אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים
27 ביולי 2009
בקנה מידה גדול immunodetection של חלבונים יעד ברחבי המוח הפרימטים כולו ניתן על ידי העסקת רקמה רומן הטבעה וכן חתך שיטות בשילוב עם השימוש במנגנון יצירתיים מכתים אצווה של ריחוף ללא מקטעים מרובים בכל זמן נתון.
הליך זה מתחיל עם קבלת מוח 4% PFA מוחדר, מוחצן ומוגן קריו, שנשלח לעמיתים למדעי המוח להטמעה באמצעות ציוני דרך יישור המוטמעים במטריצה שמסביב. ניתן לחתוך את המוח במישור העטרה כדי לייצר חתכים סדרתיים בעובי הרצוי, שייצגו את כל החלק האחורי הקדמי של המוח באמצעות סלים ומכלים מיוחדים. ניתן לבצע עיבוד חיסוני אצווה על מנת לקבוע את דפוס הביטוי המרחבי של חלבון בכל המוח.
היי, אני ד"ר שאהין צור מהמעבדה למדעי המוח החזותיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול. היי, אני ד"ר מארק בורק, גם הוא מהמעבדה למדעי המוח החזותיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול. שלום, אני Dr.Mo פטו, מנהל המעבדה למדעי המוח החזותיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול.
היום נראה לכם נוהל לצביעה חיסונית אצווה לזיהוי חלבון בקנה מידה גדול במוח שלם של קוף. אנו משתמשים בהליך הזה במעבדה שלנו כדי לחקור את דפוסי הביטוי של חלבוני מטרה בכל המוח, ולהשוות את הביטוי של החלבונים האלה בתוך אותו מוח. אז בואו נתחיל.
לפני העיבוד ההיסטולוגי, השג מוח פרימטים, שנשמר באמצעות זלוף מערכתי ולאחר קיבוע ומוגן קריו באמצעות תמיסות סוכרוז מדורגות. בשלב זה, המוח נשלח לעמיתים למדעי המוח כדי להטמיע אותו ולחלק אותו בחינם באמצעות הטכנולוגיה הקניינית שלהם. עם החזרה, ניתן להבחין כי שבעה ציוני דרך של יישור ממוקמים במטריצת ההטבעה כך שניתן יהיה לכוון את החלקים כראוי וליישר אותם מחדש לאחר השלמת העיבוד ההיסטולוגי.
בזמן ביצוע החיתוך, נלקחות תמונות דיגיטליות שניתן להשתמש בהן מאוחר יותר לשחזור תלת מימד של מפות אנטומיות. מדעני מוח עמיתים מעבדים את הרקמה שלנו כדי לייצר מקטעים עטרתיים צפים חופשיים בעובי 50 מיקרומטר על פני המוח כולו. לאחר השלמתו, נוכל להתחיל בעיבוד היסטולוגי של הסעיפים.
כאשר אנו מתחילים בעיבוד היסטולוגי, יש לנו בדרך כלל כ-140 חלקים לטפל בכל נוגדן או כתם. כאן נדגים את הטכניקה עם מדגם קטן יותר של חתכים שטופלו בנוגדנים SMI 32, שהוא נוגדן חד שבטי כנגד חלבוני נוירופילמנט שאינם זרחניים. לאורך ההליך משתמשים בכלים וסלים מיוחדים לצביעה, המאפשרים עיבוד מספר רב של חלקים צפים חופשיים בו זמנית וביעילות.
הדבר מבטיח שהכתם שנוצר יהיה עקבי בכל המקטעים. השלב הראשון הוא לדגור את החלקים בתמיסה מבוססת PBS המכילה TRITTON X 100 וסרום סוס רגיל למשך 60 דקות. זה יפחית את הקישור הלא ספציפי של מולקולות נוגדנים שגורם לצביעה ברקע.
לאחר מכן, החלקים מודגרים למשך הלילה. בתמיסת נוגדנים SMI 32 מבוססת PBS, בתוספת טריטון X 100 וסרום סוס רגיל למחרת, החלקים נשטפים במשך שלוש תקופות של 10 דקות בתמיסת כביסה ולאחר מכן מודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בתמיסת נוגדנים משנית של Muse מבוססת PBS המכילה Triton X 100 וסרום סוסים רגיל.
לאחר סט של שלוש שטיפות נוספות של 10 דקות, החלקים מונחים בתמיסה של קומפלקס פרוקסידאז צנון מצומד ביוטין אוואדון למשך שעה בטמפרטורת החדר. לבסוף, לאחר סט נוסף של כביסות, החלקים ממוקמים בתגובת אמינו בנזין D למשך 10 דקות, מה שמייצר כתם חום בתוך הנוירונים החיסוניים. לאחר מכן התגובה נעצרת על ידי הסרת סל הצביעה וטבילת החלקים ב-PBS.
לאחר שתיים עד שלוש, שטיפות של חמש דקות בקטעי PBS מוכנות להרכבה בנפרד על שקופיות זכוכית כדי להתחיל בתהליך ההרכבה באמצעות צלחת פטרי גדולה ומברשות צבע רכות מאוד. חלקים מורמים ממיכל החיץ PBS ומורכבים בנפרד על שקופיות זכוכית מצופות ג'לטין. לאחר מכן נותנים לדגימות להתייבש באוויר למשך הלילה במכסה אדים למחרת.
החלקים נשטפים על ידי טבילתם במים נטולי יונים כדי לשטוף את כל גבישי המלח שעלולים להישאר מתהליך ההרכבה. לאחר מכן השקופיות מיובשות במדרגות אתנול מדורגות מנקות בקסילן והכיסוי מחליק עם מדיום הרכבה לכל תושבת. בשלב זה יש לאחסן שקופיות כשבוע עד 10 ימים במצב אופקי כדי לאפשר למדיום ההרכבה להתקשות.
לאחר מכן, ניתן לאחסן את השקופיות בקופסת שקופיות או לעבור הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה. שיטה זו מייצרת פרופיל ביטוי מלא של חלבון מטרה מעניין על פני מוח שלם של קוף. כאן אנו מציגים קטעי עטרה מייצגים המספקים תמונת מצב של FMRP, ביטוי חדש של n ו-SMI 32.
באותו מוח של קוף. זה עתה הראינו לכם כיצד להשלים צביעה חיסונית אצווה עבור חלבון מטרה מעניין בכל המוח. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שכל החלקים עוברים תסיסה קלה בזמן הדגירה בתמיסות שונות, ושבכל עת הם נשארים שקועים לחלוטין.
בנוסף, קחו את הזמן בזמן הרכבת זכוכית על הדיסקציות והסירו כמה שיותר מהקמטים והקפל מבלי לפגוע בשלמות הרקמה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בגישה חדשנית לגילוי חיסוני בקנה מידה גדול של חלבונים מטרה במוח הפרימטים. הוא מדגיש שיטות משובצות רקמות וחיתוך חדשניות, יחד עם טכניקות צביעה אצווה עבור מספר חלקים צפים חופשיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדעים
- גילוי חיסוני
- הדמיית מוח
רקע
- גילוי חיסוני הוא קריטי לחקר ביטוי חלבונים במוח.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות מוגבלות בהיקף וביעילות.
- התקדמות בטכניקות עיבוד רקמות יכולה לשפר את יכולות המחקר.
- עיבוד אצווה מאפשר ניתוח מקיף של חלוקת חלבונים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטות לגילוי חיסוני בקנה מידה גדול במוח פרימטים.
- לשפר את יעילות ניתוח ביטוי חלבונים.
- להקל על חקר דפוסי ביטוי מרחביים ברחבי המוח.
שיטות ששימשו
- 4% PFA perfusion לשימור מוח.
- המשכה באמצעות נקודות ציון יישור במטריצה מקיפה.
- חיתוך במישור הכתר לקבלת חלקים סדרתיים.
- עיבוד חיסוני אצווה לניתוח ביטוי חלבונים מרחבי.
תוצאות עיקריות
- המשכה וחיתוך מוצלחים של רקמת מוח פרימטים.
- הוכחת יכולת לנתח דפוסי ביטוי חלבונים.
- טכניקות חדשניות משפרות את יעילות הגילוי החיסוני.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקר נוירו-מדעי.
מסקנות
- השיטות שפותחו משפרות משמעותית את הגילוי החיסוני בקנה מידה גדול.
- טכניקות אלו יכולות לקדם את הבנתנו של ביטוי חלבונים במוח.
- מחקר עתידי יכול לבנות על השיטות הללו ליישומים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Large-scale protein expression mapping in primate brains supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. Batch immunostaining enables reproducible, quantitative assessment of spatial protein distribution across the whole brain, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. This approach addresses a critical gap in translational research by providing disease-relevant system data for lead identification and preclinical model alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping target protein expression across the entire primate brain.
- Operational Value: Supports biological de-risking through uniform staining of serial sections for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing spatially resolved protein expression data for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via batch processing of free-floating sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through synchronized immunostaining of large section sets.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse for reliable compound evaluation in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through alignment of protein expression patterns with neurological disorder models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation using standardized immunostaining protocols.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative measurement of protein levels and neuronal populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation to preclinical research by enabling spatially resolved protein expression analysis in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through whole-brain protein mapping.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility via batch immunostaining of serial sections.
- Analytics: Highlights quantitative readouts such as protein levels and neuron population counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via alignment of expression patterns with biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for large-scale protein detection across multiple targets and studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein expression studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of immunostaining workflows for large section sets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on whole-brain expression profiles.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, immunohistochemistry, and neuroanatomy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including specialized staining dishes, baskets, and microscopy systems.
- Cross-team standardization requirements for section alignment, staining consistency, and data interpretation.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primate versus rodent brain processing.
- Practical limitations including section handling complexity and mounting precision for large-scale serial sections.
