי עדיף לצלם את mammospheres בנקודת הזמן כאשר מספר mammospheres מסוגל לסמוך. אמנם יש סמנים מולקולריים שונים כדי לקבוע את מידת הבידול lactogenic לתאי האפיתל של השד, יש כמה סמנים מורפולוגיים המשמשים בתאי צמח בתרבו...

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי בקר</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

תאים אפיתל עכבר החלב טופס mammospheres במהלך התמיינות lactogenic

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

מדד פנוטיפי נפוץ כדי לקבוע את מידת הבידול lactogenic בתוך החלב עכבר תרבויות אפיתל התא הוא היווצרות של מבנים דמויי כיפה תא המכונה mammospheres<sup&gt; 1</sup&gt;. הקו HC11 תא הועסק כמערכת מודל לחקר ויסות התמיינות lactogenic החלב הן<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 2</sup&gt;. HC11 תאים להבדיל לסנתז חלבוני החלב התגובה לטיפול עם הורמונים lactogenic. בעקבות צמיחה של תאים HC11 עכבר החלב אפיתל כדי מפגש, בידול lactogenic היה המושרה על ידי תוספת של שילוב של הורמונים lactogenic כולל dexamethasone, אינסולין, פרולקטין, המכונה מח&quot;ש. HC11 התאים המושרה להבדיל צולמו בזמנים של עד 120 שעות אינדוקציה הודעה בידול ומספר mammospheres שהופיעו כל תרבות הייתה המנויים. גודלו של הפרט mammospheres בקורלציה עם מידת הבידול הזה מתואר התמונות של תאים מבדל.

HC11 בידול lactogenic יכול להיות מאופיין על ידי היווצרות של מבנים כיפה המכונה mammospheres. מבנים ניתן המנויים על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לסייע לכימות בידול lactogenic.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

מדד פנוטיפי הנפוץ לקביעת מידת הדיפרנציאציה הלקטוגנית בתרביות של תאי אפיתל של בלוטת העלה של עכבר הוא היווצרות של...

שלום, אני בט'ני מוריסון מהמעבדה של ד"ר מרי לו קטלר במחלקה הפתולוגיה באוניברסיטה של השירותים המאוחדים למדעי הבריאות (Uniform Services University of the Health Sciences). היום נדגים לכם הליך לפיתוח ממספירות (mammospheres) מתאי אפיתל של בלוטת העווית של עכבר מסוג HC 11. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור דיפרנציאציה של תאי העווית (lactodifferentiation).אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, תאי HC 11 גודלים עד להגעה למצב של התמזגות (confluence) במשך שישה ימים במצע RPMI 1640, המועשר ב-10% fetal calf serum, 5 µg/mL insulin, 10 µM Heiss, ו-10 ng/mL epidermal growth factor (EGF) כדי לבסס את היכולת (competence).תאים אלו שימשו באופן נרחב במעבדותיהם של ננסי היינס (Nancy Hines) וברנרד גרונר (Bernard Groner) לחקר הבקרה של דיפרנציאציה גנית תחת מנדף לתרבית רקמות. לאחר מכן, התאים נשטפים ב-PBS ונשמרים במצע גידול ללא EGF למשך 24 שעות. בעקבות אינקובציה זו, התאים מדגירים במצע דיפרנציאציה המורכב מ-RPMI בתוספת dexamethasone, insulin ו-prolactin במטרה להשרות דיפרנציאציה של תאי הלקטו לאחר האינקובציה.במדיה להבחנה, נעשה שימוש במיקרוסקופ Olympus IX 71 המצויד במצלמה דיגיטלית לצילום וספירה של ה-mamo spheres. באמצעות מיקרוסקופיה בניגוד מופע (phase contrast), ה-mamo spheres מצולמות ונספרות מספר פעמים לאורך 120 שעות לאחר ההשראה. תמונה זו מראה הגדלה נמוכה של זיכרון רגיל.יש לתחזק תאי ששכבה של תאי אפיתל במצב של התלכדות (confluence) למשך כשלושה ימים לפני הגירוי באמצעות הורמונים גנומיים. כאן מוצגות ממספירות (mammospheres) חדשות שנוצרו שלושה ימים לאחר ההשראה בהגדלה נמוכה. הן מתחילות להופיע כמבנים דמויי כיפה קטנים המפוזרים באופן אקראי בין התאים האפיתליים.שוב בהגדלה נמוכה. כאן ניתן לראות מספר ספרוממות (mammo spheres) שהתפתחו חמישה ימים לאחר ההשראה. הספרוממות המשיכו לגדול הן בגודלן והן במספרן; כאן, בהגדלה גבוהה, ניתן לראות בבירור את המאפיין הדמוי בועה או כיפה של הספרוממות.הראינו לכם כעת כיצד להשרות תאי אפיתל של בלוטת העלה, כך שיהפכו לממוספירות (mammospheres), המשמשות כסמנים להבחנה גנוג'נית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על התאים במצב של התלכדות (confluence) לפני ההשראה, מכיוון שבמהלך זמן זה התאים מייצרים חלבוני מטריקס שהם צריכים לבוא איתם במגע כדי להיות בעלי ביטחון מלא להגיב להורמונים גנוג'ניים. כמו כן, חשוב לזכור להסיר את ה-EGF מהמצע לפני הטיפול, מכיוון שה-EGF יעכב את תהליך ההבחנה.זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

mouse-mammary-epithelial-cells-form-mammospheres-during-lactogenic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה זו מתארת ​​כיצד לנתח ולהעריך התפתחות תפקוד בלוטת החלב ומן העכברים. בלוטות החלב נכרת מוערכים לתואר הפיתוח באמצעות הר שלם תוך פליטה החלב מוערך באמצעות אוקסיטוצין מבוססי assay myoepithelial התכווצות התא.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

השיטה פשוטה מתוארת לניתוח השפעות fibroblasts רקמה על תאים אפיתל הכרוכים בכך. השילוב של שיטה זו, תלת מימדי התרבות רקמת יכול להקל על ניתוח של תאים לאחר במנותק מן 3D. הטכניקה היא החלה על תאים שונים של פוטנציאל ממאיר, המאפשר לימוד שיטתי של השפעות stroma הגידול הקשורים על תאים סרטניים.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

סרטון זה מתאר בידוד תאי גזע סרטניים משורות תאי סרטן השד. אנו מגדלים תאי גזע סרטניים אלה כדי ליצור ממוספרות ראשוניות להערכת התחדשות עצמית ולחישוב יעילות יצירת הכדורים, מה שמאפשר השוואה בין צפיפויות זריעה שונות.

יצירת ממוספרות ראשוניות: טכניקה לקביעת עוצמת התא

תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל&gt; 6 חודשים.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

בדיקות ממוספירה צפה יכולות לחקור את תת-הקבוצה של תאי סרטן שד דמויי גזע ששורדים בתנאי השעיה ומראים גידול משופר כאשר הם מושתלים בעכברים.  פרוטוקול זה מספק מדד נוח במבחנה של יכולת יצירת כדור, פרוקסי לגידול in vivo, תוך הקלה על ניתוח נוף השעתוק הקשור לגבעול.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיהור, quantitating, אפיון שלפוחית ​​תאיים (EVs) / exosomes מ שאינם חסיד / mesenchymal תאים אפיתל החלב ועל השימוש בהם כדי להעביר את בלוטת החלב יוצרי היכולת לתאי אפיתל החלב לומינל. EVS / exosomes נגזר גזע כמו תאי אפיתל החלב יכול להעביר תכונה זו התא לתאים לבלוע EVs / exosomes.

העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

אנו מתארים טכניקות לבידול אינדוקציה של שני קווי אפיתל השד, HC11 ו EpH4. בעוד ששניהם דורשים סרום עגל עוברי, אינסולין, ו פרולקטין לייצר חלבונים חלב, EpH4 תאים יכולים להבדיל באופן מלא לתוך ממוגרפיה בתרבות תלת ממדית. המודלים המשלימים הללו שימושיים למחקרים של הneoplasia בידול ומדידה.

הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

כאן אנו מתארים את ההטמעה והפרשנות של התוצאות של שיטת ההתחדשות הכמותית העצמית של ממוגרפיה.

קוונפיקציה של התחדשות עצמית בתרבויות מורנה במוספירה

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

פרוטוקול זה מתאר את השיטה להקמת מבחן היווצרות הממוספירה לחקר גזע סרטן שנגרם על ידי מעכב אפופטוזיס 5 (Api5) בתאי אפיתל שד שאינם גידוליים. ליזטים שנאספו מממוספירות דור ראשוני מנותחים לסמנים שונים של גבעול כדי להעריך את השראת תכונות דמויות תאי גזע.

בדיקת ממוספירה חושפת גבעול מושרה על ידי API 5 בקווי תאים אפיתליים של השד שאינם גידוליים

למדו כיצד ליצור mammospheres מתאי אפיתל חלב עכבר HC11 כדי לחקור התמיינות לקטוגנית. פרוטוקול זה מספק מודל אמין ללימוד אפקטים של הורמונים ורגולציה של תאי חלב.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

גלה סרטונים נוספים