Name: הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: למד את שיטת הטיהור והתרבות של איי לבלב אנושיים באמצעות שיטת מדרג צפיפות אוטומטית משופרת. שיטה זו מבטיחה איכות גבוהה של האיים לשימוש קליני בהשתלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

נתמך על ידי המייסדים מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, כמו גם משאבים איילט Cell מרכז NIH מענק (RFA-RR 05-003), קרן כריסטופר, קרן Efroymson, וקרן Tellabs.

1. טיהור איים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בהליך טיהור איון, עומס את התיק COBE, מהדק את כל הצינורות מלבד צינור ירוק, ולהגדיר את המהירות ל 1500 ואת סופר יצא 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונה להגדיר את כוסות המשאבה ואת שיפוע ולחבר את צינורות אוסף הצינור הירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו הטעינה של ficoll 1.100 יכולים להתחיל: לדחוף &quot;ספין&quot; ואז מוסיפים 110 מ&quot;ל של Ficoll 1.100 אל כוס הקדמי, ולהתחיל את המשאבה על מנת לטעון את התיק COBE. ככל Ficoll נטען, לחצו סופר החוצה, לעצור את המשאבה, unclamp ראש משאבה ולהגדיר את מהירות החוצה סופר 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ficoll מגיע כוס וכל האוויר הוא גורש מן מהדק מחדש, צינורות בראש המשאבה. קבע את מהירות הסחיטה עד 3000, ואת המהירות החוצה סופר 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להתכונן לטעון את הדרגתיים ידי שפיכת שיפוע כבד לתוך כוס הקדמי. קצת לשחרר את מהדק בין שתי כוסות כדי להסיר כל האוויר. ואז לשפוך את צבע האור לתוך כוס האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל stirrer המגנטי, הקש &quot;ספין&quot; על מכונת COBE, להסיר את מהדק מהצינור המחבר בין שני כוסות, ו חזותית לוודא הדרגתיים כבד וקל הם ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדרגתיים החל ערבוב, להפעיל צנטריפוגות. המתן דקה אחת ולאחר מכן להפעיל את המשאבה כדי לטעון את הדרגתיים ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון הרקמה לתת שיפוע לאזול בכוס הקדמי, אך לא נמוך מספיק כדי לאפשר לאוויר להיכנס שפופרת הטעינה, אז reclamp הצינור המחבר את כוסות לטעון את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשיכים להוסיף את שאר הרקמות. ואז לשטוף את הצינור שהחזיק את הרקמה עם 50 מ&quot;ל של תמיסת לשטוף, ולהשתמש בו כדי לשטוף את הגביע הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו האחרון של רקמות נכנס את התיק, בו זמנית לעצור את המשאבה, unclamp בראש המשאבה, מהדק צינורות מעל התיק. המשך צנטריפוגות במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צנטריפוגה ממשיך להביא את 12 צינורות האוסף מכסה המנוע לשחרר את כובעיהם. חבר את צינורות אוסף צינור צהוב, מקום קצה אוסף סטרילי לתוך צינור חרוטי 1. ואז unclamp צינור צהוב, מהדק את הצינור הירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הסיבוב מסתיים, לאט להעלות Superout עד 100. איסוף 150 מ&quot;ל בשפופרת 1. ואז לאסוף 30 מ&quot;ל צינורות 2-12 (מ 200-230 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף תושלם, לדחוף &quot;עצור&quot; על COBE. עכשיו טיהור כי הסתיימה, איים ניתן להעריך ותרבותי. </li></ol> 2. דגימה ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף שברים מטוהרים איים, להסיר דגימה מכל אחד 12 צינורות איסוף כתם עם Dithizone. מכתים יציג שהם מכילים שכבות איים הטוהר גבוהה לעומת שכבות עם איונים טוהר נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמת טוהר גבוה ונמוך ובריכת כל ביחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ולשטוף פעמיים. לאחר לשטוף את השני, להביא את עוצמת הקול של כל אחד 250 מ&quot;ל עם התקשורת לשטוף הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את השברים ונקווה להתחיל על ידי לקיחת שני 1 מ&quot;ל דגימות מן הגבוהים של שברים ונקווה ואחד מדגם 1 מ&quot;ל מן נמוכה. העברת כל מדגם 1ml לתוך צינור חרוטי המכיל 9 מ&quot;ל של תמיסת לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להעביר 1 מ&quot;ל מהצינור 15 מ&quot;ל כל אחד לצלחת הספירה. לבחון לספור את התאים תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ספירת התאים לחשב את מספר צלוחיות צורך בתרבות איים באמצעות הנוסחה הבאה: (EIN טוהר בסך הכל / של איונים ב העשרונית) / (30,000 עין לכל בקבוק). לדוגמה, 100,000 איים עם טוהר 90% הם בתרבית 4 צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת איים על T175 צלוחיות והתרבות 37 ˚ C ו 5% CO 2 באינקובטור. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

למרות התקדמות משמעותית בשיטות של בידוד איון אדם, תשואה איון להישאר משתנה מאוד ובלתי צפוי. טיהור של רקמת לבלב מתעכל הוא חיוני כדי להתאושש מסה האי מספיק לאחר עיכול אנזימטי מוצלח להשתלה. שיטת טיהור UIC מומלץ כי התאוששות מעולה של איים אדם טהור מאוד הודגם באמצעות שיטה זו. יתר על כן, עד 50 מ&quot;ל של רקמת מעוכל יכול להיות טעון Cobe יחיד לרוץ לטיהור, ובכך לצמצם את איסכמיה הקשורים פציעה של איים אדם על ידי קיצור הזמן הכולל המשמש לבידוד.

<table><tbody><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ציוד</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>מעבד תאים Cobe 2991</td><td>ציוד</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>טיהור איים (Islet purification)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה הפוכה MZ6 TLBD4.1</td><td>ציוד</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>צלחת לתרבית תאים עם רשת של 2 מ"מ</td><td>ציוד</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>ספירת איי לבלב</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>ציוד</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>שק COBE</td><td>ציוד חד-פעמי</td><td>תמיסת O.R.</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית T175</td><td>ציוד חד-פעמי</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אוניברסיטת ויסקונסין (UW)</td><td>ריאגנט</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>הנק (Hank)&amp;rsquo;תמיסב מלחים מאוזנת (HBSS)</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>ריאגנט</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>מדיום M199 (תמיסת שטיפה)</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>שטיפה סופית/מצע גידול</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>דיתיזון</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

ניהול של סוכרת מסוג 1 היא מעיקה, הן הפרט והחברה, עולה מעל 100 מיליארד דולר בשנה. למרות השימוש הנרחב של ניטור גלוקוז אינסולין ניסוחים חדשים, אנשים רבים עדיין לפתח סיבוכים משניים הרסנית. איון השתלת הלבלב יכול לשחזר ליד בקרת גלוקוז נורמלי אצל חולי סוכרת<sup&gt; 1</sup&gt;, בלי הסיכון של התקפי היפוגליקמיה חמורים הקשורים בטיפול אינטנסיבי באינסולין. מתן המוני איון מספיק חשוב איון השתלה מוצלחת. עם זאת, תכונות התורם, רכש איברים ושימור להשפיע על התוצאה בידוד<sup&gt; 2</sup&gt;. באוניברסיטת אילינוי בשיקגו (UIC) פיתחנו פרוטוקול בידוד מוצלח עם שיפוע טיהור משופרת<sup&gt; 3</sup&gt;. התוכנית החלה בחודש ינואר 2004 יותר מ -300 isolations בוצעו עד נובמבר 2008. Pancreata נשלחו בקור פתרונות שימור (UW, אוניברסיטת ויסקונסין או HTK, היסטידין-טריפטופן Ketoglutarate)<sup&gt; 4-7</sup&gt; אל המעבדה תא בידוד בבית UIC לבידוד איון. איי הלבלב בודדו בשיטת UIC, שהיא גירסה שונה של השיטה המתוארת במקור על ידי Ricordi<em&gt; ואח&#39;</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. כפי שתואר חלק א: העיכול אוסף של רקמות הלבלב, הלבלב האנושי היה מטופח, cannulated, perfused ו מעוכל. לאחר איסוף לפחות 30 דקות של הדגרה בתמיסה UW, הרקמה היה טעון מפריד תאים (COBE 2991, Cobe, לייקווד, CO) לטיהור<sup&gt; 3</sup&gt;. לאחר טיהור, תשואה איון (כפי שבאה לידי ביטוי ושווי איון, IEQ), נפח הרקמה, וטוהר נקבע על פי שיטות סטנדרטיות<sup&gt; 9</sup&gt;. איים מבודדים היו בתרבית CMRL-1066 מדיה (Mediatech, הרנדון, VA), בתוספת 1.5% אלבומין אנושי, 0.1% אינסולין transferrin, סלניום (ITS), 1 מ&quot;ל של ציפרופלוקסאצין, 5 מ&quot;ל של HEPES 1M, ו 14.5 מ&quot;ל 7.5% סודיום ביקרבונט ב T175 צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס תרבות לילה לפני איים הושתלו או משמש למחקר.

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון הלבלב האנושי (חלק II: טיהור והתרבות של איים אדם) באמצעות שיטה אוטומטית שונה.

ניהול סוכרת מסוג 1 הוא מעמסה, הן עבור הפרט והן עבור החברה, ועלותו עולה על 100 מיליארד דולרים מדי שנה. למרות השימוש הנרחב ב...

בסרטון זה, רקמת לבלב שבודדה ועוכלה בעבר עוברת טיהור במדרג זרימה (fial gradient purification), שיניב פראקציה מטוהרת של איים לבלביים שניתן יהיה בסופו של דבר לתרבת בבקבוקי תרבית רקמה עד להשתלה. שלום, אני American Chief ממעבדת תוכנית האיים האנושיים במחלקה לכירורגיה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. שלום, שמי ברברה ברברו ואני גם חלק מתוכנית האיים האנושיים.היום נדגים לכם פרוצדורה לבידוד איים מהלבלב האנושי. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי להפיק איים אנושיים באיכות גבוהה לשימוש קליני. בואו נתחיל.כדי להתחיל את הליך טיהור ה-eyelet, טענו את שקית ה-COBE, סגרו את כל הצינורות למעט הירוק, והגדירו בתוך המנדף את המהירות ל-1500 ואת ה-super out לאפס. הגדירו את המשאבה ואת כלי השיקוע למדרג (gradient beakers) וחברו את צינור האיסוף לצינור הירוק. כעת ניתן להתחיל את טעינת ה-FI call, לחצו על spin.לאחר מכן, הוסיפו 110 milliliters של fi. בצעו Call לכלי הביקר הקדמי והפעילו את המשאבה כדי למלא את שקית ה-COBE. כאשר ה-FI call נטען, לחצו על super out.עצרו את המשאבה, שחררו את התפסן של ראש המשאבה והגדירו את מהירות ה-super out ל-100. כאשר קו החזית (FI) מגיע לכוס הביקר וכל האוויר נפלט מהצינורית, סגרו את התפסן בראש המשאבה, הגדירו את מהירות הסיבוב ל-3000 ואת מהירות ה-super out לאפס. כעת התכוננו להעמסת הגרדיאנטים על יד

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון האדם הלבלב (אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב) בשיטה אוטומטית שונה.

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

אספקת 2 איים סוכרת סוג למחקר אינה מספיקה. כאן אנו חולקים פרוטוקול שלנו לבידוד איים של חולים שעברו pancreatectomy חלקית. גישה זו מהווה מקום מפגש ייחודי לקבלת איים של סוכרת מסוג 2 שאינם מתאימים קלינית סוכרת הנושאים במספרים נאותה מחקרים בסיסיים וקליניים.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

איי הלבלב, המכונים גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצר הורמונים לוויסות גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. פרוטוקול זה מסביר שיטה לבידוד איי הלבלב על ידי החדרת קולגנאז תחילה דרך אמפולה של Vater כדי לעכל את רקמת הלבלב האקסוקרינית וצנטריפוגה הדרגתית צפיפות פשוטה כדי לטהר את האיים מעכברים.

בידוד איי הלבלב באמצעות זילוח Collagenase: שיטה אנזימטית לבידוד תאי איון הלבלב

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לרכישת לבלב חזירי לבידוד וטיהור איונים.

זילוח כירורגי ובידוד הלבלב החזירי לבידוד האי

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור גרדיאנט צפיפות של איי הלבלב של עכברוש לואיס, המאפשר הכנות בעלות תפוקה גבוהה וטוהר לשימוש ישיר בהשתלות או במחקרים במבחנה .

בידוד וטיהור איי הלבלב מחולדות לואיס באמצעות עיכול אנזימטי והפרדה בין צפיפות לגרדיאנט

למד את שיטת הטיהור והתרבות של איי לבלב אנושיים באמצעות שיטת מדרג צפיפות אוטומטית משופרת. שיטה זו מבטיחה איכות גבוהה של האיים לשימוש קליני בהשתלות.

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

גלה סרטונים נוספים