Name: הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: למד כיצד לייצר ולהרחיב תאי B מופעלי CD40 אקס-ויו מתאי דם פריפריים. שיטה זו חושפת את תפקידי תאי B כתאים מציגי אנטיגן ומסייעת במחקר מחלות אוטואימוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים אנושיים B מ PBMC מחולק לשני חלקים: חלק א &#39;מדגים את הכנת CD40 ליגנד להביע NIH/3T3 תאים, אשר ישמש צלחת הנכנס לתאים מזין. חלק ב &#39;מתאר את התרבות בפועל CD40-B. א הכנת תאים מזין (tCD40L NIH/3T3) NIH/3T3 tCD40L הוא תא חסיד Murine פיברובלסטים קו, שלא צריך להיות ומחוברות לגמרי. התאים splitted ולכן פעמיים בשבוע. Culturing על יותר מ 6 שבועות לא מומלץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הישן מתרבות הראשוני עם פיפטה סטרילית ולשטוף תאים עם 10 מ&quot;ל של 1x PBS. לשאוב PBS לאחר כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל טריפסין / EDTA בתוך בקבוקון 75 ס&quot;מ 2 למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. השתמש הקשה עדין לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום סוג בר המסתובב בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל עם טפטפת סטרילית ספין התאים לעבר XG 225 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מ&quot;ל של מדיום סוג בר. ספירת תאים של aliquot ההשעיה התא להכין שלושה צינורות 50 מ&quot;ל עם מספר מתאים של תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 x 10 6 תאים subculturing </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.2 x 10 6 תאים / היטב הקרנה המשמש תרבות CD40-B לתא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר להקפיא (במידת הצורך). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים לעבר XG 225 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור subculturing: resuspend 1.5 x 10 6 תאים 10 מ&quot;ל בינוני בר להקליד 75 ס&quot;מ 2 בקבוק תא התרבות (צפיפות התאים 1.5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל), מוסיפים G-418 [0.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל] ו דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2. פיצול התאים פעמיים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך תרבות CD40-B התא: אתה צריך 1.2 x 10 6 תאים צלחת 6-גם אחד. Resuspend התאים בינוני סוג בר בצפיפות של 0.1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ו - מקרינים אותם 78 Gy. פלייט 2 מ&quot;ל של ההשעיה לתוך כל תא היטב דגירה אותם 37 ° C עם 5% CO 2. השתמש צלחות מוכן גירוי B-cell כאשר tCD40L NIH/3T3 תאים חסיד (לפחות 4 שעות: הדבקות לבדוק עם מיקרוסקופ, לא לחכות יותר מ 24 שעות כדי להתחיל B-cell גירוי). (המשך ב) </li></ol></li></ol> ב 40 CD-B תרבית תאים I. הכנת PBMCs לגירוי-CD40 (יום 0): שימו לב: לפני שאתה ממשיך לוודא כי הם תאים מזין חסיד. תמיד להוסיף פתרונות טריים של interleukin-4 ו ציקלוספורין למדיום הגידול מיד לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח PBMCs, או טרי או מופשר כראוי. Resuspend PBMCs פעמיים 50 מ&quot;ל של 1x PBS לשטוף אותם ספין למטה בפעם הראשונה ב XG 265 דקות 7 ופעם שנייה ב XG 190 דקות 7 להסיר תאים אחרים. בטל supernatant ו resuspend התאים 20 מ&quot;ל של PBS. קבע את מספר תא aliquot ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה הכמות הנדרשת של תאים ב XG 225 דקות 5. עבור צלחת 6-באר 4 x 10 6 תאים / גם יש צורך, ובכך 24 x 10 6 תאים לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend PBMC ב 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל במדיום CD40 B-תרבות בתוספת טרי עם 50 U / mL של interleukin-4 כגורם צמיחה 0.63 מיקרוגרם / מ&quot;ל ציקלוספורין כדי למנוע תוצאה של T-תאים (ריכוזים בהתחשב מתייחסים בינוני תרבות אחת מ&quot;ל!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מ 6 גם צלחת מראש מודגרות עם NIH/3T3 תאים tCD40L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את חסיד tCD40L NIH/3T3 תאים עם 2 מ&quot;ל PBS לכל טוב הראשון בשלב השני עם 2 מ&quot;ל של מדיום CD40 B-הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 4 מ&quot;ל של השעיה PBMC (1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, reculture התאים (המשך 3.2.). </li></ol> השנייה. Recultivation של CD40-B תאים (יום 7 ואז כל 3-4 ימים): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבציר אשכולות של CD40 בתאי B-6-מהצלחת היטב על ידי resuspending עם פיפטה 10 מ&quot;ל ובריכת אותם לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG 225 במשך 7 דקות, לגמרי להחליף את supernatant עם המדיום CD40 B-הכביסה. בעוד לספור את כמות התאים של aliquot, לסובב את התאים לעבר XG 225 במשך 5 דקות. Resuspend CD40 בתאי B-בינוני CD40 B-תרבות בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרונות טריים של interleukin-4 בריכוז של 50 U / mL ו - 0.63 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ציקלוספורין למדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם NIH/3T3 תאים tCD40L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים חסיד עם 2 מ&quot;ל PBS לכל טוב הראשון בשלב השני עם 2 מ&quot;ל של מדיום CD40 B-הכביסה. </li><li&gt; בעדינות להוסיף 4 מ&quot;ל (1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל) של השעיה CD40-B היטב בכל צלחת 6-הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תת שוב כל 3-4 ימים כדי לגמור עם טהור מאוד CD40 המופעל בתאים אנושיים B לאחר סך של 14 ימים. </li></ol> ג בעיות הירי - מה אם תאים CD40-B אינם גדלים? <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקת ביטוי CD40 ליגנד של תאים מזין? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת הנכנס מזין תאים המשמשים גירוי לא צריך להיות מעל גיל 24 שעות? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם זיהום אפשרי עם mycoplasma? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם הפתרון interleukin-4 המשמש כתוסף מופשר טרי והיה לו את הפעילות הביולוגית המתאים? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם ציקלוספורין נוסף בריכוז הנכון? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="איור 1" /> באיור 1. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="איור 2" /> איור 2. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

א הכנת מדיה: <table border="1"cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> תא מזין בינוני סוג בר </td><td colspan="2"> תא מזין מבחר בינוני </td></tr><tr><td> מגיב </td><td> ריכוז </td><td> מגיב </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> DMEM-Ham של / F12 </td><td></td><td> DMEM-Ham של / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 365 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> L-גלוטמין </td><td> 365 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G-418 </td><td> 0.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40-B בינוני כביסה </td><td colspan="2"> CD40-B בינוני תרבות </td></tr><tr><td> מגיב </td><td> ריכוז </td><td> מגיב </td><td> ריכוז </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 584 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> L-גלוטמין </td><td> 584 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 מ&quot;מ </td><td> HEPES </td><td> 25 מ&quot;מ </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> RH transferrin </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> RH אינסולין </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB-Humanserum </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> ב שונות ריאגנטים: <table cellspacing="0" border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> אין סדר </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / חם של F12 </td><td> PAA </td><td> לא חתול: E15-813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco של PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> חתול לא H15-011 </td></tr><tr><td> AB-Human Serum </td><td> Invitrogen </td><td> חתול לא 34005100 </td></tr><tr><td> הולוגרמות transferrin אדם </td><td> סיגמא </td><td> חתול לא T0665 </td></tr><tr><td> אינסולין אנושי </td><td> סיגמא </td><td> חתול לא I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> דלתא בחר </td><td> לאמנות אין 7395800 </td></tr><tr><td> אינטרלויקין 4 האדם רקומביננטי </td><td> Immunotools </td><td> חתול לא 11130045 </td></tr><tr><td> ציקלוספורין </td><td> נוברטיס </td><td> חתול לא 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> חתול לא DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES הצפת </td><td> PAA </td><td> חתול לא S11-001 </td></tr><tr><td> G-418 סולפט </td><td> PAA </td><td> חתול לא P02-012 </td></tr><tr><td> טריפסין / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> ג שונות וחומרים: <table cellspacing="0" border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> אין סדר </td></tr><tr></tr><tr><td> סטרילי פיפטה טיפים </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 גם צלחת </td><td> NUNC </td><td> חתול לא 140675 </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל צינור חרוטי </td><td> BD פלקון ™ </td><td> חתול לא 352070 </td></tr><tr><td> תרבות רקמות צפחת </td><td> SARSTEDT </td><td> חתול לא 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

הדור של האדם cd40 בתאי b המופעל

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) זוהו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור חיסוני סרטן 1-3. לעומת תאים דנדריטים (DCS), APC מאופיין הטובה ביותר, תאים CD40-B יש מספר מאפיינים ביולוגיים טכני מובהק. בדומה DCs, תאים B להראות ביטוי מוגבר של MHC ושיתוף גירוי מולקולות (Fig.1b), מפגינים יכולת הנדידה חזק מצגת להציג ביעילות אנטיגן ותאי T, לאחר גירוי עם ליגנד interleukin-4 ו CD40 (CD40L). עם זאת, בניגוד DCs בוגר או בוגרת, CD40 בתאי B-לבטא את לימפה הצומת השלישיה ביות מלא המורכב CD62L, CCR7/CXCR4, ותפקוד ליקוציט אנטיגן-1 (LFA1, CD11a/CD18), הכרחי ביות הלימפה לאיברים משני (Fig.1a) 3. תאים CD40-B יכול להיווצר ללא קשיים של כמויות קטנות מאוד של דם היקפיים אשר ניתן להרחבה נוספת במבחנה על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים סרטניים (&gt; 10 9 תאים לכל מטופל) מתורמים בריאים, כמו גם חולים (Fig.1c, ד) 1,4. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו CD40-B תאים PBMC האדם. מולקולות מרכזיות בתרבות התא CD40 ליגנד, interleukin-4 (IL-4) ציקלוספורין A (CSA), אשר מתחדש בכל יום מחזור 3-4 התרבות. לענין מעבדה CD40 גירוי מסופק על ידי תאים NIH/3T3 להביע רקומביננטי אנושי CD40 ליגנד (tCD40L NIH/3T3) 5. כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 האדם על transfectants יש להיבדק באופן קבוע (Fig.2). לאחר 14 ימים CD40-B בתרביות תאים מורכבים יותר טהור 95% תאים B ו הרחבה של CD40-B תאים מעל 65 ימים ניתן לעתים קרובות ללא כל אובדן של 1 לתפקד, 4. תאים CD40-B ביעילות לקחת, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T 6. הם לא רק naϊve הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון בתאי T 7,8. CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell, הפעלת התמיינות ותפקוד. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור חיסון או טיפול מונע נגד גידולים 9.

בסרט זה אנו מציגים את<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דור והרחבת CD40 המופעל בתאים אנושיים B (CD40-B) מתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) על ידי גירוי עם ליגנד CD40 ו - interleukin-4.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

תאי B שהופעלו על ידי CD40 (תאי CD40-B) זוהו כמקור חלופי של תאים מציגי אנטיגן (APC) ממריצים את מערכת החיסון עבור סרטן...

שלום, שמי אלכסנדר שיקו ואן האגן. אני חבר במעבדה לאימונולוגיה ואימונולוגיה של השגרה בבית החולים האוניברסיטאי של קלן. בסרטון זה, נראה לכם כיצד ניתן להפיק תאי B אנושיים המופעלים על ידי CD 40 מתאי PBMC (תאים חד גרעיים של דם פריפרי).אחד מהתחומי עניין המרכזיים של המעבדה שלנו הוא חקר התפקודים של תאי B שאינם תלויים בנוגדנים. מעבר לתפקידם כמייצרי נוגדנים, לתאי B יש תפקיד חשוב כתאים מציגי אנטיגן, הן בתנאים פיזיולוגיים והן במחלות אוטואימוניות. לאחר הפעלה, תאי B יכולים לרכוש יכולות עוצמתיות של הצגת אנטיגן ועיגור מערכת החיסון, במיוחד כאשר הם מופעלים באמצעות CD 40.CD 40. לתאי B מופעלים יש מספר יתרונות בהשוואה לתאים דנדריטיים. ניתן להרחיב אותם בקלות ובעלות נמוכה יחסית מכמויות קטנות של דם פריפרי, כולל ממטופלים הסובלים מסרטן.כעת, סטודנטית הדוקטורט שלנו, Tanya Leic והטכנאי שלנו LER, ייתנו לכם מדריך שלב אחר שלב על האופן שבו מייצרים תאי B אנושיים המופעלים על ידי CD 40 מדם פריפריאלי. שלום, שמי Tanya Livi. אני סטודנטית לדוקטורט ואני רוצה להדגים לכם כיצד לייצר תאי B אנושיים המופעלים על ידי CD 40.נוהל זה עבר אופטימיזציה במעבדה שלנו. השלבים העיקריים הם, ראשית, הכנת תאי הזנה. לשם כך, אנו משתמשים בתאי N IH 33 שעברו טרנספקציה לליגנד של CD 40 אנושי, אשר הוקרנו ב-78 gray ונזרעו על פלטות של שישה בארות.שנית, אנו מתחילים בתרבית של תאי B אנושיים מופעלים CD 40 מתוך PBMC מטוהרים, אשר מטופלים ב-interleukin four אנושי וב-cyclosporine A; תאים אלו נזרעים לאחר מכן על תאי feeder בלוחות של שש בארות. הליך זה חוזר על עצמו ביום השביעי ואז בכל שלושה עד ארבעה ימים עד ליום ה-14 של תרבית התאים. כדי להגיע לתאי B אנושיים מופעלים CD 40 בדרגת טהרה גבוהה, אנו מתחילים את ייצור תאי ה-B המופעלים CD 40 עם PBMC אנושיים שטוהרו טריים או שהופשרו באופן מתאים.ראשית, נשטוף את ה-PBMC פעמיים, ולכן נשעה את התאים ב-50 ml של PBS. נסובב את ה-PBMC למשך שבע דקות במהירות של 1300 RPM, המקבילה ל-260 ×g. לאחר הסבוב, נשלוף את העלייה ונשעה את התאים שוב ב-50 ml של PBS, ונסובב אותם שוב למשך שבע דקות במהירות של 1100 RPM, המקבילה ל-190 ×g. לאחר מכן, נשלוף שוב את העלייה לצורך קביעת ספירת התאים.השעה את ה-PBMC ב-20 milliliter של PBS, ערבב את התאים היטב באמצעות וורטקס וקבע את מספר התאים. סבב (spin down) את הכמות הנדרשת של PBMC עבור תרבית CD 40 B למשך חמש דקות ב-1200 RPM, המקביל ל-220 5G. בשימוש בלוח שש בארות, נדרשים ארבעה פעמים 10 to the six תאים לבערה, ובסך הכל 24 פעמים 10 to the six תאים ללוח.לאחר מכן, השהו מחדש את ה-PBMC בריכוז של 1×10⁶ תאים למיליליטר במצע תרבית CD 40 B. הוסיפו לתליה התאים human IL-4 טרי בריכוז של 50 units/mL לצורך סטימולציה, ו-cyclosporine A בריכוז של 0.63 µg/mL כדי למנוע צמיחה של תאי T. כעת תליית ה-PBMC מוכנה לסטימולציה באמצעות CD 40 ligand.למיטב ידיעתנו, נכון לעכשיו אין ליגנד CD 40 בדרגת GMP פונקציונלית זמין. לפיכך, אנו משתמשים בתאי NIH three T three שעברו טרנספקציה של ליגנד CD 40 אנושי כדי לעודד הישרדות, התמיינות ופרוליפרציה של תאים, שכן שורת התאים NIH three T three יכולה לשרוד בתרבית למשך מספר חודשים. יש לשלול אובדן של ביטוי ליגנד CD 40 באופן קבוע באמצעות בדיקות.קו התאים NIH 3T3 שעבר טרנספקציה של CD 40 ligand הוא קו תאים נצמדים המגודלים ב-37°C עם 5% CO2 במדיום סלקציה, המועשר ב-G 4 1 8 בריכוז של 0.7 mg/mL. קו תאי פיברובלסטים נצמדים זה לא צריך להגיע למצב של התלכדות (confluence) מלאה ויש לפצלו פעמיים בשבוע. כדי לפצל את התאים הנצמדים, שאבו את המדיום, שטפו פעם אחת עם 10 mL PBS וסובבו בעדינות. שאבו שוב את המדיום והוסיפו 4 mL trypsin EDTA בבקבוק של 75 cm².דגרו את הבקבוק במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור. הוציאו את הבקבוק שוב. השתמשו בטפיחות עדינות כדי להפריד את התאים מהפלסטיק.לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliter של המדיום לסוג הפרא (wild type), סובבו בעדינות והעבירו את התאים למבחנה של 50 milliliter. צנטריפוגו את תאי ה-NA eight three T three למשך חמש דקות ב-1200 RPM, המקבילים ל-hundred and 20 5G. השביו בזהירות את משקע התאים ב-10 millimeter של מדיום סוג פרא (wild type).קבע את ספירת התאים עבור תת-תרבית N IH 33 והשהה מחדש 1.5 × 10⁶ תאי מזינים (feeder cells) ב-10 ml מצע wildtype. העבר אותם לבקבוק תרבית (flask) של 75 cm² והוסף G 4 1 8 בריכוז של 0.7 mg/ml כדי לבצע סלקציה לתאים שעברו טרנספקציה ונושאים גנים לעמידות נאומיצין. לבסוף, דגור את תאי המזינים ב-37 °C וב-5% CO2 לצורך סטימולציית CD 40 B.קח את שאר תאי ה-NI 8 3 3 והקרן אותם במינון קטלני של 78 gray כדי לעצור את התרבותם. דלל את תאי המצע (feeder cells) המוקרנים במצע מסוג wire לצפיפות תאים של 0.1 × 10⁶ תאים למילליטר, ופזר 2 mL לכל באער בצלחת 6 באערים. אפשר לתאים בצלחות ה-6 באערים להיצמד שוב לפני השימוש בהם כתאי מצע, על ידי דגירה למשך 24 שעות ב-37 °C וב-5% CO2 לצורך גירוי של תאי B לימפוציטים עם CD 40 ligand.בדקו תחת המיקרוסקופ אם תאי המזינים (feeder cells) שנזרעו יום קודם לכן נצמדו למשטח. אם תאי המזינים נצמדו, הסירו את SUP natin מכל באר ושטפו אותן במהירות פעמיים. ראשית, שטפו כל באר עם 2 mL של PBS ושנית עם 2 mL.תוכנית שטיפה של CD 40 B עבור גירוי של תרחיף ה-PBMC. הוכנה זמן קצר לפני כן בריכוז תאים של 1×10⁶ תאים ל-mL עבור תאי המזין (feeder cells). לשם כך, העבר בעדינות 4 mL מתרחיף התאים לכל אחד.יש לדגור את הצלחת בטמפרטורה של 37°C וב-5% CO2 ביום השביעי. ניתן לבצע תת-תרבית לתאי B של CD 40 עבור תת-התרבית הראשונה של CD 40. תאי B מופעלים ביום השביעי, ותת-תרביות עוקבות בכל שלושה עד ארבעה ימים.אסוף בעדינות את התאים הצביריים מלוח ה-6 12 באמצעות Resus, על ידי תליה באמצעות פיפט של 10 milliliter. העבר את תאי ה-CD 40 B למבחנה של 50 milliliter. סבב את תאי ה-CD 40 B במשך שבע דקות ב-1200 RPM, המקביל ל-220 5G באופן מלא.החליפו את המצע במצע שטיפה של CD 40 B וקבעו את מספר התאים של תאי B מופעלים על ידי CD 40. השביו את תאי ה-CD 40 B בריכוז של 1×10⁶ תאים למילליליטר במצע תרבית של CD 40 B.לאחר מכן, הוסיפו לתליה התאים IL-4 אנושי טרי בריכוז של 50 units/mL ו-cyclosporine A בריכוז של 0.63 µg/mL לצורך גרייה. השתמשו בתאי מאכל (feeder cells) מקרינים שהוכנו יום קודם לכן. כמובן, יש לבדוק שוב את היצמדות תאי המאכל המקרינים תחת המיקרוסקופ מיד לפני השימוש.אם התאים הדבקים נצמדו, שטפו את תאי המזין (feeder cells) במהירות פעמיים כפי שבוצע קודם: פעם אחת עם PBS ופעם נוספת עם מדיום שטיפה CD 40 B, ולאחר מכן העבירו בזהירות 4 ml של תרחיף CD 40 B שרוכז ל-1×10⁶ תאים למילליטר לכל באער של פלטת 6 באערים. יש לחזור על תהליך הסוב-קלטורה באופן זהה לאחר שלושה עד ארבעה ימים, פעמיים בשבוע, עד לקבלת צבירי תאים של תאי B אנושיים מופעלים ב-CD 40 בדרגת טוהר גבוהה ביום ה-14 של התרבית.בשלב זה, תאי B מסוג CD 40 מביעים מולקולות קו-סטימולטוריות כגון CD 80, CD 86, CD 83, מולקולות MHC, ומה שנקרא טריאדת ה-homing לקשריות הלימפה הכוללת את CD 62 ligand, CCR seven ו-LFA one, שניתן לבדוק באמצעות זרימה (flow) במהלך הייצור לצורך פתרון בעיות. אנא עיינו בגרסת הטקסט של פרוטוקול זה. אנו מקווים שבעתיד תאי B שהופעלו על ידי CD 40 ישמשו ככלי חשוב לאימונותרפיה של הסרטן.בהצלחה בניסויים שלכם.

generation-of-human-cd40-activated-b-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

מערכת יעילה של מבנה וניתוח פונקציה של גן...

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה ליצירת תאים דנדריטיים פלסמקיטואידים (pDCs) מתאי אב לימפואידים נפוצים (CLPs). לאחר תרבית משותפת של CLPs מטוהרים עם תאי הזנה מוקרנים γ בנוכחות ליגנד טירוזין קינאז-3 דמוי FMS (FL), CLPs מתמיינים ל-pDCs שאינם דבקים, שנוכחותם מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה.

דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ספציפיים לגידול (iPSC) הנגזרים מתאי CD8αβ+ T. תאי גזע מושרים ספציפיים לאנטיגן הגידול גדלים על חד-שכבה של תאי סטרומה ומתמיינים לתאי אב המטופויטיים (HPC). HPCs מתמיינים לתאי T חיוביים כפולים CD4+ CD8+ באמצעות מדיום התמיינות. תאים אלה מגורים לאחר מכן כדי ליצור תאי T חיוביים בודדים המבטאים CD8.

יצירת תאי CD8 T חיוביים בודדים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

מאמר זה מתאר שיטה ליצירה והתפשטות של שיבוטי תאי T אנושיים המגיבים באופן ספציפי לאלואנטיגן מוגדר. ניתן להתאים פרוטוקול זה לשיבוט תאי T אנושיים ספציפיים למגוון ליגנדים של פפטיד-MHC.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

כאן, אנו מדגימים כיצד מונוציטים מבודדים על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי לאחר צנטריפוגה בשיפוע צפיפות של דם אנושי נוגד קרישה. לאחר הדגירה במשך 5 ימים, מונוציטים אנושיים מתמיינים לתאים דנדריטיים לא בשלים ומוכנים להליכים ניסיוניים בסביבה לא קלינית.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

שימוש במערכות רב שלבי תרבות, מדווחים תא B במבחנה למודל התמיינות תאים פלזמה.

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

למד כיצד לייצר ולהרחיב תאי B מופעלי CD40 אקס-ויו מתאי דם פריפריים. שיטה זו חושפת את תפקידי תאי B כתאים מציגי אנטיגן ומסייעת במחקר מחלות אוטואימוניות.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

גלה סרטונים נוספים