שימוש סרטן הפרסה, Limulus פוליפמוס, מחקר חזון

שלום, אני כריס פאגליה, מנהל מעבדת עיבוד מידע חזותי כאן במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת בוסטון. היי, אני ז'אק ליו, סטודנט לדוקטורט במעבדתו של ד"ר פאגליה. מאמצי המחקר של המעבדה שלנו מופנים להבנת החישוב העצבי המאפשר לבעלי חיים לראות.

במחקר זה, אנו משתמשים באחד היצורים העתיקים ביותר על פני האדמה, סרטן פרס האמריקאי. ייתכן שבעלי חיים אלו הם מאובנים חיים; הם ממשיכים למלא תפקיד חיוני במחקר ביו-רפואי.

לא רק שדמם מכיל תאים מיוחדים שמדענים משתמשים בהם כדי לזהות רעלני חיידקים בתרופותינו, אלא שעיניהם מכילות גם רשת עצבית שסיפקה תובנות רבות לגבי אופן הפעולה של מערכת הראייה שלנו. הבסיס התאי לתהליכים כמו התאמה לאור ועכבה צדית נחשף לראשונה במחקרים של העיניים המורכבות הצדדיות של בעל החיים, ובגין עבודה חלוצית זו, ד"ר Keffer Hartline קיבל את פרס נובל בשנת 1967. סרטן הנעל נותר מודל אטרקטיבי למחקר ראייה מכיוון שהחיה גדולה ועמידה ביחס לבעל חסרי חולרעם, ותאי העצב ברשתית שלהם גדולים ונגישים בקלות.

מערכת הראייה שלה קומפקטית ונחקרה רבות, וההתנהגות החזותית שלה מוגדרת היטב. יתרה מכך, המבנה והתפקוד של העיניים מושפעים על בסיס יומי על ידי שעון צירקדי במוחו של בעל החיים. בקיצור, מערכת הראייה של סרטני הנעל היא פשוטה מספיק כדי להיות מובנת, אך מורכבת מספיק כדי להיות מעניינת.

בסרטון זה נדגים שלוש פרדיגמות ניסוייות לחקירת הבסיס העצבי של הראייה שניתן לבצע in vivo עם מודל בעלי החיים הקלאסי הזה. למחקר ראייה, הן כוללות הקלטת אלקטרו-רטינוגרם, הקלטה של העצב האופטי והקלטה תוך-רשתית. סרטני פרסה נשמרים במיכל מי מלח מאוורר בחדר החשוף למחזור אור-חושך מבוקר.

לפני תחילת כל אחת מטכניקות ההקלטה הללו, קיררו את בעלי החיים בדלי קרח למשך כ-10 דקות ולאחר מכן קיבעו אותם לפלטפורמה מעץ באמצעות הצבת שני ברגי פלדת אל-חלד ב-pro soma ושניים ב-EPIs soma. הפלטפורמה מוכבדת מלמטה בגרניט כדי שתשקע במים. האלקטרו-רטינוגרמה, או ERG, משמשת לניטור רגישות העין לאורך זמן.

הבדיקה מודדת את התגובה החשמלית הגסה של כל התאים בעין. לצורך הבהבוב של האור, הכלים הדרושים להליך זה כוללים מברג, וזלין, תמיסת רינגר, פיפטה, LED, תא הקלטה, ברגי פלדה אל-חלודה ומקלון צמר גפן. אנו משתמשים בתא הקלטה שהוכנה באופן עצמאי כדי למדוד את ה-ERG.

הגוף תוכנן להחזיק מאגר סלין במגע עם העין. העפעף מכיל תיל כסף-כלוריד לחיבור התמיסה המוליכה למגבר וחור קטן בגודל המתאים ל-LED לפני ההצמדה. הצד התחתון של התא מצופה בוואסלין.

לאחר מכן, התאים הוחזקו מעל העין של סרטן פרסה באמצעות שני ברגים, מולאו בתמיסת סלין ונסגרו במכסה. בעל החיים ממוקם בכלוב אטום לאור במיכל מלא במי ים מעל הזימים. כבל ה-LED מוכנס למכסה התא.

חוט האות מהודק לחוט התא וחוט הייחוס לאחד הברגים שהושתלו, ושני החוטים מחוברים לשלב הראש (head stage) של מגבר דיפרנציאלי בעל עכבה גבוהה להגברת האות וסינון רעשים. לאחר מכן סוגרים את הכלוב כדי למנוע מאור החדר להגיע אל בעל החיים. שלב ה-AD מחובר למגבר, ומסנני המגבר מכוונים להעביר תדרים הנמוכים מכ-10 hertz.

משם, האות עולה לאוסצילוסקופ לצורך תצוגה ולכרטיס רכישת נתונים לצורך ניתוח ואחסון במחשב. אנו משתמשים בתוכנה בהתאמה אישית שנכתבה ב-LabVIEW כדי לספק גירויי אור מה-LED ולהקליט את אות ה-ERG. ה-LED מופעל באמצעות פולס של 100 millisecond במתח של five vols בכל 10 דקות. מצד שמאל מוצגת צורת הגל של ה-ERG עבור כל הבזק אור, ומצד ימין משרטטים את האמפליטודה שיאה-אל-שיאה של צורמות גל של הבזקים עוקבים, לצורך מעקב אחר שינויים ברגישות העין לאורך זמן.

באמצעות הקלטות ERG, ניתן לחקור את ההשפעות של הסתגלות לאור ומודולציה עצבית צירקדית. העין מעבירה מסרים חזותיים למוח ואת תגובות הפולסים (spike responses) של סיבי העצב האופטי שלה. ניתן לחקור את המסרים המקודדים על ידי הקלטה חוץ-תאית מסיבי עצב בודדים.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לבחון מסרים של השעון הביולוגי המועברים חזרה לעין. הכלים הדרושים להליך זה כוללים מברג, תמיסת רסרין (Ringer solution), פינצטות, מספריים, תא הקלטה, פינצטות קמורות, מחט בדיקה דקה, סקלפל קהה, מספריים כירורגיים ואלקטרודה סקציונלית. תאי ההקלטה תוכננו עם לשונית המותאמת לעצב; ניתן לנקז 20 מיליליטר של דם מהסוס על ידי החדרת מחט במידה 16 בין שרירי הציר אל לבו.

ריקון דם אינו הכרחי, אך הוא מקל על ניתוח עצב הראייה כאשר בעל החיים מקובע לפלטפורמה. מיקום עצב הראייה מוערך על ידי שרטוט קו מעוקל מעט על ה-carpus בין העיניים הלטרלית והמדיאלית. לאחר מכן, קדוח חור עגול ב-carpus באמצעות רפין.

קוטר החור זהה לקוטר תחתית התא. מרכז החור ממוקם כמעט שני סנטימטרים קדמית לעין הלטראלית ומעט דורסלית לקו, כך שהעצב רץ לאורך החלק הוונטרלי של התא; רקמה חיבורית המכסה את האזור מוסרת עד שניתן לראות את העצב במלוא אורכו, והעצב החשוף משוחרר מהרקמות שמסביבו וממטהו. חוט נכרך סביב העצב ונמשך אל תוך התא דרך הפתח החציוגאלי בתחתית.

דרך פתח זה, מוביל בעדינות את העצב אל תוך התא באמצעות משיכה בחוט. בעת כניסת העצב לתא, דוחפים את תחתית התא לתוך החור כדי למזער את המתיחה של העצב. לאחר מכן, מקבעים את התא באמצעות שני ברגים וממלאים אותו בתמיסת ringer.

לאחר חיבור התא, מניחים את בעל החיים בכלוב קשירה קל במיכל מלא במי ים מעל הזימים. פנים התא נבחן תחת סטריאוסקופ וצמר גפן מונח סביב פתח התחתית כדי למנוע דליפה של דם אל תוך התא ודליפת תמיסת רינגר מחוצה לו. התא ממולא מחדש בתמיסת רינגר טרייה.

רקמה שאריתית מוסרת באמצעות פינצטות ומספריס עדינים. חתך קטן מבוצע במעטפת העוטפת את העצב, והעצב מופרד מהמעטפת באמצעות מחט חקירה עדינה. המעטפת מוסרת בהדרגה על ידי חיתוך לאורך העצב.

בשלב זה מפרידים צרור סיבים קטן מהעצב באמצעות הגשושית וחותכים אותו בקצה הרחוק ביותר מהעין עבור הקלטת סיבים אפרנטיים ובקצה הקרוב ביותר לעין. עבור הקלטת סיבים אפרנטיים, אנו משתמשים באלקטרודת חתך של מערכת AM הממולאת בתמיסת Springer להקלטה, המחוברת באמצעות צינורית למזרק גילמן ליניקה. קצה האלקטרודה נוצר על ידי ליטוש באש של קצה קפילרית זכוכית בורוסיליקט בקוטר של 1 מילימטר. חיבור B ו-C מספק את מוליך האות, ומוליך הייחוס הוא חוט כסף-כלוריד הכרוך סביב האלקטרודה להפחתת רעשים.

קצה האלקטרודה ממוקם בתוך תא ההקלטה, וקצהו החתוך של צרור העצבים נשאב אל תוך קצה הזכוכית באמצעות יניקה. מובילי האות והייחוס מחוברים לשלב הראש (head stage) של מגבר דיפרנציאלי לצורך הגברת האות וסינון רעשים. פלט המגבר מועבר לאוסילוסקופ לצפייה ולכרטיס רכישת נתונים לצורך ניתוח ואחסון במחשב.

אנו משתמשים בתוכנה בהזמנה מיוחדת שנכתבה ב-LabVIEW לשליטה בגירויי אור, ובמבדיל ספייקים (spike discriminator) דיגיטלי להקלטת רצפי ספייקים. צינור אור מסיב אופטי משמש להארה של תא בודד, בעוד שתצוגת וידאו נשלטת במחשב משמשת לגירוי תבניתי; בהקלטות של העצב האופטי, ניתן לחקור את העברת האותות בין העיניים למוח באופן תוך-רשתיתי. ההקלטה כוללת החדרת מיקרו-אלקטרודה ישירות לתוך תאים בעין והקלטה של תנודות המתח התוך-תאיים המושרות על ידי אור.

הכלים הדרושים להליך זה כוללים מברגה, פלטפורמה שקופה בצורת L. חורי הברגה למסך מיקרו-אלקטרודה מעל האלקטרודה מזכוכית, ברגי פלדת אל חלד, פינצטה וסכיר דק. לאחר קיבוע הסרטן, פלטפורמה מעץ, פלטה שקופה עם חורי ברגה קבועים מראש, מחוברת לקרפוס (carpus) באמצעות שני ברגים בצד ואחד בחלק העליון.

את החיה מניחים בכלוב אטום לאור בתוך מיכל מלא במי עיגול מעל הזימים. מיקומית מיקרו-ממוטרת מקובעת ללהב באמצעות ברגים, וזרוע המיקומית מיושרת מעל העין. קבוצה של מיקרו-פיפטות זכוכית נמשכות מקוטר חיצוני של 1 mm של זכוכית סיליקאט, והקצוות ממולאים שוב באמצעות פעולת נימיות.

על ידי הנחת הפ pipette-ים בבקבוקון המכיל תמיסת פוטסיום כלוריד בריכוז של שלושה מולארי למשך מספר דקות, ממלאים ידנית את שאר ה-pipette בתמיסת המלח ומכניסים אותה למחזיק מיקרו-אלקטרודות שמולא מראש בתמיסה כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, מחדירים את מחזיק האלקטרודה לשלב הראש (head stage) של מגבר תו-תאי המחובר למיקרו-מניע (micro positioner). חלק מהרשתית נחשף על ידי חיתוך זהיר של שטח ריבוע קטן מהקרנית הגבית (dorsal cornea).

בעזרת הסקלפל, טיפה של Ringer Solution מונחת על הרקמה החשופה כדי למנוע התייבשות, והמיקרו-פיפט מוקדם לעבר הרשתית. כאשר קצה הפיפט נוגע בתמיסה, מצב ההזרקה הנוכחי של המגבר התוך-תאי מופעל ועכבת האלקטרודה נמדדת; מיקרו-פיפטים עם עכבות מחוץ לטווח של 20 עד 70 mega ohms נפסלים. אלו הנמצאים בטווח זה מוקדמים לרשתית בצעדים בגודל מיקרוני ומוחדרים לתאים באמצעות רטט אלקטרוני של הקצה; גירויים של אור מועברים כדי להחדיר לתאים באמצעות סיב אופטי או תצוגת וידאו.

ניתן למצוא שלושה סוגי תאים בעין של סרטן פרס, תאי-oular, תאים אקסצנטריים ותאי פיגמנט; תאי-oular מגיבים באמצעות תגובה דה-פולריזצית חזקה לאור, תאים אקסצנטריים מראים רצף של פוטנציאלי פעולה הנרכבים על תגובה דה-פולריזצית, ותאי פיגמנט אינם מראים תגובה לאור כלל. התגובה נצפית באוסצילוסקופ ונרשמת למחשב באמצעות הקלטות תוך-רשתיות. באופן זה ניתן לחקור את הבסיס התאי של הראייה.

לסיכום, הדגמנו כיצד לבצע רישומי אלקטרו-רטינוגרם, רישומי עצב אופטי ורישומים תוך-רשתיים בסרטני נעל בחיים (in vivo). שיטות אלו נמצאות בשימוש נרחב ומספקות תובנות ייחודיות לגבי המכניזמים העצביים של עיבוד מידע חזותי בסרטני נעל. הן לא רק פשוטות ליישום במעבדה למחקר, אלא יכולות להטמע בצורה קלה במעבדה להוראה בנושאי נוירופיזיולוגיה של הראייה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.