הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

כלמידומונס היא אצה ירוקה חד-תאית המתחלקת בצורה א-מינית בתנאי גידול אידיאליים. כאשר התנאים מתדרדרים, האורגניזם נכנס למחזור רבייה מינית. ניתן לגרום לגמטוגנזה על ידי העברת זנים ממקדחת TAP לחסר חנקן, ו-10 תאי מקדחה מושעים מחדש ומעוררים תחת אור חזק כדי ליצור MT פלוס ו-MT מינוס gat מודאליים, אשר משולבים לאחר מכן בבקבוק יחיד להזדווגות דגימות נצפו על צלחת מקדחה TAP ואור, ואז עטופים בנייר כסף להבשלה של זיגס ארבע.

לאחר חמישה עד שבעה ימים, תאים צמחיים מגרדים וחושפים את הזיגוטות, הדבוקות היטב למקדחה. אלה מועברים ללוחות TAP DCO לצורך נביטה. בתאורה חלשה מופרדים טטרדות ומגדלים אותן בתנאים מתאימים.

עד שיופיעו שיבוטים גלויים, ניתן לבחור אותם לניתוח עוקב. היי, אני דיוויד שטרן, נשיא מכון בוי תומפסון לחקר הצמחים. היום אנו הולכים להראות לכם נהלים להזדווגות ודיסקציה של טטרה עבור דגם צדפות האצות הירוקות MOUs REINE Hearty Eye.

מעבדות רבות משתמשות בטכניקות אלה כדי ליצור דיפלואידים וגטטיביים לניתוח דומיננטיות או לאחר נתיחת דריכה כדי לוודא תורשה גרעינית לעומת אברונים. לבחון alm, לנתח אפיסטזיס, או ליצור אוכלוסיות לצורך שיבוט מבוסס מפה. בנוסף, הצלבות גנטיות משמשות באופן שגרתי לשילוב גנוטיפים של אברונים עם גנוטיפים גרעיניים מסוימים.

ברצוני להציג בפניכם את עמיתי לפוסט-דוקטורט ס. ג'אן, שידריך אתכם בפרטי ההליכים. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל את הניסוי, העבירו את זני MT פלוס ו-MT מינוס ללוחות טריס אצטט פוספט או TAP גדלו את התאים ברצועה מרוכזת ברוחב סנטימטר אחד.

ייתכן שיהיה צורך בהעברת ביניים עבור גבעולים מבוגרים יותר. ברגע שמופיעה שכבה עבה של תאים גדלים, העבירו את התאים כלוח עבה ללוחות N 10. צלחות אלה חסרות חנקן.

כדי לגרום לגמטוגנזה לדגור על התאים למשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים, בדקו שהתאים עדיין נראים ירוקים כהים, השליכו את כל הזנים המזוהמים. מכיוון שהם לא ייצרו זיגוטות בנות קיימא, הזנים הנותרים מוכנים כעת לעבור גמטוגנזה.

כעת, לאחר שהגמטוגנזה הושרה, התחל את ההזדווגות על ידי הכנת שתי צלוחיות של 50 מיליליטר. כל אחד מהם מכיל 2.5 מיליליטר מים מזוקקים סטריליים. בעזרת לולאת תיל, העבירו כל זן לבקבוק נפרד והחזירו אותו למים.

וודאו שאין גושים. מדוד את ריכוז התאים בעין. הוסף מים כדי להשיג ריכוזי תאים שווים.

לאחר מכן, מערבבים את התאים במשך שעתיים באור חזק כך שייווצרו גמטות מודאליות. בדוק את התנועתיות תחת מיקרוסקופ אור. זכור שאפילו זנים מודאליים גרועים יזדווגו.

בבקבוק נוסף של 50 מיליליטר. שלב כמויות שוות של זנים ריקים פלוס ומינוס ריקים כדי לאפשר הזדווגות. השאירו את הגאטים תחת אור חזק, אך אל תתסיסו מיד בדקו את ההזדווגות מתחת למיקרוסקופ האור.

חפש זוגות סולם צבעים הנעים במהירות. הצטרפו לדגלים, נזהרים לא לעורר את התערובת ולהפריע לזוגות ההזדווגות. קח דגימה של 300 מיקרוליטר כל שעה במשך ארבע השעות הבאות ומצא על צלחת מקדחה TAP.

השאירו את תערובת ההזדווגות שאינה בשימוש בבקבוק עד למחרת. הניחו לצלחות המקדחה של TAP להתייבש במכסה מנוע סטרילי עם המכסים Aja עד שלא יישאר נוזל על פני השטח. ואז השאירו את הצלחות באור למשך 18 שעות.

עטפו את הצלחות בנייר כסף מכיוון שהבשלת נבגי CIGA מתרחשת רק בחושך ואחסנו את הצלחות למשך שבוע. לבסוף מערבבים את הבקבוק המכיל את תערובת ההזדווגות שנותרה. אם המדיום נראה ברור, אז זיגוטות נשארו מחוברות לפני השטח של הבקבוק, מה שמעיד על הזדווגות יעילה.

אם התסיסה נעלמת, הזדווגות הזיגוטות לא הייתה יעילה או שהיא נכשלה במהלך השבוע שלאחר מכן, נבגי הזאגו ייווצרו על הצלחות והטטרות יהיו מוכנות לדיסקציה. לאחר חמישה ימים, הזיגוטות המזדווגות ייצרו נבגי זאגו. אז דיסקציה של טטרה יכולה להתחיל באמצעות אזמל עמום.

מגרדים את התאים הצמחיים, חושפים את הזיגוטות שנדבקות בחוזקה למקדחה. הסתכל מתחת למיקרוסקופ כדי להבחין בין זיגוטות לתאים צמחיים. זיגוטות גדולות יותר, בדרך כלל צהובות, ויש להן קווי מתאר שחורים.

לאחר מכן, הכינו מחטי זכוכית למניפולציה של התאים. משוך מוטות זכוכית של שלושה מילימטר להבת אלכוהול כדי ליצור חוט דק ארוך. נתק את החוט הארוך.

מחממים בקצרה את השקע המחודד של חוט הזכוכית כדי לכופף אותו לוו. כעת השתמש במחט הזכוכית כדי לאסוף את הזיגוטות לערימה קטנה על צלחת המקדחה TAP. צרו ריבוע מקדחה המכיל את הזיגוטות והוציאו אותו באמצעות אזמל לפני העברת הזיגוטות.

לניתוח הטטראדים, סמן את החלק התחתון של צלחת מקדחה של 1.5% TAP. צייר קו אופקי 1.5 סנטימטרים מהחלק העליון של הצלחת. בנוסף, צייר רשת עם מרווח אנכי של כ-1.5 סנטימטרים ו-0.5 סנטימטרים.

לאחר מכן הנח את גוש המקדחה עם הפנים כלפי מטה על הקו האופקי העליון המצויר על לוחית המקדחה 1.5% TAP. החלק את גוש המקדחה לאורך הקו האופקי העליון כדי להפיץ את הזיגוטות. לבסוף, הזיזו זיגוטות בודדות לצמתים של הקווים האופקיים העליונים, כאשר כל קו אנכי מסתיים בכ-20 עד 30 זיגוטות לכל צלחת.

מיד לאחר חלוקת הזיגוטות הופכים את הצלחות למשך 30 שניות על צלחת זכוכית המכילה שכבה דקה של כלורופורם. וודאו שהמרחק בין הצלחת לכלורופורם הוא חמישה סנטימטרים. ואל תשתמש ביותר מדי כלורופורם.

טיפול זה יהרוג את כל התאים הצמחיים שהועברו בטעות. הנח את הצלחות בתאורה חלשה למשך 16 שעות כדי לאפשר לנביטה. השלב הבא יהיה דיסקציה טטראדית.

כעת, לאחר שהתאים סיימו לדגור, חפשו זיגוטות מונבטות. אלה תאים נפוחים שלפעמים התפוצצו עם תאי בת בתוכם. אם התרחשה נביטה אך נבג הזאגו לא נקרע, גע בו בעדינות עם מחט זכוכית כדי לשבור את הקיר.

עכשיו התחילו להפריד את הטטראדים. לחץ על המקדחה ליד תאי הבת בעזרת מחט הזכוכית. תאי הבת נלכדים בנוזל המשוחרר.

גרור את תאי הבת בשלולית שמאחורי המחט לנקודות הרשת מתחת לזיגוטה. כעת, לאחר שהטטרה מופרדת, חפשו שאריות קונכייה שנותרה. לאחר הסרת תאי הבת כדי לוודא שזיגוטה נותחה ולא תא וגטטיבי שהתחלק פעמיים, גדל את הצאצאים המנותחים עד שניתן יהיה לבחור מושבות גלויות לניתוח לאחר מכן.

עקוב אחר הצלחות מדי יום לאיתור זיהום. כאשר הפרוטוקול מבוצע כהלכה, ארבעת הצאצאים המנותחים מכל זיגוטה גדלים לשיבוטים גלויים. שניים מהצאצאים ריקים פלוס ושניים ריקים, מינוס כל הצאצאים יורשים את הכלורופלסט, ה-DNA של ההורה MT פלוס.

זה עתה הראינו לכם שיטות סטנדרטיות להזדווגות גמטוגנזה, נביטת zy ודיסקציה של דריכה עבור צדפות dms. כאשר משתמשים בטכניקות אלה, חשוב לוודא שהתאים בריאים וללא כל זיהום. ידוע היטב שזנים מותאמים למעבדה, שלא נחצו במשך תקופות ארוכות, עשויים שלא להזדווג היטב ואיכות המים עשויה להשפיע גם על מוטגנזה.

על ידי תשומת לב לפרטים אלה ולפרטים טכניים אחרים שהוזכרו לעיל, אתה אמור להצליח מאוד עם הגנטיקה של שד הטיפוס שלך. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.