הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

בתוך מערכת העצבים. מאות סוגי תאי גליה עצביים תוארו. לכל סוג תא ספציפי במוח או בחוט השדרה יש רפרטואר של מולקולות פני התא או גורמים מולקולריים שבאמצעותם ניתן לזהות ולאפיין אותו.

נכון לעכשיו, טכנולוגיות זיהוי והפרדה חזקות של תאים דורשות יצירת תכשירים של תא בודד תוך הגבלת מוות תאים והרס של חלבון פני השטח האופייני. אסוציאטור המקסימום העדין בשילוב עם ערכות דיסוציאציה מבוססות טריפסין או פפן יכול לנתק ביעילות ובעדינות את רקמת המוח תוך שימור אפיטופים של אנטיגן בהגבלת אובדן תאים. לאחר שנוצרו ניתן לטפל בתרחיפי תאים בודדים באמצעות מצומדים חד-שבטיים כמו מיקרו-חרוזים אנטי בולטים, המזהים אבות נוירולוגיים או מטהרים עוד יותר באמצעות חרוזים להסרת מיאלין.

היי, שמי סנדרה פנאט. אני מנהל פרויקטים למוצרי מדעי המוח ב-Mil Biotech כאן במזוודות Gabert גרמניה. היום אראה לך כיצד להכין תרחיף תא בודד מרקמת מוח של עכבר באמצעות genix dis associator.

ה-genix dis associator הוא מכשיר שיכול להפריד מגוון סוגי רקמות בסביבה סטרילית סגורה, וכך הוא מבטל את הצורך בדיסוציאציה מכנית ידנית מייגעת. אז בואו נתחיל. בהתאם לאפיטופ האנטיגן המעניין ביישומים הבאים, השתמש בערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות מבוססת פפאין או בערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות מבוססת טריפסין.

עבור הניסוי של היום, אנו מעדיפים את ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות P מכיוון שהיינו רוצים לבודד תאים חיוביים בולטים באמצעות מיקרו-חרוזים אנטי בולטים. בולט אינו רגיש לפפאן או לטריפסין, ובמקרה כזה, ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות P היא הבחירה הטובה יותר. לפני תחילת הפרוטוקול, יש להכין את הריאגנטים והתמיסות לערכה זו.

יש לך מלאי משלך של תמיסת מלח איזון של האנק HBSS ללא יוני סידן ויוני מגנזיום HBSS עם יוני סידן ומגנזיום וקרן לי capto. אתנול התחל בהכנת תמיסה שנייה תמיסה ארבע ולאחר מכן תערובת אנזים אחת. ראשית, הוסף אתנול קפטו בטה מי לתמיסה שתיים לריכוז סופי של 0.067 מילימולר.

התמיסה יציבה כעת עד חודש כאשר היא מאוחסנת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ממיסים את האבקה הליופילית ותמיסה עם תווית בקבוקון. ארבע. בעזרת 0.7 מיליליטר של מאגר אחסון מערבבים בעדינות ולא מערבולים.

כעת הכינו תערובת אנזימים אחת על ידי פיפטינג של 1900 מיקרוליטר תמיסה שתיים ו -50 מיקרוליטר תמיסה אחת לתוך צינור C. זה פתרון מספיק כדי להפריד 400 מיליגרם של רקמה, כך שאם יתנתק יותר, הכינו תערובת אנזימים נוספת. ניתן לעבד מקסימום 1600 מיליגרם של רקמת מוח בשפופרת C.

תערובת האנזים אחת בצינור C מודגרת לאחר מכן ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. כדי להתחיל את פיפטת הדיסוציאציה יש להכניס מיליליטר אחד של HBSS ללא יוני סידן ומגנזיום לתוך הצינור. הגדר את הצינור על איזון, הוסף את רקמת המוח ורשום את המסה שלו.

מוח עכבר P 4 זה שוקל כ-0.2 גרם. מוח בוגר ישקול כ-0.4 גרם עבור כל דגימות הרקמה פחות מ-400 מיליגרם. נפחי הפתרונות שבהם נשתמש היום מספיקים.

אם הרקמה שלך שוקלת יותר מ-400 מיליגרם מאשר להגדיל את כל נפחי הריאגנטים בהתאם, ניתן לעבד עד 1600 מיליגרם רקמה בצינור C אחד. העבירו את מוח העכבר לתוך צינור C מוכן המכיל 1,950 מיקרוליטר של אנזים מחומם מראש. יש לערבב אחד ולאטום היטב את הפקק.

כעת הנח את צינור ה-C על אסוציאטור ה-gen max עם המכסה כלפי מטה וודא שהרקמה ממוקמת באזור הסטטור. בחר את התוכנית MCO brain O one והפעל את התוכנית. זוהי הראשונה מבין שלוש תוכניות שתפעיל על הדיסוציאציה כאשר התוכנית תסתיים.

הסר את צינור C ודגר את הדגימה למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בסיבוב רציף איטי. באמצעות מסובב צינור התערובת המקסימלי, מצב הריצה של המכשיר מתאים לארבעה סל"ד. לאחר הדגירה הראשונה, החזירו את הצינור לדיסוציאציה הפוכה והריצו את תוכנית M brain O2. במהלך האסוציאציה הבאה, הכינו 30 מיקרוליטר של תערובת אנזימים שניים לכל 400 מיליגרם רקמה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר תמיסה, שלושה עד 10 מיקרוליטר תמיסה ארבע.

כאשר מחזור האסוציאטור השני הגיע לסיומו ב-30 מיקרוליטר של אנזים, מערבבים שניים לתוך צינור C ישירות דרך הפתח האטום של המחיצה במרכז המכסה. כדי להבטיח סטריליות, הפוך את צינור C בעדינות כדי לערבב ולא לערבב. לאחר מכן החזר את צינור ה-C למסובב צינור התערובת המקסימלי ודגר את הדגימה למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם ערבוב של ארבעה סל"ד.

לאחר מכן ה-CTU מוחזר לאסוציאטור המקסימלי העדין בפעם השלישית והאחרונה, והתוכנית M brain oh three מופעלת. בסיום התוכנית השלישית, הניחו את צינורות C על המסובב ודגרו למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כעת צנטריפוגה את הדגימה לזמן קצר כדי לאסוף את התאים בתחתית הצינור.

כעת אנו מוכנים לסנן את התאים. בחר מסננת תאים בהתאם לגודל סוג התא שלך. אם התאים שאתם רוצים לאסוף הם בקוטר של יותר מ-30 מיקרומטר כמו תאי קינג'י, גודל הנקבוביות חייב להיות גדול מספיק כדי להעביר גופי תאים בקוטר הזה.

עבור תאים חיוביים בולטים, מסנן 30 מיקרומטר יעבוד. הסר את הרקמה המנותקת מצינור C באמצעות קצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר הנכנסים דרך הפתח האטום במחיצה במכסה צינור C. החל את מתלה התאים על מסנן ההפרדה המקדים המונח על צינור איסוף של 15 מיליליטר.

עבור גדלי מדגם גדולים יותר של 50 מיליליטר ייתכן שיידרש צינור. אפשר למתלה התא לעבור דרך המסנן. לאחר מכן שטפו את המסנן על ידי הוספת 10 מיליליטר תמיסת HBSS עם יוני סידן ומגנזיום.

בעבודה עם כמויות רקמות הגדולות מ -400 מיליגרם, השתמש עד 30 מיליליטר HBSS עם יוני סידן ומגנזיום לשטיפת המסנן. כעת גלולה את התאים בצינור האיסוף על ידי צנטריפוגה ב-300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאפו את הסופרנט לחלוטין והשעו מחדש את כדור התא במאגר או במדיום לבחירתכם. בשלב זה, אתה יכול לבחור להסיר כל פסולת מיאלין מכיוון שהיא עלולה לפגוע בבידוד התאים ובצביעת נוגדנים.

כדי להסיר פסולת מיאלין, אנו מציעים להשתמש בחרוזים להסרת מיאלין. אחרת, התאים מוכנים ליישום נוסף. תרשים נקודות זה המבוסס על צביעת פרופידיום יודיד מצביע על כך ש-97% מהתאים הקיימים בתרחיף תא בודד מנקע עכבר ביתי כמו התרחיף שנוצר בסרטון זה הם ברי קיימא.

ניתן לטהר תאים אלה עוד יותר באמצעות מיקרו-חרוזים אנטי-בולטים כדי להניב אבות עצביים, שכאשר הם מתורבתים במדיום נוירולוגי מקסימלי, בתוספת B 27 פלוס יכולים ליצור נוירוספרות בעלילות הנקודות הללו. נצפה היתרון בטיפול בתרחיפים עם חרוזי הסרת המיאלין. אחוז גבוה משמעותית של אבות עצביים בולטים מתקבל על ידי הפרדה מקסימלית לאחר דלדול המיאלין מתרחיף תא בודד.

זה עתה הראיתי לך כיצד להכין תרחיף תא בודד מרקמת מוח של עכבר באמצעות דיסוציאציה של genix וערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין את כל הפתרונות כראוי לבחירה הנכונה של ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות, T או P. אנא עיין בהערת היישום או בגיליון הנתונים של NDK. בשיטה זו, ניתן לעבד את חלקי הרקמה העוברית כמו גם את המוח כולו בתנאים סטריליים באופן חוסך זמן וסטנדרטי.

תודה על הצפייה ובהצלחה על הניסויים שלך.