Name: הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: למד כיצד להכין תאים בודדים מרקמת מוח עכבר באמצעות gentleMACS Dissociator. שיטה זו שומרת על חייות התאים ועל אפיטופים של אנטיגנים לזיהוי תאי עצב מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים ברדס זרימה למינרית. 1. חומרים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P) (רכיבים: פתרון 1,2, 3 ו 4, מאגר אחסון) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום ההפרדה מסננים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) המיאלין חרוזים להסרת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטא mercaptoethanol </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> gentleMACS Dissociator </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MACSmix Rotator Tube </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (w) </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקס "שנאגרו מלח פתרון ללא קטיונים divalent Ca 2 + או Mg 2 + (HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS, סטנדרטי, כלומר עם Ca 2 + ו - Mg 2 + (HBSS (w) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם epitope את האנטיגן עניין ביישומים הבאים, להשתמש או Papain מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (P) או טריפסין מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (T). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים מן הרקמה עצבית דיסוציאציה קיט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2: להוסיף בטא mercaptoethanol מ"מ 0.067 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 4: לפזר אבקת הצפת 0.7 מ"ל אחסון (מסופק בערכה), לערבב בעדינות (לא מערבולת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזימים מערבבים 1: פתרון 1.9 מ"ל פיפטה 2 ו 50 פתרון μl 1 (הן ערכה) לתוך צינור C ו דגירה של 10-15 דקות על 37 ° C. זה מספיק כדי לנתק 400 מ"ג של רקמת המוח. </li></ol></li></ol> 2. Dissociating הרקמה העצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את רקמת המוח בתוך שפופרת המכילה 1 מ"ל HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכבר המוח לתוך הצינור C המכיל 1950 μL של מיקס אנזימים שחומם מראש 1. (הערה: בפרוטוקול זה נכתב עבור 400 מ"ג ≤, אבל כרכים פתרון וניתן לשנותם כדי להכיל עד 1600 מ"ג של רקמת המוח לכל Tube C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_01". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם סיבוב (4 סל"ד באמצעות Rotator Tube MACSmix) במשך 15 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_02". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלב דיסוציאציה להכין 30 μl של אנזימים מערבבים 2 מ"ג לכל 400 ברקמת ידי ערבוב בעדינות 20 μl של פתרון 3 ו - 10 μl של פתרון 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מערבבים אנזימים 2 עד התחתית C באמצעות כובע, מחצה אטום ומערבבים בעדינות מבלי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_03". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה לאסוף את דגימת בחלק התחתון של הצינור. </li></ol> 3. סינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מסנן מספיק גדול כדי לאפשר מעבר לתאים של עניין. למשל, תאים פורקינג' הם גדולים מדי כדי לעבור דרך מסנן 30 מיקרומטר, אך Prominin-1 + תאים תהיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה μl suitable1000 כדי להסיר את התאים בצורה Tube C באמצעות כובע, מחצה אטום ולהחיל אותו מסנן ההפרדה מראש על צינור איסוף 15 מ"ל. (הערה: עבור גודל מדגם גדול יותר להשתמש צינור איסוף 50 מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את המסנן עם 10 מ"ל של HBSS (w). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים מסוננים על XG 300 דקות 10 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend supernatent בינוני או חיץ של בחירה עבור יישומים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר פסולת מיאלין, המיאלין הסרת להשתמש חרוזים. </li></ol> 4. תוצאות נציג: אנא ראו איורים 1-3 <img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="תאנה 1"> איור. 1 דיסוציאציה המוח עם Dissociator gentleMACS הביא תאים קיימא 97%, כפי שמראה ניתוח תזרים cytometric. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="תאנה 2"> איור. 2 תמונת מיקרוסקופ אור של היווצרות neurosphere לאחר מיון התא מגנטי באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads לאחר 7 ימים של טיפוח MACS ® NeuroMedium בתוספת MACS B27 מוסף PLUS. תאים שהוכנו מהמוח CD1 העכבר (P3), תוך שימוש ברקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P). <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="תאנה 3.5"> איור. 3 פסולת המיאלין של תא בודד המתלים פוגמת במידה ניכרת בידוד תא, סילוק פסולת המיאלין על ידי הסרת חרוזים המיאלין מגביר תא הפרדות יעילות. עבור הפרדות MACS באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads, P22 במוח העכבר היה ניתק באמצעות רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P). תאים ההשעיה תא בודד היו גם להשתמש ישירות עבור ההפרדה, או הוגשו המיאלין דלדול באמצעות חרוזים המיאלין הסרת. השוואת דגימות ללא הפרדה עם הסרת המיאלין, מוכיח כי הטוהר גבוהה יותר עבור דגימות עם הסרת המיאלין הקודם.

<ol><li>Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li>
<li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li>
<li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li>
<li>Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
</ol>

הכותבים הם עובדי Miltenyi BIOTEC GmbH, גרמניה.

Dissociator gentleMACS מאפשר הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מרקמות עצביים במערכת סגורה. רקמה עצבית ערכות דיסוציאציה מותאמים לשמר epitopes אנטיגן הדרושים יישומים נוספים כמו immunostainings והפרדה תא immunomagnetic 1-5. בפרוטוקול זה אנו מראים ניתוק האנזימטית עדין של המוח באמצעות העכבר Dissociator gentleMACS ואת הרקמה העצבית דיסוציאציה Kit (P), מניב בתאים קיימא 97%. 100 מ&quot;ג של רקמה עצבית התשואות בין 6 5x10 ו 1x10 7 תאים, בהתאם לגיל של רקמות המאכסן. ממוקד Prominin-1 + תאים בודדו באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads ונלקח לאחר מכן לתוך התרבות. הפרוטוקול מוצג להיות אפילו יותר יעילה עם שימוש נוסף של חרוזים המיאלין הסרת כשעובדים עם רקמה עצבית נגזר P7&gt; עכברים.

<table><tbody><tr><td>מבחנות C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; ערכה למתחילים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-093-235</td><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; מסובב מבחנות</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ערכה לפירוק רקמה עצבית (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-092-628</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מסנני טרום-הפרדה</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-092-333</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-092-335</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>חרוזי הסרת מיאלין</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-094-544</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>טיפים לפיפט בהגעה מוארכת 1000 מיקרוליטר (Reach Pipet Tips) </td><td>Molecular BioProducts</td><td>מספר הזמנה 2079</td><td>&lt;אני מאמין שחלה טעות בשליחת הטקסט, שכן מקור הטקסט שהוזן הוא תגית HTML חלקית (`a href=`) ואינו מכיל תוכן מדעי לתרגום. אנא שלח את הטקסט המלא שברצונך לתרגם.&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;על מנת לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים במנדף זרימה למינרית.

1. חומרים
ערכה לפירוק רקמה עצבית (P) (מרכיבים: תמיסות 1, 2, 3 ו-4, בופר אחסון)
מסננים לפני הפרדה (אופציונלי)
חרוזי הסרת מיאלין
מכשיר gentleMACS Dissociator
מבחנות C
מסובב מבחנות MACSmix
HBSS (ללא)
HBSS (עם)

הכין את התמיסות הבאות לפני תחילת הפרוטוקול:
תמיסת מלחים חוצצת של הנקס (Hanks’ Buffered Salt Solution) ללא קטיונים דו-ערכיים Ca2+ או Mg2+ (HBSS (w/o))
HBSS סטנדרטית, כלומר עם Ca2+ ו-Mg2+ (HBSS (w))

בהתאם לאפיטופ האנטיגן הרלוונטי ליישומים הבאים, השתמש בערכה לפירוק רקמה עצבית המבוססת על פאפאין (P) או בערכה לפירוק רקמה עצבית המבוססת על טריפסין (T).

הכן את התמיסות הבאות מתוך הערכה לפירוק רקמה עצבית:
תמיסה 2: הוסף בטא-מרקפטואתנול עד לריכוז של 0.067 mM.
תמיסה 4: המס את האבקה ב-0.7 מ"ל בופר אחסון (מסופק בערכה), ערבב בעדינות (אין להשתמש ב-vortex).

תערובת אנזימים 1: העבר בפיפטה 1.9 מ"ל תמיסה 2 ו-50 מיקרוליטר תמיסה 1 (שתיהן מהערכה) למבחנת C והדגס במשך 10–15 דקות ב-37 °C. כמות זו מספיקה לפירוק של 400 מ"ג רקמת מוח.

2. פירוק הרקמה העצבית
שקול רקמת מוח במבחנה המכילה 1 מ"ל HBSS (ללא).
העבר מוח של עכבר למבחנת C המכילה 1,950 מיקרוליטר של תערובת אנזימים 1 שחוממה מראש. (הערה: פרוטוקול זה נכתב עבור ≤ 400 מ"ג, אך ניתן להתאים את נפחי התמיסות עבור עד 1,600 מ"ג של רקמת מוח למבחנת C אחת).
הנח את מבחנת C על מכשיר ה-gentleMACS Dissociator והפעל את התוכנית "m_brain_01".
הדגס עם סיבוב (4 סל"ד באמצעות מסובב מבחנות MACSmix) למשך 15 דקות ב-37 °C.
הנח את מבחנת C על מכשיר ה-gentleMACS Dissociator והפעל את התוכנית "m_brain_02".
במהלך שלב הפירוק, הכן 30 מיקרוליטר של תערובת אנזימים 2 לכל 400 מ"ג רקמה על ידי ערבוב עדין של 20 מיקרוליטר תמיסה 3 ו-10 מיקרוליטר תמיסה 4.
הוסף את תערובת אנזימים 2 למבחנת C דרך הפקק האטום בספטום וערבב בעדינות ללא vortex.
הדגס את מבחנת C עם סיבוב למשך 10 דקות ב-37 °C באינקובטור.
הנח את מבחנת C על מכשיר ה-gentleMACS Dissociator והפעל את התוכנית "m_brain_03".
הדגס את מבחנת C עם סיבוב למשך 10 דקות ב-37 °C באינקובטור.
בצע צנטריפוגה קצרה כדי לרכז את הדגימה בתחתית המבחנה.

3. סינון
בחר מסנן גדול מספיק כדי לאפשר מעבר של התאים הרלוונטיים. לדוגמה, תאי פורקיניה גדולים מדי מכדי לעבור במסנן של 30 מיקרומטר, אך תאי +Prominin-1 יעברו.
השתמש בפיפטה מתאימה של 1,000 מיקרוליטר כדי להוציא את התאים ממבחנת C דרך הפקק האטום בספטום והעבר אותם למסנן לפני הפרדה המונח על מבחנת איסוף של 15 מ"ל. (הערה: עבור גדלי דגימות גדולים יותר, השתמש במבחנת איסוף של 50 מ"ל).
שטוף את המסנן עם 10 מ"ל HBSS (עם).
בצע צנטריפוגה לתאים המסוננים ב-300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
השביט מחדש את supernatant במדיום או בבופר לבחירתך עבור היישומים הבאים.
להסרת שאריות מיאלין, השתמש בחרוזי הסרת מיאלין (Myelin Removal Beads).

4. תוצאה מייצגת: ראה איורים 1-3
איור 1: פירוק המוח באמצעות ה-gentleMACS Dissociator הניב 97% תאים חיים, כפי שמוצג בניתוח ציטומטריה עם זרימה.
איור 2: תמונת מיקרוסקופ אור של היווצרות נוירוספירות לאחר מיון תאים מגנטי באמצעות Anti-Prominin-1 MicroBeads, לאחר 7 ימי תרבית ב-MACS® NeuroMedium בתוספת MACS Supplement B27 PLUS. התאים הוכנו ממוח של עכבר CD1 (P3) באמצעות הערכה לפירוק רקמה עצבית (P).
איור 3: שאריות מיאלין בסספנסיות של תאים בודדים פוגעות באופן ניכר בבידוד התאים, והסרת שאריות מיאלין באמצעות Myelin Removal Beads מעלה את יעילות הפרדת התאים. עבור הפרדות MACS באמצעות Anti-Prominin-1 MicroBeads, מוח של עכבר P22 פורק באמצעות הערכה לפירוק רקמה עצבית (P). תאים מהסספנסיות של התאים הבודדים שימשו ישירות להפרדה, או שהועברו לתהליך של דה-מיאלינציה באמצעות Myelin Removal Beads. השוואה בין ההפרדה מדגימות ללא הסרת מיאלין לדגימות עם הסרת מיאלין מדגימה כי רמת הטוהר גבוהה יותר בדגימות שעברו הסרת מיאלין מוקדמת.&gt;&lt;קישור ל-&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ערכה לפירוק רקמה עצבית (T)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-093-231</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>תמיסת פרופידיום יודאיד</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>מספר הזמנה 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

בתוך מערכת העצבים, מאות סוגי תאים עצביים ועל גליה תוארו. כל סוג תא מסוים במוח או בחוט השדרה יש רפרטואר של פני השטח מולקולות התא, או גורמים המולקולרית, שבאמצעותה ניתן זוהו ואופיינו. נכון לעכשיו, זיהוי תאים חזקים טכנולוגיות הפרדה דורשים תא בודד ההכנות להיות שנוצר ובמקביל הגבלת מוות של תאים והרס של חלבון משטח אופייני. Dissociator gentleMACS, כאשר בשילוב עם טריפסין או papain מבוססי ערכות דיסוציאציה, יכול ביעילות ובעדינות לנתק את רקמת המוח תוך שמירה epitopes אנטיגן והגבלת אובדן התא. הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מושגת באמצעות צינורות C, אופטימיזציה, תוכניות מראש gentleMACS. לאחר שנוצר, תא בודד השעיות יכולים להיות מטופלים עם conjugates חד שבטיים כמו אנטי Prominin microbeads-1, אשר לזהות אבות עצביים, או מטוהרים נוסף באמצעות חרוזים המיאלין הסרת.

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

בתוך מערכת העצבים תוארו מאות סוגים של תאי עצב ותאי גליה. לכל סוג תא ספציפי במוח או בחוט השדרה יש...

בתוך מערכת העצבים, תוארו מאות סוגים של תאי גלייה נוירונליים. לכל סוג תא ספציפי במוח או בחוט השדרה יש רפרטואר של מולקולות על פני השטח של התא או דטרמיננטים מולקולריים שבאמצעותם ניתן לזהות אותו ולאפיין אותו.כיום, טכנולוגיות חסונות לזיהוי והפרדה של תאים דורשות יצירה של תכשירי תאים בודדים, תוך הגבלה סימולטנית של מוות תאי והרס של חלבוני שטח אופייניים. ה-gentle max associator, כאשר הוא משמש בשילוב עם ערכות דיסוציאציה המבוססות על trypsin או pepane, יכול לפרק ביעילות ובעדינות רקמת מוח תוך שימור של אפיתופים אנטיגניים והגבלת אובדן תאים. לאחר יצירתם, ניתן לטפל בסספנסיוני תאים בודדים באמצעות צמידים מונוקלונליים כגון anti prominent one microbeads, המזהים תאי אב עצביים (neuro progenitors), או לטהרם עוד יותר באמצעות חרוזי הסרה של myelin.שלום, שמי סנדרה PeNAT. אני מנהלת פרויקטים של מוצרי מדעי העצבים ב-Mil Biotech כאן ב-baggage Gabert גרמניה. היום אראה לכם כיצד להכין תרחיף של תאים בודדים מרקמת מוח של עכבר באמצעות ה-genix dis associator.מכשיר ה-genix dis associator הוא מכשיר המסוגל לבצע דיסוציאציה של מגוון סוגי רקמות בסביבה סטרילית סגורה, ובכך הוא מבטל את הצורך בדיסוציאציה מכנית ידנית ומייגעת. נתחיל בתהליך. בהתאם לאפיטופ של האנטיגן הרלוונטי ליישומים הבאים, השתמשו בערכה לדיסוציאציה של רקמה עצבית המבוססת על פפאאין או בערכה לדיסוציאציה של רקמה עצבית המבוססת על טריפסין.עבור הניסוי של היום, אנו מעדיפים את ערכת הדיסוציאציה של רקמת עצב P, כיוון שברצוננו לבודד תאים חיוביים בולטים באמצעות microbeads של anti prominent one. Prominent one אינו רגיש ל-pepane ואינו רגיש ל-trypsin, ובמקרה כזה, ערכת הדיסוציאציה של רקמת עצב P היא הבחירה הטובה יותר. לפני תחילת הפרוטוקול, יש להכין את הרכיבים והתמיסות עבור ערכה זו.החזיקו זמינה מלאי של תמיסת מלחים מאוזנת של הנק (HBSS) ללא יוני סידן ויוני מגנזיום, HBSS עם יוני סידן ומגנזיום, ו-beta-mercaptoethanol. התחילו בהכנת תמיסה 2, תמיסה 4, ולאחר מכן תערובת אנזימים 1. ראשית, הוסיפו beta-mercaptoethanol לתמיסה 2 עד לריכוז סופי של 0.067 millimolar.התמיסה כעת יציבה למשך עד חודש אחד כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כעת, המיסו את האבקה הליופיליזית מהבקבוק המסומן כ-solution.Four. באמצעות 0.7 מיליליטר של storage buffer, ערבבו בעדינות ואל תשתמשו ב-vortex.כעת הכינו את תערובת האנזים אחת על ידי העברה בפיפטה של 1900 microliters של תמיסה שתיים ו-50 microliters של תמיסה אחת לתוך מבחנה C. כמות זו של תמיסה מספיקה כדי לפרק 400 milligrams של רקמה, לכן אם יפורקו כמויות גדולות יותר, הכינו תערובת אנזים אחת נוספת. ניתן לעבד במבחנה C כמות מקסימלית של 1600 milligrams של רקמת מוח.את תערובת האנזים אחת בצינור C מדגירים לאחר מכן בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 15 דקות. כדי להתחיל בדיסוציאציה, מעבירים בעזרת פיפט 1 mL של HBSS ללא יוני סידן ומגנזיום אל הצינור. מניחים את הצינור על מאזניים, מוסיפים את רקמת המוח ורושמים את מסתה.מוח עכבר זה, בשלב P4, שוקל כ-0.2 גרם. מוח של עכבר בוגר ישקול כ-0.4 גרם עבור כל דגימות הרקמה שמשקלן פחות מ-400 מיליגרם. נפחי התמיסות שנשתמש בהם היום הם הולמים.אם רקמתכם שוקלת יותר מ-400 milligrams, הגדילו את כל נפחי הריאגנטים בהתאם; ניתן לעבד עד 1600 milligram של רקמה בצינור C אחד. העבירו את מוח העכבר לתוך צינור ה-C המוכן המכיל 1, 950 microliters של אנזים שחומם מראש. ערבבו ואטמו את הפקק היטב.כעת הניחו את מבחנה C על ה-gen max associator כאשר הפקק פונה כלפי מטה, וודאו שהרקמה ממוקמת באזור הסטטור. בחרו בתוכנית MCO brain O one והפעילו אותה. זוהי הראשונה מבין שלוש התוכניות שתפעילו במהלך הדיסוציאציה כאשר התוכנית תסתיים.הוצא את מבחנה C והדגר את הדגימה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C תחת סיבוב רציף ואיטי. בשימוש ב-max mix tube rotator, מצב העבודה של המכשיר תואם ל-4 RPM. לאחר ההדגרה הראשונה, החזר את המבחנה למכשיר הדיסוציאציה במצב הפוך והפעל את תוכנית M brain O2. במהלך האיסוציאציה הבאה, הכן 30 µL של תערובת אנזימים שתיים עבור 400 mg רקמה, על ידי הוספה של 20 µL מתמיסה שלוש ו-10 µL מתמיסה ארבע.כאשר מחזור השילוב השני מסתיים, העבירו 30 µL של תערובת אנזים 2 אל נבובת C ישירות דרך הפתח האטום בספטום במרכז הפקק. כדי להבטיח סטריליות, הפכו את נבובת C בעדינות כדי לערבב ואל תשתמשו בערבוב במערבל (vortex). לאחר מכן, החזירו את נבובת C למערבל הנבובות Max Mix והדגירו את הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C בערבוב של 4 RPM.לאחר מכן, מחזירים את ה-CTU למכשיר ה-gentle max dis associator בפעם השלישית והאחרונה, ומפעילים את התוכנית M brain oh three. עם השלמת התוכנית השלישית, מניחים את ה-C tubes על הרוטטור ומדגירים למשך 10 דקות נוספות ב-37 °C. כעת, צנטריפוגו את הדגימה לזמן קצר כדי לרכז את התאים בתחתית המבחנה.כעת אנו מוכנים לסנן את התאים. בחרו מסנן תאים בהתאם לגודל סוג התאים המבוקש. אם התאים שברצונכם לאסוף הם בעלי קוטר הגדול מ-30 micrometers, כגון תאי kinji, גודל הנקבים חייב להיות גדול מספיק כדי לאפשר מעבר של גופי תאים בקוטר זה.עבור תאים חיוביים בולטים, מסנן של 30 micrometer יהיה יעיל. הוציאו את הרקמה המפוערת מתוך ה-C tube באמצעות טיפים של פיפט 1000 microliter המתאימים למעבר דרך פתיחת הספטום האטמה במכסה של ה-C tube. העבירו את תמיחת התאים למסנן הפרדה שהונח על גבי מבחנת איסוף של 15 milliliter.עבור גדלי דגימות גדולים יותר, עשוי להיות נדרש מבחנה בנפח 50 מיליליטר. הניחו לת сусפנסיון התאים לעבור דרך המסנן. לאחר מכן, שטפו את המסנן על ידי הוספה של 10 מיליליטר של תמיסת HBSS עם יוני סידן ומגנזיום.בעבודה עם כמויות רקמה הגדולות מ-400 milligrams, השתמשו בעד 30 milliliters של HBSS עם יוני סידן ומגנזיום לשטיפת המסנן. כעת, השקיעו את התאים בשפופרת האיסוף באמצעות סנטריפוגה ב-300 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאבו את כל הנוזל העליון (supernat) ושחלו את משקע התאים בבופר או במצע הבחירה שלכם. בשלב זה, ניתן לבחור להסיר שאריות מיאלין, שכן אלו עלולות לפגוע בבידוד התאים ובצביעה עם נוגדנים.להסרת שאריות מיאלין, אנו ממליצים להשתמש בחרוזי הסרת מיאלין. אחרת, התאים מוכנים ליישומים נוספים. תרשים נקודות (dot plot) זה, המבוסס על צביעה ב-propidium iodide, מעיד כי 97% מהתאים הנוכחים בסוספנזיית תאים בודדים מנקע של עכבר ביתי, בדומה לסוספנזיה שהוכן בסרטון זה, הם חיוניים.ניתן לטהר תאים אלו עוד יותר באמצעות חרוזי מיקרו מגנטיים נגד prominent כדי להפיק תאי אב עצביים, אשר כאשר הם גודלים במצע max neuro, בתוספת B 27 plus, יכולים ליצור נוירוספירות כפי שמוצג בגרפים אלו (dot plots). ניתן להבחין ביתרון של טיפול בתליות באמצעות חרוזים להסרת מיאלין. אחוז גבוה משמעותית של תאי אב עצביים המבטאים prominent one מתקבל על ידי הפרדה ב-max בעקבות סילוק מיאלין מתליה של תא בודד.הרגע הדגמתי בפניכם כיצד להכין תרחיף של תאים בודדים מרקמת מוח של עכבר באמצעות ה-genix dissociation וערכת ה-neural tissue dissociation. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין את כל התמיסות כראוי בהתאם לבחירה הנכונה של ערכת ה-neural tissue dissociation, סוג T או P. אנא עיינו בהערת היישום (application note) או בגיליון הנתונים של ה-NDK. באמצעות שיטה זו, ניתן לעבד נתחים של רקמה עוברית או רקמת D, וכן מוח שלם, בתנאים סטריליים ובאופן סטנדרטי החוסך בזמן.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

generation-of-single-cell-suspensions-from-mouse-neural-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מתאר את שיטת לבידוד של neuroprecursors מהקורטקס המתפתח של עכברים עובריים. ההליך להסרת עוברים מן הרחם, לנתח את רקמת קליפת המוח, ולעכל את קליפת המוח מבודד מוצג.

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינותם לתאים עצביים. תאי גזע מתרחיף התא המבודד מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים ומתורבתים ליצירת נוירוספרות. לאחר מכן הנוירוספרות נשמרות במדיום התמיינות כדי ליצור תאים עצביים.

בידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינות לתאים עצביים

סרטון זה מדגים פרוטוקול להשגת תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר מההיפוקמפוס במוח העכבר באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ותערובת של אנזימים כדי לסייע בעיכול אנזימטי.

השגת תרחיף חד-תאי מרקמת ההיפוקמפוס של העכבר

הסרטון מדגים הכנה של תרחיף חד-תאי של תאי חיסון מרקמת מוח מורינה. זה כרוך בעיכול אנזימטי כדי לשחרר תאים מרקמת המוח, ואחריו צנטריפוגה הדרגתית צפיפות כדי לבודד את תאי החיסון על בסיס הצפיפות שלהם כדי לקבל את ההשעיה של תא יחיד.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי מערכת החיסון מרקמת המוח המורין

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

הקמת מערכות תרבית להרחבת תאי גזע עצביים בוגרים (aNSCs) מאפשרת בדיקה ויישום של תאי גזע עצביים בוגרים לטיפול. האזור התת-קלוסלי (SCZ) הוכר לאחרונה כאזור חדש ליצירת נוירובלסטים בעכברים בוגרים. כאן מתוארות שיטות לבידוד, הרחבה ובידול של SCZ-aNSCs.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

למד כיצד להכין תאים בודדים מרקמת מוח עכבר באמצעות gentleMACS Dissociator. שיטה זו שומרת על חייות התאים ועל אפיטופים של אנטיגנים לזיהוי תאי עצב מדויק.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

גלה סרטונים נוספים