Name: שימוש סרטן הפרסה, Limulus פוליפמוס, מחקר חזון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: חקור טכניקות אלקטרופיזיולוגיות לחקר בסיס עצבי של הראייה בסרטן הפרסה Limulus polyphemus. השיטות כוללות רישום אלקטרורטינוגרם, רישום עצב הראייה ורישום תוך-רשתית לניתוח פעילות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר בירגיט ד&quot;ר ורנר על עזרתה בהפקת עם המאמר הזה וידאו. מחקר זה מומן על ידי פרס קריירה NSF.

חלק 1: הכנת ניסויית הפרוצדורות שבוצעו על סרטני הפרסה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש באוניברסיטת בוסטון. בעלי חיים שנקנו מעבדות לביולוגיה ימית (וודס הול, מסצ&#39;וסטס) או ספק אחר ושוכנו טנק מים מלוחים סודה בחדר חשוף מחזור אור כהה מוסדר. משטר תאורה חשוב entraining שעון היממה של סרטן ורכיבה על אופניים העין יומי בין מדינות יום ולילה שלה. מיד לפני תחילת כל הליכים פולשניים, החיה הוא מקורר בדלי קרח במשך 10-15 דקות, עד תנועה שלה היא האטה מאובטח אז אל במת עץ עם שני ברגים נירוסטה הוכנס prosoma ושניים opisthosoma. הפלטפורמה היא משוקלל מתחת עם גרניט, כך שוקע במים. לאחר ניסויים בבעלי חיים הוא מסוף מורדמים ידי טבילה לתוך slurry קרח שוב pithing המוח, הנמצאת מעל הפה, באמצעות אזמל מנתחים. חלק 2: פתרונות פתרון Limulus רינגר מורכב 430 mM NaCl, 9.56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9.97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, HEPES 50μM, ו 10 מ&quot;ל / L עט סטרפטוקוקוס לערבב (פניצילין, סטרפטומיצין, 10,000 יחידות / מ&quot;ל) . חלק 3: הקלטה Electroretinogram כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, וזלין, הפתרון של רינגר, פיפטה העברה, הנורית הירוקה, חדר הקלטה, ברגים נירוסטה, ו ספוגית כותנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא בעבודת יד משמש כדי להקליט את ERG (איור 1A). גוף תא נועד להחזיק מאגר מלוחים במגע עם העין. המכסה מכיל חוט כסף כלורי עבור צימוד הפתרון מוליך למגבר ואת חור קטן בגודל כדי להתאים LED. Ultrabright LED עם פליטת שיא סביב 520nm עובד הכי טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, החלק התחתון של החדר מצופה וזלין ומאובטחת על העין עם שני ברגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר מתמלא אז עם מליחים כתרים עם המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקשרות לתא סרטן ממוקם בכלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבל ה-LED מוכנס לתוך המכסה קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוביל אות הוא מוצמד חוט כלוריד, ואת להוביל התייחסות נחתך לאחד הברגים המושתלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוביל הן מחוברות לבמה ראש מגבר גבוהה עכבה ההפרש (X-cell 3x4, fhc Inc) עבור הגברה האות המסנן מגבר מוגדר להעביר תדרים 10Hz להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלט מגבר מוזן על אוסצילוסקופ לצפייה ללוח נתונים הרכישה לניתוח המחשב ואחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקנה דלת הכלוב סגורה כדי לחסום אור בחדר מלהגיע בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית גלי ה-LED, הרשומות עורר ERG האות, מודדת את המשרעת שיא אל שיא התגובה. הבחירה הפרדיגמה פלאש תלוי אובייקטיבי הניסוי. כך, למשל, להחיל קצרה (100ms) הדופק של 5V כל 10 דקות אל LED ימנע תופעות של הסתגלות אור כאשר ניטור שינויים היממה ברגישות העין. </li></ol> חלק 4: הקלטה עצב הראייה כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, חוט, מקדחה, הפתרון של רינגר, rongeurs, מספריים vannas, חדר הקלטה, מלקחיים מעוקל, בדיקות מחט בסדר, עמום אזמל, מספריים כירורגיות, ו אלקטרודה יניקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא בעבודת יד משמש שיא התגובות עצב הראייה (איור 1B). פנים החדר הוא 2cm בקוטר היטב כי יש לפתוח פתח דק מחוררת חצי עגול בקיר התחתון כדי להכיל את העצב ולבודד אותו לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההתקשרות קאמרית מחט 16-מד מוכנס בין השרירים הציר לתוך הלב ~ 20cc של דם מנוקז מן החיה. Exsanguination לא הכרחי אבל עושה דיסקציה עצב הראייה קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקום של עצב הראייה נאמדת על ידי ציור על שריון קו מעוקל מעט בין העיניים לרוחב חציון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור עגול הוא חתך אז שריון עם מקדחה. החור הוא בקוטר זהה החדר היטב. המרכז של החור ממוקם 2-3 ס&quot;מ הקדמי לעין לרוחב הגב מעט לקו, כך עצב העובר לאורך החלק הגחוני של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת חיבור מנוקה עד עצב גלוי לגמרי וללא שמסביב הבסיסית רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדיל של חוט הוא כרך סביב העצב ומשך החדרה דרך חריץ בתחתית. דרך פתח זה אותו עצב מונחה בעדינות על ידי משיכת החוט אל תוך החדר. במקביל החדר היטב מוכנס לתוך החור. החדר היא מודבקת אז שריוןעם ברגים היטב מתמלא הפתרון של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקשרות לתא החי ממוקמת בתוך כלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם היא דמיינו תחת stereoscope (SMZ-168, ג&#39;ד פלה Inc) וכותנה הוא מרופד סביב פתח בתחתית כדי למנוע דליפה של דם לתוך מלוחים מתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת חיבור שיורית סביב העצב יוסר עם מספריים פינצטה בסדר, הוא מילא את החדר עם פתרון Ringer של טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינוי מורכב מכלי הדם כי מתמצת את העצבים דרך הפתח הזה העצב הוא desheathed בקפידה לאורכו בעזרת מספריים בסדר, פינצטה, ועל בדיקות מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרור סיבים זעירים מופרד מן העצב באמצעות בדיקה לחתוך בקצה הרחוק מן העין הקלטה סיב מביא ובסוף הקרוב לעין הקלטה סיבים efferent. בסרטון בסוף להקלטות סיב מביא נחתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה מיקרו (AM Systems Inc) מלא פתרון האצבעות משמש להקלטת עצב הראייה. קצה האלקטרודה הוא מצויד צרור העצבים מאש ליטוש סוף זכוכית בקוטר 1mm בורוסיליקט נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה האלקטרודה יורדת לתוך תא היטב עם מניפולטור ידני (WPI Inc), ואת חבילת סיבי לחתוך הוא נשאב לתוך קצה. יניקה מסופק על ידי מזרק Gilmont מחובר האלקטרודה דרך צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור BNC מספק את האות להוביל כלוריד כסף תיל סביב אלקטרודה כדי להפחית את הרעש מספק להוביל התייחסות. שני מוביל מחוברים שלב ראש מגבר ההפרש עבור הגברה אות ורעש סינון (X-cell 3x4, fhc Inc). הפלט מגבר נשלח אוסצילוסקופ לצפייה כרטיס רכישת נתונים לניתוח המחשב ואחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית שולטת גירויים אור דרך מעבד וידאו דיגיטלי (Bits + +, קיימברידג&#39; למחקר Systems Inc) וממשקים עם ספייק דיגיטלי מאבחן (APM, fhc Inc) כי רשומות רכבות ספייק. אור יכול להיות מועברת על תאים בודדים בעין באמצעות צינור אור בסיבים אופטיים או לעין כל דרך להציג מבוקרת מחשב וידאו. </li></ol> חלק 5: הקלטה Intraretinal כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, בצורת פלטפורמה פייברגלס עם חורי הברגים הליכי, בעל microelectrode עם פיפטה זכוכית, ברגים נירוסטה, פינצטה, ו אזמל בסדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת עבודת יד פייברגלס עם חורי הברגים מראש משמש שיא התגובות תאיים. החורים הם במרווחים עבור הרכבה micromanipulator ממונע (PPM5000, Inc WPI). הצלחת מחוברת החיה עם שני ברגים בצד אחד על גבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחת קובץ מצורף החיה ממוקם בכלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropositioner הוא מוברג לתוך הצלחת, עם זרוע מטלטלין שלה מיושר מעל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אצווה של micropipettes זכוכית נמשכים מ -1 מ&quot;מ OD בורוסיליקט זכוכית את הטיפים הם backfilled דרך פעולה נימי ידי הנחת micropipettes בבקבוקון קטן של פתרון KCl 3M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר pipettes מתמלאים באופן ידני את הפתרון מלח ונוסף בעל אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעל אלקטרודה מחוברת בשלב ראש מגבר תאיים (IR-283, Cygnus טכנולוגיה Inc) מודבקת הזרוע micropositioner. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע קטן של הרשתית (~ 1mm2) נחשף על ידי חיתוך משם את ממשק הקרנית עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של הפתרון של רינגר מושם על הרשתית חשוף כדי למנוע ייבוש קצה micropipette מתקדמת דרך הפתח לתוך רקמת הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קצה נכנס הפתרון, במצב הנוכחי הזרקה של המגבר תאיים עוסקת ואת עכבה אלקטרודה נמדד. Micropipettes עם עכבה מחוץ לטווח של 20-70 מגוואט מבוטלים. אלה בטווח זה הם מתקדמים בצעדים מיקרון משופדת לתוך התאים על ידי רוטט קצה פיפטה אלקטרונית או מכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה סוגים של תאים עשויים להיות נתקל בעיניים. תאים Retinular להציג רק תגובה depolarizing לאור, תאים אקסצנטרי להראות רכבת של פוטנציאל פעולה רכיבה על תגובה depolarizing, ותאי הפיגמנט להראות אין תגובה אור בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית שולטת גירויים אור דרך מעבד וידאו דיגיטלי (Bits + +, קיימברידג&#39; מערכות מחקר). הגירויים מועברים לתאי משופדת עם צינור סיב אופטי או להציג וידאו. התגובות מתח הם נצפו על אוסצילוסקופ ואת דיגיטציה על ידי התוכנית למחשב. </li></ol> חלק 6: תוצאות נציג ERG נציג מוצג בתרשים 2A. הגל מייצג את החשמל סיכםבתגובה לאור בעיקר בתאי retinular photoreceptive, כפי שהם עולים במספרם בהרבה על התאים אקסצנטרית הם מצמידים חשמלית להם. אין רכיבים waveform מרובים סוגי תאים שונים ברשתית כמו עם ERG יונקים. משוב מן היממה שעון במוח Limulus מודולציה את המאפיינים הפיזיולוגיים של תאים ברשתית על בסיס יומי, גורם כמובן משרעת וזמן של ERG להשתנות לאורך זמן (1). כפי שניתן לראות בתרשים 2B, ERG המשרעת היא הגבוהה ביותר במהלך הלילה הסובייקטיבית של בעלי החיים הנמוכה ביותר במהלך היום סובייקטיבי. עקבות נציג תגובה עצב יחיד סיבים אופטיים לאור מוצג באיור 3. תאים אקסצנטרי כל להתנהג בערך אותו הדבר, מראה עלייה חולף בשיעור הפרשות ספייק ואחריו דעיכה לרמה מתמשכת. קצב הדעיכה משקפת את הפעולה המשולבת של הסתגלות אור ספייק תלויי עצמית עיכוב על תאים אקסצנטרי (2). אחר דפוסי ספייק, כגון אור תלויי יורדת בשיעור, נתפסים במוח Limulus אך לא את העין (3). עקבות נציג התגובה מתח של תא תא פיגמנט, תא retinular ו אקסצנטרי לאור מוצגים באיור 4. רק שני האחרונים סוגי תאים ברשתית הם חזותיים. הקורס משרעת וזמן התגובה שלהם תלוי באיכות ההקלטה ואת מיקום האלקטרודה בתוך התא. בדרך כלל, האלקטרודה חודר לתאי פיגמנט או תאים retinular בגלל גודל גדול שלהם מספר. אם זה האחרון, שלילת קוטביות חולף כי דועך לרמה מתמשכת מוקלט. עששת היא בשל הסתגלות לאור על ידי תאים retinular (2). אם האלקטרודה נכנס לתא אקסצנטרי, פוטנציאל פעולה גדול נרשמים האקסון (40-70mV) פוטנציאל פעולה קטן רוכב על הגל depolarizing (&lt;25mV) ליד סומה. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="דמות 1" /> באיור 1. דיאגרמות סכמטי של תאים המשמשים הקלטה electroretinogram (א) ו הקלטה עצב הראייה (B). בר שווה 7mm ב A ו B. ב 5mm <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2. עקבות דוגמה ERG Limulus שעורר 100ms LED הדופק של 5V בחושך (א) ואת תנודות שיא אל שיא ERG אמפליטודה לאורך זמן בחשכה מתמדת (B). החושך היה יזם בזמן המצוין על ידי המשולש הלבן. הגידול ERG משרעת בזמן המצוין על ידי המשולש השחור בשל הסתגלות אור, אשר מגדילה את רגישות העין בחושך. וריאציה מחזוריים ERG משרעת לאחר מכן בשל השעון הביולוגי הפנימי של בעלי חיים. נקודות זמן ב &#39;הם כל 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="דמות 3" /> איור 3. עקבות דוגמה תגובה עצב סיב אופטי אל האור הבזיק על הקולטן ommatidial יחיד. Waveform מעל זכר מראה עיתוי הגירוי. תאים אקסצנטרי, אשר אקסונים להצמיח סיבי עצב, כל להראות דפוס דומה של ירי כמו זה בתנאי תאורה של הניסוי (5sec פלאש בחשיכה מוחלטת). קידוד רשתית עם קוצים הוא Limulus יש רכוש משותף עם יונקים, בניגוד חסרי חוליות אחרים. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="דמות 4" /> איור 4 עקבות דוגמה התגובה מתח לאור של שלושה סוגי תאים הנמצאים בעין לרוחב Limulus:. תא פיגמנט (A), תא retinular (ב), ותא אקסצנטרי (C). התא הראשון הוא אי - ראייה. שני האחרונים depolarize על הבזק אור. שלילת קוטביות היא הגדולה ביותר עבור תאים retinular כי הם transduce את האור לשלוח את האות דרך צמתים הפער לתא אקסצנטרי, עם הפסד כלשהו לאורך הדרך. בתא אקסצנטרי, פוטנציאל פעולה שנורו על ידי האקסון נראים רכיבה על שלילת קוטביות עקב backpropagation ספייק לתוך סומה. משרעת של פוטנציאל פעולה כבר נחלש באיור עבור צפייה טובה יותר של הפוטנציאל depolarizing. פוטנציאל המנוחה של התאים הוא-50mV.

<ol><li>Barlow, R. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li>
<li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li>
<li>Snodderly, D. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li>
<li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+a+neural+code+for+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li>
<li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limulus+lateral+eye%3A+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li>
<li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li>
</ol>

יש לנו להדגים כיצד לבצע הקלטות ERG, הקלטות עצב הראייה, והקלטות intraretinal על סרטני הפרסה in vivo. טכניקות הקלטה כל לספק תובנות שונות לתוך הבסיס העצבי של חזון, והם יכולים לשמש כדי לחקור פונקציה הרשתית הודות בבעלי חיים כדי עיניים גדולות של סרטן ו שריון קשה. פעילות עצב הראייה יכול אפילו להיות מוקלט מ מתנהגת בחופשיות בעלי חיים בים עם בנייה נכונה של אלקטרודות (4). טכניקות אלה יכולים גם להתבצע על העיניים נכרת עם שינויים קלים של ההתקנה. הרלוונטיות של ניסויים כאלה למצבו הטבעי יהיה מוגבל...

<table><tbody><tr><td>דיודה פולטת אור (LED)</td><td>מקור אור</td><td>Newark Inc</td><td>33C1292</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודת יניקה</td><td>אלקטרודה</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>מגבר חוץ-תאי בעל 3*4 ערוצים מדגם XCell</td><td>מגבר</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-40-8B</td><td></td></tr><tr><td>הקלטה תוך-תאית</td><td>מגבר</td><td>Cygnus</td><td>IR-283A</td><td></td></tr><tr><td>APM</td><td>מבדיל ספייקים עצביים</td><td>FHC, Inc.</td><td>APM</td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>לוח סרטונים</td><td>Cambridge Research Systems</td><td>Bits++</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור Piezopatch</td><td>מיקרו-ממצב (Micropositioner)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PPM5000</td><td></td></tr><tr><td>ממריץ פולסים מרובעים</td><td>ממריץ עצבים</td><td>טכנולוגיות דגלים</td><td>דגם S48</td><td></td></tr><tr><td>P-97</td><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>דגם P-97</td><td></td></tr><tr><td>קפילרית זכוכית בורוסיליקטית</td><td>זכוכית אלקטרודה</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>סוסים&amp;#8211; סרטן (&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית*

*(הערה: המונח "em" הוא קיצור מקובל ל-Electron Microscopy)*&gt;*Limulus polyphemus*&lt;/em&gt;)</td><td>בעל חיים</td><td>מעבדות ביולוגיה ימיות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות</td><td>מכשיר למשיכת זכוכית</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי עם זום</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Jed Pella Inc.</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש סרטן הפרסה, limulus פוליפמוס, מחקר חזון

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

סרטן פרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס הוא אחד היצורים העתיקים ביותר על פני האדמה, החיה ממשיכה לשחק תפקיד חיוני במחקר ביו. לא רק דמם מכיל תאים מיוחדים המדענים להשתמש כדי לזהות bacteriotoxins בתרופות שלנו, אבל העיניים שלהם מכילים גם רשת עצבית כי סיפקה תובנה הרבה על תהליכים פיזיולוגיים הפועלים מערכת הראייה שלנו, כגון הסתגלות קלה עיכוב לרוחב. סרטן פרסה נשאר מודל אטרקטיבי מחקר חזון כי בעל החיים הוא גדול hardy עבור חסרי חוליות, הנוירונים ברשתית שלה גדולים ונגישים, מערכת הראייה שלה הוא קומפקטי למד בהרחבה, התנהגות החזותי שלה מוגדר היטב. יתר על כן, המבנה והתפקוד של העיניים מווסתת על בסיס יומי על ידי השעון הביולוגי במוח של בעלי חיים. בקיצור, מערכת הראייה של סרטני פרסה היא פשוטה מספיק כדי להבין זאת מורכבת מספיק כדי להיות מעניין. בסרט זה אנו מציגים three פרדיגמות אלקטרו עבור חוקרת את הבסיס העצבי של חזון זה ניתן לבצע in vivo עם Limulus. הם electroretinogram הקלטה, הקלטה עצב הראייה, הקלטה intraretinal. Electroretinogram (ERG) הקלטות למדוד עם משטח אלקטרודה חשמלית סיכם את התגובה של כל התאים בעין אל בהבזק אור. הם יכולים לשמש כדי לפקח על הרגישות הכוללת של העין עבור להאריך את פרקי הזמן. הקלטות עצב הראייה למדוד את פעילות spiking של סיבי עצב בודד באמצעות אלקטרודה מיקרו תאית. הם יכולים לשמש ללמוד העביר מסרים חזותיים מן העין אל המוח, כמו גם היממה לשעון הודעות מוזן חזרה מהמוח אל העין. למדוד הקלטות Intraretinal עם microelectrode תאיים תנודות המתח המושרה על ידי אור תאים בודדים של העין. הם יכולים לשמש להבהיר מנגנוני הסלולר של עיבוד ברשתית.

בסרט זה אנו מבצעים הקלטה electroretinogram, הקלטה עצב הראייה, הקלטה intraretinal עם הסרטן האמריקנית פרסה,<em&gt; Limulus פוליפמוס</em&gt;. פרדיגמות אלו אלקטרו יכול לשמש חוקר את הבסיס העצבי של חזון במחקר מעבדה או הוראה.

שימוש סרטן הפרסה, Limulus פוליפמוס, מחקר חזון

סרטן הפרסה האמריקאי, *Limulus polyphemus*, הוא אחד היצורים העתיקים ביותר על פני כדור הארץ, והחיה ממשיכה למלא תפקיד חיוני ב...

שלום, אני כריס פאגליה, מנהל מעבדת עיבוד מידע חזותי כאן במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת בוסטון. היי, אני ז'אק ליו, סטודנט לדוקטורט במעבדתו של ד"ר פאגליה. מאמצי המחקר של המעבדה שלנו מופנים להבנת החישוב העצבי המאפשר לבעלי חיים לראות.במחקר זה, אנו משתמשים באחד היצורים העתיקים ביותר על פני האדמה, סרטן פרס האמריקאי. ייתכן שבעלי חיים אלו הם מאובנים חיים; הם ממשיכים למלא תפקיד חיוני במחקר ביו-רפואי.לא רק שדמם מכיל תאים מיוחדים שמדענים משתמשים בהם כדי לזהות רעלני חיידקים בתרופותינו, אלא שעיניהם מכילות גם רשת עצבית שסיפקה תובנות רבות לגבי אופן הפעולה של מערכת הראייה שלנו. הבסיס התאי לתהליכים כמו התאמה לאור ועכבה צדית נחשף לראשונה במחקרים של העיניים המורכבות הצדדיות של בעל החיים, ובגין עבודה חלוצית זו, ד"ר Keffer Hartline קיבל את פרס נובל בשנת 1967. סרטן הנעל נותר מודל אטרקטיבי למחקר ראייה מכיוון שהחיה גדולה ועמידה ביחס לבעל חסרי חולרעם, ותאי העצב ברשתית שלהם גדולים ונגישים בקלות.מערכת הראייה שלה קומפקטית ונחקרה רבות, וההתנהגות החזותית שלה מוגדרת היטב. יתרה מכך, המבנה והתפקוד של העיניים מושפעים על בסיס יומי על ידי שעון צירקדי במוחו של בעל החיים. בקיצור, מערכת הראייה של סרטני הנעל היא פשוטה מספיק כדי להיות מובנת, אך מורכבת מספיק כדי להיות מעניינת.בסרטון זה נדגים שלוש פרדיגמות ניסוייות לחקירת הבסיס העצבי של הראייה שניתן לבצע in vivo עם מודל בעלי החיים הקלאסי הזה. למחקר ראייה, הן כוללות הקלטת אלקטרו-רטינוגרם, הקלטה של העצב האופטי והקלטה תוך-רשתית. סרטני פרסה נשמרים במיכל מי מלח מאוורר בחדר החשוף למחזור אור-חושך מבוקר.לפני תחילת כל אחת מטכניקות ההקלטה הללו, קיררו את בעלי החיים בדלי קרח למשך כ-10 דקות ולאחר מכן קיבעו אותם לפלטפורמה מעץ באמצעות הצבת שני ברגי פלדת אל-חלד ב-pro soma ושניים ב-EPIs soma. הפלטפורמה מוכבדת מלמטה בגרניט כדי שתשקע במים. האלקטרו-רטינוגרמה, או ERG, משמשת לניטור רגישות העין לאורך זמן.הבדיקה מודדת את התגובה החשמלית הגסה של כל התאים בעין. לצורך הבהבוב של האור, הכלים הדרושים להליך זה כוללים מברג, וזלין, תמיסת רינגר, פיפטה, LED, תא הקלטה, ברגי פלדה אל-חלודה ומקלון צמר גפן. אנו משתמשים בתא הקלטה שהוכנה באופן עצמאי כדי למדוד את ה-ERG.הגוף תוכנן להחזיק מאגר סלין במגע עם העין. העפעף מכיל תיל כסף-כלוריד לחיבור התמיסה המוליכה למגבר וחור קטן בגודל המתאים ל-LED לפני ההצמדה. הצד התחתון של התא מצופה בוואסלין.לאחר מכן, התאים הוחזקו מעל העין של סרטן פרסה באמצעות שני ברגים, מולאו בתמיסת סלין ונסגרו במכסה. בעל החיים ממוקם בכלוב אטום לאור במיכל מלא במי ים מעל הזימים. כבל ה-LED מוכנס למכסה התא.חוט האות מהודק לחוט התא וחוט הייחוס לאחד הברגים שהושתלו, ושני החוטים מחוברים לשלב הראש (head stage) של מגבר דיפרנציאלי בעל עכבה גבוהה להגברת האות וסינון רעשים. לאחר מכן סוגרים את הכלוב כדי למנוע מאור החדר להגיע אל בעל החיים. שלב ה-AD מחובר למגבר, ומסנני המגבר מכוונים להעביר תדרים הנמוכים מכ-10 hertz.משם, האות עולה לאוסצילוסקופ לצורך תצוגה ולכרטיס רכישת נתונים לצורך ניתוח ואחסון במחשב. אנו משתמשים בתוכנה בהתאמה אישית שנכתבה ב-LabVIEW כדי לספק גירויי אור מה-LED ולהקליט את אות ה-ERG. ה-LED מופעל באמצעות פולס של 100 millisecond במתח של five vols בכל 10 דקות. מצד שמאל מוצגת צורת הגל של ה-ERG עבור כל הבזק אור, ומצד ימין משרטטים את האמפליטודה שיאה-אל-שיאה של צורמות גל של הבזקים עוקבים, לצורך מעקב אחר שינויים ברגישות העין לאורך זמן.באמצעות הקלטות ERG, ניתן לחקור את ההשפעות של הסתגלות לאור ומודולציה עצבית צירקדית. העין מעבירה מסרים חזותיים למוח ואת תגובות הפולסים (spike responses) של סיבי העצב האופטי שלה. ניתן לחקור את המסרים המקודדים על ידי הקלטה חוץ-תאית מסיבי עצב בודדים.ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לבחון מסרים של השעון הביולוגי המועברים חזרה לעין. הכלים הדרושים להליך זה כוללים מברג, תמיסת רסרין (Ringer solution), פינצטות, מספריים, תא הקלטה, פינצטות קמורות, מחט בדיקה דקה, סקלפל קהה, מספריים כירורגיים ואלקטרודה סקציונלית. תאי ההקלטה תוכננו עם לשונית המותאמת לעצב; ניתן לנקז 20 מיליליטר של דם מהסוס על ידי החדרת מחט במידה 16 בין שרירי הציר אל לבו.ריקון דם אינו הכרחי, אך הוא מקל על ניתוח עצב הראייה כאשר בעל החיים מקובע לפלטפורמה. מיקום עצב הראייה מוערך על ידי שרטוט קו מעוקל מעט על ה-carpus בין העיניים הלטרלית והמדיאלית. לאחר מכן, קדוח חור עגול ב-carpus באמצעות רפין.קוטר החור זהה לקוטר תחתית התא. מרכז החור ממוקם כמעט שני סנטימטרים קדמית לעין הלטראלית ומעט דורסלית לקו, כך שהעצב רץ לאורך החלק הוונטרלי של התא; רקמה חיבורית המכסה את האזור מוסרת עד שניתן לראות את העצב במלוא אורכו, והעצב החשוף משוחרר מהרקמות שמסביבו וממטהו. חוט נכרך סביב העצב ונמשך אל תוך התא דרך הפתח החציוגאלי בתחתית.דרך פתח זה, מוביל בעדינות את העצב אל תוך התא באמצעות משיכה בחוט. בעת כניסת העצב לתא, דוחפים את תחתית התא לתוך החור כדי למזער את המתיחה של העצב. לאחר מכן, מקבעים את התא באמצעות שני ברגים וממלאים אותו בתמיסת ringer.לאחר חיבור התא, מניחים את בעל החיים בכלוב קשירה קל במיכל מלא במי ים מעל הזימים. פנים התא נבחן תחת סטריאוסקופ וצמר גפן מונח סביב פתח התחתית כדי למנוע דליפה של דם אל תוך התא ודליפת תמיסת רינגר מחוצה לו. התא ממולא מחדש בתמיסת רינגר טרייה.רקמה שאריתית מוסרת באמצעות פינצטות ומספריס עדינים. חתך קטן מבוצע במעטפת העוטפת את העצב, והעצב מופרד מהמעטפת באמצעות מחט חקירה עדינה. המעטפת מוסרת בהדרגה על ידי חיתוך לאורך העצב.בשלב זה מפרידים צרור סיבים קטן מהעצב באמצעות הגשושית וחותכים אותו בקצה הרחוק ביותר מהעין עבור הקלטת סיבים אפרנטיים ובקצה הקרוב ביותר לעין. עבור הקלטת סיבים אפרנטיים, אנו משתמשים באלקטרודת חתך של מערכת AM הממולאת בתמיסת Springer להקלטה, המחוברת באמצעות צינורית למזרק גילמן ליניקה. קצה האלקטרודה נוצר על ידי ליטוש באש של קצה קפילרית זכוכית בורוסיליקט בקוטר של 1 מילימטר. חיבור B ו-C מספק את מוליך האות, ומוליך הייחוס הוא חוט כסף-כלוריד הכרוך סביב האלקטרודה להפחתת רעשים.קצה האלקטרודה ממוקם בתוך תא ההקלטה, וקצהו החתוך של צרור העצבים נשאב אל תוך קצה הזכוכית באמצעות יניקה. מובילי האות והייחוס מחוברים לשלב הראש (head stage) של מגבר דיפרנציאלי לצורך הגברת האות וסינון רעשים. פלט המגבר מועבר לאוסילוסקופ לצפייה ולכרטיס רכישת נתונים לצורך ניתוח ואחסון במחשב.אנו משתמשים בתוכנה בהזמנה מיוחדת שנכתבה ב-LabVIEW לשליטה בגירויי אור, ובמבדיל ספייקים (spike discriminator) דיגיטלי להקלטת רצפי ספייקים. צינור אור מסיב אופטי משמש להארה של תא בודד, בעוד שתצוגת וידאו נשלטת במחשב משמשת לגירוי תבניתי; בהקלטות של העצב האופטי, ניתן לחקור את העברת האותות בין העיניים למוח באופן תוך-רשתיתי. ההקלטה כוללת החדרת מיקרו-אלקטרודה ישירות לתוך תאים בעין והקלטה של תנודות המתח התוך-תאיים המושרות על ידי אור.הכלים הדרושים להליך זה כוללים מברגה, פלטפורמה שקופה בצורת L. חורי הברגה למסך מיקרו-אלקטרודה מעל האלקטרודה מזכוכית, ברגי פלדת אל חלד, פינצטה וסכיר דק. לאחר קיבוע הסרטן, פלטפורמה מעץ, פלטה שקופה עם חורי ברגה קבועים מראש, מחוברת לקרפוס (carpus) באמצעות שני ברגים בצד ואחד בחלק העליון.את החיה מניחים בכלוב אטום לאור בתוך מיכל מלא במי עיגול מעל הזימים. מיקומית מיקרו-ממוטרת מקובעת ללהב באמצעות ברגים, וזרוע המיקומית מיושרת מעל העין. קבוצה של מיקרו-פיפטות זכוכית נמשכות מקוטר חיצוני של 1 mm של זכוכית סיליקאט, והקצוות ממולאים שוב באמצעות פעולת נימיות.על ידי הנחת הפ pipette-ים בבקבוקון המכיל תמיסת פוטסיום כלוריד בריכוז של שלושה מולארי למשך מספר דקות, ממלאים ידנית את שאר ה-pipette בתמיסת המלח ומכניסים אותה למחזיק מיקרו-אלקטרודות שמולא מראש בתמיסה כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, מחדירים את מחזיק האלקטרודה לשלב הראש (head stage) של מגבר תו-תאי המחובר למיקרו-מניע (micro positioner). חלק מהרשתית נחשף על ידי חיתוך זהיר של שטח ריבוע קטן מהקרנית הגבית (dorsal cornea).בעזרת הסקלפל, טיפה של Ringer Solution מונחת על הרקמה החשופה כדי למנוע התייבשות, והמיקרו-פיפט מוקדם לעבר הרשתית. כאשר קצה הפיפט נוגע בתמיסה, מצב ההזרקה הנוכחי של המגבר התוך-תאי מופעל ועכבת האלקטרודה נמדדת; מיקרו-פיפטים עם עכבות מחוץ לטווח של 20 עד 70 mega ohms נפסלים. אלו הנמצאים בטווח זה מוקדמים לרשתית בצעדים בגודל מיקרוני ומוחדרים לתאים באמצעות רטט אלקטרוני של הקצה; גירויים של אור מועברים כדי להחדיר לתאים באמצעות סיב אופטי או תצוגת וידאו.ניתן למצוא שלושה סוגי תאים בעין של סרטן פרס, תאי-oular, תאים אקסצנטריים ותאי פיגמנט; תאי-oular מגיבים באמצעות תגובה דה-פולריזצית חזקה לאור, תאים אקסצנטריים מראים רצף של פוטנציאלי פעולה הנרכבים על תגובה דה-פולריזצית, ותאי פיגמנט אינם מראים תגובה לאור כלל. התגובה נצפית באוסצילוסקופ ונרשמת למחשב באמצעות הקלטות תוך-רשתיות. באופן זה ניתן לחקור את הבסיס התאי של הראייה.לסיכום, הדגמנו כיצד לבצע רישומי אלקטרו-רטינוגרם, רישומי עצב אופטי ורישומים תוך-רשתיים בסרטני נעל בחיים (in vivo). שיטות אלו נמצאות בשימוש נרחב ומספקות תובנות ייחודיות לגבי המכניזמים העצביים של עיבוד מידע חזותי בסרטני נעל. הן לא רק פשוטות ליישום במעבדה למחקר, אלא יכולות להטמע בצורה קלה במעבדה להוראה בנושאי נוירופיזיולוגיה של הראייה.תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

using-the-horseshoe-crab-limulus-polyphemus-in-vision-research

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטן פרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס, הוא לטעון את המקור הנוח ביותר עבור כמויות גדולות של דם של חסרי חוליות כלשהו. דם היא פשוטה בהרכב, כאשר רק סוג תא אחד במחזור כללי, amebocyte פרטנית, ורק שלושה חלבונים בשפע בפלסמה, hemocyanin, C-reactive חלבונים, α2-macroglobulin. הדם נאסף מן הלב ותאי דם פלזמה מופרדים על ידי צנטריפוגה.

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

סרטון זה מדגים את ההליך להקלטה תוך-תאית in vivo של תאים קולטי אור בעין של פרפר וקביעת הרגישות הספקטרלית של סוגי תאים בודדים. טכניקה זו מאפשרת לחקור רגישויות של תאים קולטי אור בודדים לגירויי אור שונים.

ב-Vivo הקלטה תוך-תאית של רגישות ספקטרלית של תאים קולטי אור בפרפר

Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; In vivo</em&lt;הקלטות תאיות

פרוטוקול לחקר הפחתת הרגישות וההתאוששות הרגישות של מנועי סרטן הסרטנים כפונקציה של הזמן האחראי מוצג.

הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור

, כדי לבחון את ראיית העכבר. ערכנו מבחן מתנשא עכברים הוצבו בזירה מרובעת גדולה עם צג על התקרה שלו. הגירוי החזותי מתנשא בעקביות עורר הקפאת או תגובות הטיסה בעכברים.

באמצעות גירויים חזותיים מתנשא להערכת חזון העכבר

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

שני פרוטוקולי אבלציה של דיבור עיניים (כלומר, גישות צריבה וניתוח) בוצעו על נקבות סרטנים מורדמות. אבלציה של סרטני בוץ זירזה את הבשלת השחלות מבלי להפחית את שיעור ההישרדות.

אבלציה של דיבור עיניים להגברת התבגרות השחלות בסרטני בוץ

חקור טכניקות אלקטרופיזיולוגיות לחקר בסיס עצבי של הראייה בסרטן הפרסה Limulus polyphemus. השיטות כוללות רישום אלקטרורטינוגרם, רישום עצב הראייה ורישום תוך-רשתית לניתוח פעילות עצבית.

שימוש סרטן הפרסה, Limulus פוליפמוס, מחקר חזון

גלה סרטונים נוספים