Name: אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: למד שיטת אימונוסטיינינג בקבוצות לגילוי חלבונים בקנה מידה גדול במוח קופים שלמים באמצעות חתכים קורונליים צפים וסימון אנטיגנים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תבניות ביטוי חלבונים במחקר עצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים פרנק ארווין, רוברטה Palmour ואנשי מדעי ההתנהגות קרן מעבדות ממוקם בסנט קיטס, הודו המערבית, על המשך התמיכה עבודתם הפרימטים שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של X השביר קרן המחקר של קנדה (FXRFC) כדי SZ ו - מענקים ההפעלה המכונים הקנדי לבריאות מחקר (AC) ועל הנדסת הלאומי מועצת המחקר של קנדה (MP).

Immunohistochemisty היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר לאפיון ביטוי חלבון במוח של שונות במודלים של בעלי חיים ניסיוניים. קל יחסית לנהל הליכים immunohistochemical שיטתי על מוחותיהם של מכרסמים אחרים מודלים ניסיוניים משותף עם מוח בגודל דומה. עם זאת, אין עבודה שפורסם לידע שלנו המספק תיאור מקיף של איך לבצע את ההליכים immunodetection כאלה ברחבי מוח קוף כולו. להלן תיאור מפורט של איך להכין מוח קוף כולו לגילוי בקנה מידה גדול immunohistochemical של חלבונים היעד השונים. עבודה זו התפתחה כתוצאה של שיתוף פעולה בין יוזמות מסחריות אקדמי. ככזה, פרטים הנוגעים רקמות הטבעה וכן חתך להישאר ידע קנייני של NSA. חלק 1: טיפול בבעלי חיים והכנה רקמה המוח של קוף vervet מבוגר (Cercopithecus aethiops) משמש פרוטוקול הנוכחי. כל ההליכים מתבצעים בהתאם המועצה הקנדית על בריאות בעלי חיים (CCAC) הנחיות שימוש וטיפול בבעלי חיים במחקר ביו 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים היא מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ&quot;ג / ק&quot;ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד exsanguinated לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה ואחריו פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח מוחצן ממוקם PBS שנאגרו פתרונות מדורגים סוכרוז (10, 20 ו ברצף, 30%) המכיל נתרן אזיד 0.02% ומתוחזק ב -4 ˚ C עד המוח שוקע לתחתית המיכל. הפתרון הוא להחליף כל כמה ימים עד שהמוח עובר להקפיא חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא נשלח Neuroscience Associates (NSA; Knoxville, TN) להיות נתון MultiBrain הקניינית שלהם ™ הטבעה ולהקפיא-חתך הטכנולוגיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבע (7) ציוני דרך יישור ממוקמים המטריצה ​​הטבעה כך ניתן לזהות קטעים אוריינטציה כראוי (כלומר, משמאל לימין כיוון) מחדש בציר לאחר עיבוד היסטולוגית תושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלוק קפוא מצולמת דיגיטלית בפניו לחסום לפני כל קטע סדרתי הוא שנאספו ברחוב. תמונות דיגיטליות, כמו גם חלקים מהמוח זה יכול להיות מאוחר יותר נעשה שימוש לשיקום 3D של מפות אנטומית היסטולוגית, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידורי חופשי צף סעיפים העטרה, על עובי של 50 מיקרומטר לכל סעיף, נאספים מן המוח כולו. </li></ol> חלק 2: עיבוד היסטולוגית קטעים נבחרים במרווח מרחבי נתון (למשל, 500 מיקרומטר) ולמטרות הניסוי שלנו עובדו עם נוגדנים הבאים:-X השביר חלבון פיגור שכלי (FMRP; Chemicon: Temecula, CA), SMI32 (Sternberger Monoclonals Inc; בולטימור, MD), ו NeuN (Chemicon: Temecula, CA). FMRP הוא חלבון cytoplasmic כי מצאו בשפע בנוירונים של המוח המוביל נורמלי תמורה 2. NeuN (גרעינים עצבי) דווקא מזהה את ה-DNA מחייבת נוירון ספציפי NeuN חלבון אשר שוהה רוב הנוירונים מופץ גרעינים העצבית, perikarya וכמה תהליכים עצביים הפרוקסימלי 3. SMI-32 היא נוגדן חד שבטי המכירה epitope הלא פוספורילציה על חלבונים neurofilament 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהפרש של 500 מיקרומטר, כ 140 חלקים המשמשים לכל נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubations הכל, תחליבי צעדים מכתים מתבצעות עם תסיסה קלה באמצעות כלים מיוחדים מכתים וסלים (HistoTools; Knoxville, TN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים מודגרת הראשון בתמיסה המכילה 0.1 M טריטון PBS/0.3% X-100 (TX) / 5% נסיוב צרוד רגילה (NHS) במשך 60 דקות על מנת לצמצם מחייב ספציפי של מולקולות נוגדן ו מכתים רקע וכתוצאה מכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים המסומנים FMRP immunostaining לעבור שלב נוסף של התאוששות אנטיגן באמצעות חשיפת Antigen פתרון (וקטור Labs; ברלינגיים, CA) לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים מודגרת אז לילה ובימים נפרד בפתרונות שלהם נוגדן המכיל 0.1 M PBS/0.3% TX / NHS 3% (עם מקדם דילול של 1 / 5, 000 עבור FMRP ו - SMI-32 ו 1 / 2, 000 עבור נוגדנים NeuN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, חלקים נשטפים במשך שלוש תקופות של 10 דקות בתמיסה כביסה (0.1 M TX PBS/0.3%) ואחריו הדגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר נוגדן אנטי עכבר biotinylated משני וגדל סוס (וקטור Labs: 1 / דילול 1000 ב 0.1 M PBS/0.3% NHS TX / 3%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סדרה נוספת של 3 שוטף של 10 דקות, קטעי ממוקמים פתרון של מורכבות avidin-ביוטין חזרת מצומדות peroxidase (וקטור Labs) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לאחר סדרה נוספת של שוטף, הסעיפים חשופים במשך 10 דקות עד קוטר ניקל משופרתminobenzidine (Ni-DAB) תגובה המייצר כחול כהה כתם בתוך הנוירונים immunoreactive. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום ההליך היסטולוגית, קטעי הם רכובים על ג&#39;לטין מצופה שקופיות הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הסעיפים אוויר יבש במשך הלילה coverslipped פי נהלים קבועים. </li></ol> חלק 3: תוצאות נציג: שיטה זו יוצרת פרופיל הביטוי המלא של חלבון המטרה של עניין על פני מוח קוף כולו. כאן אנחנו מראים קטעים העטרה נציג המספקים תמונה של FMRP, NeuN ו SMI32 ביטוי במוח הקוף זהה. <img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig1.png" alt="" /> איור 1: צלחת מכתים (א) ו - סל (ב) המשמש לעיבוד בקנה מידה גדול אצווה של ריחוף ללא חלקים עבור immunodetection. <img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig2.png" alt="" /> איור 2: קטעים העטרה נציגת מוח קוף vervet מוכתם עבור FMRP (A), NeuN (B) SMI32 (C) נוגדנים.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+to+the+Care+and+Use+of+Experimental+Animals%22">Guide to the Care and Use of Experimental Animals</a>. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).</li>
<li>Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FMR-1+protein+is+cytoplasmic%2C+most+abundant+in+neurons+and+appears+normal+in+carriers+of+a+fragile+X+premutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation.</a> Nat Genet. 4, 335-340 (1993).</li>
<li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuN%2C+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116, 201-211 (1992).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודים להצהיר עליהם.

ישנם שני שלבים קריטיים בהליך זה שהופכים בקנה מידה גדול זיהוי של חלבונים במוח הקוף כל האפשר. האחד הוא פרוטוקול הטבעה ואת חתך, אשר נשאר הידע הקנייני של NSA. השני הוא השימוש של מנות מכתים וסלים מסופק על ידי HistoTools. זו האחרונה מאפשרת טיפול קל ומהיר של (~ 40) קטעים רבים בזמן נתון. הוא גם מספק את האמצעים לטיפול אחיד על פני כל חלקי המוח וגורמת לטיפול מדעית היסטולוגית קול. בנוסף, השימוש ציוני מוטבע מספק יתרון נוסף של היכולת דיגיטלית לרכוש את דפוסי מכתים משקופיות יבשים coverslipped ו ל...

<table><tbody><tr><td>נוגדן מונוקלונלי anti-FMRP</td><td>Chemicon International</td><td>MAB2160</td><td>דורש שחזור אנטיגן ברקמה מקובעת.</td></tr><tr><td>נוגדן מונוקלונלי anti-NeuN</td><td>Chemicon International</td><td>MAB377</td><td>N/A</td></tr><tr><td>נוגדן מונוקלונלי anti-Neurofilament H</td><td>Sternberger Monoclonals Inc.</td><td>SMI32</td><td>N/A</td></tr><tr><td>תמיסה לחשיפת אנטיגן (Antigen Unmasking Solution)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>N/A</td></tr><tr><td>סרום סוס נורמלי</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) ביוטינילי, יוצר בסוס</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>ערכה VECTASTAIN ABC (סטנדרטית)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>1.5 mg</td></tr><tr><td>כלי צביעה לחתכים צפים</td><td>HistoTools</td><td>10009</td><td>12 x 65 mm</td></tr><tr><td>סלסילת הובלה לצביעה</td><td>HistoTools</td><td>10012</td><td>גדולה&lt;br/&gt;(מתאימה לכלי 12 x 65 mm)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>P8514B</td><td>N/A</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC11209-0050</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

אצווה immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

אימונוהיסטוכימיה (IHC) הוא אחד טכניקות מעבדה הנפוצה ביותר לצורך זיהוי של חלבונים היעד<em&gt; באתרו</em&gt;. שאלות בנוגע דפוס הביטוי של חלבון מטרה ברחבי המוח כולו קל יחסית לענות בעת שימוש IHC במוח קטן, כמו אלה של מכרסמים. עם זאת, לענות על אותן שאלות במוח גדול ומסורבל, כמו אלה של פרימטים מציג מספר אתגרים. כאן אנו מציגים גישה שיטתית עבור immunodetection של חלבונים היעד במוח קוף בוגר. גישה זו מסתמכת על הרקמה הטבעה וכן חתך מתודולוגיה of Neuroscience Associates (NSA), כמו גם כלים שפותחו במיוחד עבור מכתים אצווה של ריחוף ללא סעיפים. התוצאה היא מכתים אחידה של קבוצה של סעיפים אשר, במרווח מסוים, מייצג את המוח כולו. סעיפים מוכתם וכתוצאה מכך יכולה להיות נתונה למגוון רחב של נהלים אנליטיים על מנת למדוד את רמות החלבון, אוכלוסיית נוירונים לבטא חלבון מסוים.

בקנה מידה גדול immunodetection של חלבונים יעד ברחבי המוח הפרימטים כולו ניתן על ידי העסקת רקמה רומן הטבעה וכן חתך שיטות בשילוב עם השימוש במנגנון יצירתיים מכתים אצווה של ריחוף ללא מקטעים מרובים בכל זמן נתון.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא אחת הטכניקות המעבדתיות הנפוצות ביותר לזיהוי חלבונים מטרה in situ. שאלות הנוגעות ל...

הליך זה מתחיל עם קבלת מוח שעבר פרפוזיה ב-4% PFA, הוצאה חיצונית והגנה בקירור (cryoprotection), אשר נשלח ל-Neuroscience associates לצורך הטמעה באמצעות נקודות ייחוס ליישור המוטמעות במטריצה המקיפה. ניתן לחתוך את המוח במישור הקורונלי כדי להפיק חתכים סדרתיים בעובי רצוי, אשר ייצגו את כל ההויעת הקדמית-אחורית של המוח באמצעות סלים ומכלים ייעודיים. ניתן לבצע עיבוד אימונוהיסטוכימי של סדרות (Batch immuno processing) כדי לקבוע את דפוס הביטוי המרחבי של חלבון לאורך המוח כולו.שלום, אני ד"ר Shaheen Zur ממעבדת מדעי העצבים החזותיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול. שלום, אני ד"ר Mark Burke, גם אני ממעבדת מדעי העצבים החזותיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול. שלום, אני ד"ר Mo Petto, מנהל מעבדת מדעי העצבים החזותיים בבית הספר לאופטומטריה, אוניברסיטת מונטריאול.היום נדגים לכם פרוצדורה לצביעה אימונוהיסטוכימית של סדרות (batch immuno staining) לצורך זיהוי חלבונים בקנה מידה רחב במוח של קוף שלם. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את דפוסי הביטוי של חלבוני מטרה בכל רחבי המוח, וכדי להשוות ולבחון את הביטוי של חלבונים אלו בתוך אותו מוח. אז בואו נתחיל.לפני העיבוד ההיסטולוגי, השג מוח של פרימט, שנשמר באמצעות פרפוזיה סיסטמית, קיבוע מאוחר והגנה בקירור (cryoprotection) באמצעות תמיסות סוכ

batch-immunostaining-for-large-scale-protein-detection-whole-monkey

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בנקאות המוח דגימה שיטתית של חומר ביולוגי מספק את הבסיס stereology משוחדת למקסימום את פוטנציאל נתונים המתקבלים הדגימה כל אחד.

בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך

אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד"ר ליכטמן...

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

מעגלים עצביים מאורגנים מבחינה טופוגרפית עם פרופילים מולקולריים ספציפיים לתאים פונקציונליים. כאן, אנו מספקים את הצעדים המעשיים והטכניים של חשיפת הטופוגרפיה המוח העולמי באמצעות גישה צדדי wholemount מכתים immunohistochemical. אנו להדגים את התועלת של השיטה באמצעות cytoarchitecture מבינים היטב ואת המעגלים של המוח הקטן.

אימונוהיסטוכימיה Wholemount על טופוגרפיה חושפני המוח קומפלקס

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

מקור: Eid, L. &amp; Parent, M. הכנת רקמת מוח של פרימטים לא אנושיים להטמעה מוקדמת של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים. J. Vis. Exp. (2017). סרטון זה מדגים את הכנת רקמת מוח פרימטים לא אנושית קבועה באלדהיד באמצעות אימונוהיסטוכימיה מוקדמת למיקרוסקופ אלקטרונים. הוא מתאר את השלבים לתיוג חיסוני של חלבון עצבי ספציפי, ואחריו תגובת פרוקסידאז המייצרת משקע צבעוני, המאפשר הדמיה של חלבון המטרה במיקרוסקופ אלקטרונים.

ביצוע אימונוהיסטוכימיה על רקמת מוח של פרימטים שאינם אנושיים

פרוטוקול רמת מבוא זה מתאר את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הנדרשים להשלמת צביעה אימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך שימוש בסמנים למיקרוגליה ואלמנטים עצביים כדוגמה.

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.

Immunofluorescence צביעת באמצעות IBA1 ו TMEM119 עבור צפיפות Microglial, מורפולוגיה וניתוח הסתננות מיאלואידית תא היקפית במוח העכבר

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.

חיסון חופשי של מוחות עכבר

דימות טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STPT) היא טכניקה לדימוי מסה של רקמה בצורתה התלת-ממדית על ידי שילוב של דימות דו-פוטוני עם בקרת במה אוטומטית וחיתוך מיקרוטום. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליישומו עבור מוחות מרמוסטים כדי להבין טוב יותר את התכונות המבניות שלהם.

טומוגרפיה טורית של שני פוטונים של כל המוח המרמוסטי לניתוחים נוירואנטומיים

מדעי המוח המודרניים צריכים לחקור הבדלים בין מינים רבים, כולל מכרסמים במעבדה ובני אדם. עם זאת, קשיים טכניים מתעוררים כאשר מעורבים יונקים בעלי מוח גדול. גישה זו מתייחסת לשונות בין-מינים באוכלוסיות נוירונים ביונקים שונים מאוד, ומניבה תוצאות דומות למיפוי לחשיפת דפוסי אבולוציה.

גישה השוואתית למחקרי ספירת תאים כמותיים במוחות יונקים שונים מאוד

למד שיטת אימונוסטיינינג בקבוצות לגילוי חלבונים בקנה מידה גדול במוח קופים שלמים באמצעות חתכים קורונליים צפים וסימון אנטיגנים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תבניות ביטוי חלבונים במחקר עצבים.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

גלה סרטונים נוספים