הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

שלום, שמי אלכסנדר שיקו ואן האגן. אני חבר במעבדה לאימונולוגיה ואימונולוגיה של השגרה בבית החולים האוניברסיטאי של קלן. בסרטון זה, נראה לכם כיצד ניתן להפיק תאי B אנושיים המופעלים על ידי CD 40 מתאי PBMC (תאים חד גרעיים של דם פריפרי).

אחד מהתחומי עניין המרכזיים של המעבדה שלנו הוא חקר התפקודים של תאי B שאינם תלויים בנוגדנים. מעבר לתפקידם כמייצרי נוגדנים, לתאי B יש תפקיד חשוב כתאים מציגי אנטיגן, הן בתנאים פיזיולוגיים והן במחלות אוטואימוניות. לאחר הפעלה, תאי B יכולים לרכוש יכולות עוצמתיות של הצגת אנטיגן ועיגור מערכת החיסון, במיוחד כאשר הם מופעלים באמצעות CD 40.

CD 40. לתאי B מופעלים יש מספר יתרונות בהשוואה לתאים דנדריטיים. ניתן להרחיב אותם בקלות ובעלות נמוכה יחסית מכמויות קטנות של דם פריפרי, כולל ממטופלים הסובלים מסרטן.

כעת, סטודנטית הדוקטורט שלנו, Tanya Leic והטכנאי שלנו LER, ייתנו לכם מדריך שלב אחר שלב על האופן שבו מייצרים תאי B אנושיים המופעלים על ידי CD 40 מדם פריפריאלי. שלום, שמי Tanya Livi. אני סטודנטית לדוקטורט ואני רוצה להדגים לכם כיצד לייצר תאי B אנושיים המופעלים על ידי CD 40.

נוהל זה עבר אופטימיזציה במעבדה שלנו. השלבים העיקריים הם, ראשית, הכנת תאי הזנה. לשם כך, אנו משתמשים בתאי N IH 33 שעברו טרנספקציה לליגנד של CD 40 אנושי, אשר הוקרנו ב-78 gray ונזרעו על פלטות של שישה בארות.

שנית, אנו מתחילים בתרבית של תאי B אנושיים מופעלים CD 40 מתוך PBMC מטוהרים, אשר מטופלים ב-interleukin four אנושי וב-cyclosporine A; תאים אלו נזרעים לאחר מכן על תאי feeder בלוחות של שש בארות. הליך זה חוזר על עצמו ביום השביעי ואז בכל שלושה עד ארבעה ימים עד ליום ה-14 של תרבית התאים. כדי להגיע לתאי B אנושיים מופעלים CD 40 בדרגת טהרה גבוהה, אנו מתחילים את ייצור תאי ה-B המופעלים CD 40 עם PBMC אנושיים שטוהרו טריים או שהופשרו באופן מתאים.

ראשית, נשטוף את ה-PBMC פעמיים, ולכן נשעה את התאים ב-50 ml של PBS. נסובב את ה-PBMC למשך שבע דקות במהירות של 1300 RPM, המקבילה ל-260 ×g. לאחר הסבוב, נשלוף את העלייה ונשעה את התאים שוב ב-50 ml של PBS, ונסובב אותם שוב למשך שבע דקות במהירות של 1100 RPM, המקבילה ל-190 ×g. לאחר מכן, נשלוף שוב את העלייה לצורך קביעת ספירת התאים.

השעה את ה-PBMC ב-20 milliliter של PBS, ערבב את התאים היטב באמצעות וורטקס וקבע את מספר התאים. סבב (spin down) את הכמות הנדרשת של PBMC עבור תרבית CD 40 B למשך חמש דקות ב-1200 RPM, המקביל ל-220 5G. בשימוש בלוח שש בארות, נדרשים ארבעה פעמים 10 to the six תאים לבערה, ובסך הכל 24 פעמים 10 to the six תאים ללוח.

לאחר מכן, השהו מחדש את ה-PBMC בריכוז של 1×10⁶ תאים למיליליטר במצע תרבית CD 40 B. הוסיפו לתליה התאים human IL-4 טרי בריכוז של 50 units/mL לצורך סטימולציה, ו-cyclosporine A בריכוז של 0.63 µg/mL כדי למנוע צמיחה של תאי T. כעת תליית ה-PBMC מוכנה לסטימולציה באמצעות CD 40 ligand.

למיטב ידיעתנו, נכון לעכשיו אין ליגנד CD 40 בדרגת GMP פונקציונלית זמין. לפיכך, אנו משתמשים בתאי NIH three T three שעברו טרנספקציה של ליגנד CD 40 אנושי כדי לעודד הישרדות, התמיינות ופרוליפרציה של תאים, שכן שורת התאים NIH three T three יכולה לשרוד בתרבית למשך מספר חודשים. יש לשלול אובדן של ביטוי ליגנד CD 40 באופן קבוע באמצעות בדיקות.

קו התאים NIH 3T3 שעבר טרנספקציה של CD 40 ligand הוא קו תאים נצמדים המגודלים ב-37°C עם 5% CO2 במדיום סלקציה, המועשר ב-G 4 1 8 בריכוז של 0.7 mg/mL. קו תאי פיברובלסטים נצמדים זה לא צריך להגיע למצב של התלכדות (confluence) מלאה ויש לפצלו פעמיים בשבוע. כדי לפצל את התאים הנצמדים, שאבו את המדיום, שטפו פעם אחת עם 10 mL PBS וסובבו בעדינות. שאבו שוב את המדיום והוסיפו 4 mL trypsin EDTA בבקבוק של 75 cm².

דגרו את הבקבוק במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור. הוציאו את הבקבוק שוב. השתמשו בטפיחות עדינות כדי להפריד את התאים מהפלסטיק.

לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliter של המדיום לסוג הפרא (wild type), סובבו בעדינות והעבירו את התאים למבחנה של 50 milliliter. צנטריפוגו את תאי ה-NA eight three T three למשך חמש דקות ב-1200 RPM, המקבילים ל-hundred and 20 5G. השביו בזהירות את משקע התאים ב-10 millimeter של מדיום סוג פרא (wild type).

קבע את ספירת התאים עבור תת-תרבית N IH 33 והשהה מחדש 1.5 × 10⁶ תאי מזינים (feeder cells) ב-10 ml מצע wildtype. העבר אותם לבקבוק תרבית (flask) של 75 cm² והוסף G 4 1 8 בריכוז של 0.7 mg/ml כדי לבצע סלקציה לתאים שעברו טרנספקציה ונושאים גנים לעמידות נאומיצין. לבסוף, דגור את תאי המזינים ב-37 °C וב-5% CO2 לצורך סטימולציית CD 40 B.

קח את שאר תאי ה-NI 8 3 3 והקרן אותם במינון קטלני של 78 gray כדי לעצור את התרבותם. דלל את תאי המצע (feeder cells) המוקרנים במצע מסוג wire לצפיפות תאים של 0.1 × 10⁶ תאים למילליטר, ופזר 2 mL לכל באער בצלחת 6 באערים. אפשר לתאים בצלחות ה-6 באערים להיצמד שוב לפני השימוש בהם כתאי מצע, על ידי דגירה למשך 24 שעות ב-37 °C וב-5% CO2 לצורך גירוי של תאי B לימפוציטים עם CD 40 ligand.

בדקו תחת המיקרוסקופ אם תאי המזינים (feeder cells) שנזרעו יום קודם לכן נצמדו למשטח. אם תאי המזינים נצמדו, הסירו את SUP natin מכל באר ושטפו אותן במהירות פעמיים. ראשית, שטפו כל באר עם 2 mL של PBS ושנית עם 2 mL.

תוכנית שטיפה של CD 40 B עבור גירוי של תרחיף ה-PBMC. הוכנה זמן קצר לפני כן בריכוז תאים של 1×10⁶ תאים ל-mL עבור תאי המזין (feeder cells). לשם כך, העבר בעדינות 4 mL מתרחיף התאים לכל אחד.

יש לדגור את הצלחת בטמפרטורה של 37°C וב-5% CO2 ביום השביעי. ניתן לבצע תת-תרבית לתאי B של CD 40 עבור תת-התרבית הראשונה של CD 40. תאי B מופעלים ביום השביעי, ותת-תרביות עוקבות בכל שלושה עד ארבעה ימים.

אסוף בעדינות את התאים הצביריים מלוח ה-6 12 באמצעות Resus, על ידי תליה באמצעות פיפט של 10 milliliter. העבר את תאי ה-CD 40 B למבחנה של 50 milliliter. סבב את תאי ה-CD 40 B במשך שבע דקות ב-1200 RPM, המקביל ל-220 5G באופן מלא.

החליפו את המצע במצע שטיפה של CD 40 B וקבעו את מספר התאים של תאי B מופעלים על ידי CD 40. השביו את תאי ה-CD 40 B בריכוז של 1×10⁶ תאים למילליליטר במצע תרבית של CD 40 B.

לאחר מכן, הוסיפו לתליה התאים IL-4 אנושי טרי בריכוז של 50 units/mL ו-cyclosporine A בריכוז של 0.63 µg/mL לצורך גרייה. השתמשו בתאי מאכל (feeder cells) מקרינים שהוכנו יום קודם לכן. כמובן, יש לבדוק שוב את היצמדות תאי המאכל המקרינים תחת המיקרוסקופ מיד לפני השימוש.

אם התאים הדבקים נצמדו, שטפו את תאי המזין (feeder cells) במהירות פעמיים כפי שבוצע קודם: פעם אחת עם PBS ופעם נוספת עם מדיום שטיפה CD 40 B, ולאחר מכן העבירו בזהירות 4 ml של תרחיף CD 40 B שרוכז ל-1×10⁶ תאים למילליטר לכל באער של פלטת 6 באערים. יש לחזור על תהליך הסוב-קלטורה באופן זהה לאחר שלושה עד ארבעה ימים, פעמיים בשבוע, עד לקבלת צבירי תאים של תאי B אנושיים מופעלים ב-CD 40 בדרגת טוהר גבוהה ביום ה-14 של התרבית.

בשלב זה, תאי B מסוג CD 40 מביעים מולקולות קו-סטימולטוריות כגון CD 80, CD 86, CD 83, מולקולות MHC, ומה שנקרא טריאדת ה-homing לקשריות הלימפה הכוללת את CD 62 ligand, CCR seven ו-LFA one, שניתן לבדוק באמצעות זרימה (flow) במהלך הייצור לצורך פתרון בעיות. אנא עיינו בגרסת הטקסט של פרוטוקול זה. אנו מקווים שבעתיד תאי B שהופעלו על ידי CD 40 ישמשו ככלי חשוב לאימונותרפיה של הסרטן.

בהצלחה בניסויים שלכם.