הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה
23 בספטמבר 2009
בניה של ספריה fosmid עם הדנ"א הגנומי הסביבה מבודדים רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות מתואר. הספרייה שיבוט המתקבל הוא הרים את 384 גם צלחות בארכיון עבור סידור במורד וסינון תפקודית על ידי יישום של מערכת המושבה אוטומטיות קטיף.
היי, אני מרקוס מהמעבדה של סטיבן הלם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית. היום נראה לכם נוהל לבניית ספרייה סביבתית גדולה להכנסה. מסייעת לי בהליך היום היא סאן לי, שתבצע אריזת פאג'ים והדבקה של מארח הספרייה אי קולי, כמו גם אליס האולי וצ'ין יאנג שיבצעו את קטיף המושבה.
יש לנו את ההליך הזה במעבדה שלנו כדי לחקור את מבנה קהילת המיקרוביו ואת חילוף החומרים בסביבות ימיות ויבשתיות. אז בואו נתחיל. פרוטוקול זה ליצירת ספריית DNA fo smid מתחיל לאחר בידוד וגזירה של DNA גנומי מדגימות ביומסה נהלים שפירטנו במאמרים הנלווים.
השלבים הבאים מכינים את ה-DNA של SHE לקשירה לתוך וקטור SMID PCC. הצעד הראשון הוא לתקן את הקצוות של פיסות ה-SHE של ה-DNA והזרחן. חמשת הקצוות העיקריים, כל הריאגנטים הדרושים לשלב זה כלולים בערכת הייצור של ספריית PCC אחת SMID ממוקד האפיסט כדי להגדיר את תגובת התיקון הסופית, להפשיר את כל הריאגנטים על קרח, ואז לשלב את מאגר תיקון הקצה DNTP, לערבב TP עד 20 מיקרוגרם של היא להכניס DNA ב 0.5 מיקרוגרם לתערובת אנזים מיקרוליטר ומים כדי להגיע ל 80 מיקרוליטר צנטריפוגה קצרה את הצינור כדי להביא את כל הנוזל ל ישבן.
דגרו את תגובת תיקון הקצה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות עד שעה. ואז מחמם, הוא מנטרל את האנזימים ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. במהלך הדגירה הסופית של התיקון, תוכלו להכין את הג'ל לשלב הבא.
אלקטרופורזה של ג'ל שדה פועם או PFGE, המטרה שלך היא לבודד מולקולות DNA הנעות בין 30 ל -60. קילובסיסים PFGE היא שיטה אלקטרופורטית לפתרון שברים גדולים אלה הפועלים יחד במהלך אלקטרופורזה סטנדרטית. כדי להתחיל, הכינו ג'ל של 1% באמצעות ארוס נמס נמוך ב-150 מיליליטר של מאגר ריצה XTAE אחד.
בחר מסרקים שיאפשרו לך לטעון את כל דגימת 80 המיקרוליטר של DNA לתיקון קצה בתוספת טעינת מאגר לבאר אחת או שתיים. היזהר במיוחד בטיפול בג'ל כג'ל אגרוס נמס נמוך. נשבר בקלות רבה בזמן שהג'ל מתמצק.
הכן את תא האלקטרופורזה. הוסף 2.2 ליטר של XTAE אחד לתא והפעל את המכונה כדי להפיץ את המאגר הפועל. הגדר את מכשיר הקירור ל-14 מעלות צלזיוס והגדר את המשאבה ל-70 סל"ד.
כלול סמן PFG אחד לטווח בינוני גם מ- NEB. כדי להימנע מחיתוך הג'ל גבוה מדי, הוצא את הארוס ממזרק הג'ל וחתוך פקק קטן מהקצה בעזרת האזמל. הניחו את התקע בקדמת הבאר ואטמו בארוס מותך.
ודא שמאגר הריצה התקרר ל-14 מעלות צלזיוס לפני שאתה טוען את הג'ל שלך. בבאר הראשונה טען חמישה מיקרוליטר של ניו אינגלנד ביולאבס למבדה הינדי שלושה עיכולים. בבאר השנייה טען מיקרוליטר אחד של סמן גודל הבקרה של Smid מדולל ב-10 מיקרוליטר מים סטריליים בתוספת מאגר טעינה.
לאחר מכן טען את התערובת המתוקנת והמושבתת בחום בתוספת מאגר טעינה. סגור את המכסה ותכנת את המכונה. הג'ל יפעל למשך הלילה או 12 שעות.
כאשר הג'ל מסיים לרוץ, השתמש בכתם זהב סייבר כדי לדמיין את ה-DNA לדלל את זהב הסייבר. ב-250 מיליליטר של XTAE אחד, הכניסו את הג'ל לתמיסה והכתמו למשך שעה בחושך זהב סייברג רגיש לאור בזמן שהג'ל מכתים. הכינו אמבט מים ב-70 מעלות צלזיוס ו-F 45 מעלות צלזיוס לשלב מיצוי הג'ל שלאחר מכן.
השלב הבא הוא בלו וג'ל. טהר את ה-DNA בטווח הגודל הרצוי של 30 עד 60 קילו-בסיסים. קח את הג'ל המוכתם שלך יחד עם שפופרת מיקרו תחבולה ריקה, קרועה ומסומנת ואזמל סטרילי למתמר האור הכחול.
מרפדים את הטרנסלומינטור בניילון נצמד כדי למנוע זיהום צולב של הג'ל שלך. הדליקו את משקפי הצפייה והדליקו את האור הכחול. עכשיו אתה יכול לראות את ה-DNA הגנומי המתוקן שלך ואת סמן גודל הבקרה של FO עם האזמל, כרת פרוסת ג'ל ברוחב של חמישה עד שבעה מילימטרים שנדדה עם ומעט מעל סמן גודל הבקרה של smid.
השתמש בסמן PFG כגבול עליון עבור הפרוסה שלך. מעבירים את הפרוסה לצינור הקרוע. ניתן לאחסן את הפרוסות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שנה לפני שתמשיך.
עכשיו הגיע הזמן לג'ל. טהר את ה-DNA מהפרוסה שלך. שקלו את השפופרת המכילה את פרוסת הג'ל שלכם וחשבו את משקל הפרוסה על ידי הפחתת משקל הדמעה.
לאחר מכן, ממיסים את הפרוסה באמבט המים של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. לאחר שפרוסת הג'ל שלך נמסה לחלוטין, העבירו את הצינור במהירות לאמבט המים של 45 מעלות צלזיוס. יש לזכור כי למיליגרם אחד של ג'ל מוצק יש נפח של מיקרוליטר אחד לאחר ההיתוך.
הוסף יחידה אחת או מיקרוליטר אחד של תכשיר אנזים Jase לכל 100 מיקרוליטר של ארוס מומס. דגירה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן מוסיפים עוד שניים עד ארבעה מיקרוליטרים ודוגרים בחום של 45 מעלות צלזיוס לחום נוסף של שעה.
השבת את הג'ל בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר החימום. השבתת האנזים, הניח את הצינור על קרח למשך 10 דקות מאשר צנטריפוגה במהירות מרבית. 13,000 סל"ד למשך 15 דקות כדי לגלול חלקיקים בלתי מסיסים.
היזהר לא להפריע לגלולה. הסר את הסופרנטנט העליון המכיל את ה-DNA המטוהר שלך והעביר אותו לצינור בז של 15 מיליליטר. לאחר מכן יש לשטוף אותו בשלושה מיליליטר מים סטריליים ליד לשטוף ולרכז את ה- DNA.
העבירו את התמיסה מצינור ה-Falcon בנפח 15 מיליליטר ליחידת מסנן צנטריפוגלית Ancon Ultra עם קרום Ultra Cell 10. הנח את יחידת המסנן ברוטור דלי מתנדנד באמצעות צינור בז של 50 מיליליטר כמתאם וסובב ב-4,000 GS למשך שש עד שמונה דקות. צנטריפוגה עד כ -100 עד 500 מיקרוליטר תמיסה.
הישארו על המסנן והשליכו את הזרימה. לאחר מכן הוסיפו עוד שלושה מיליליטר מים סטריליים לצינור הבז הריק. העבירו את התמיסה לצינור אמון וחזרו על שלב הצנטריפוגה.
שטפו את צינור הבז בפעם השלישית והפחיתו את הנפח הסופי שנאסף על המסנן ל-50 עד 100 מיקרוליטר. אינך צריך לדאוג לאבד את המדגם. המסנן ישמור על 50 מיקרוליטר נוזלים גם לאחר צנטריפוגה ממושכת.
העבירו את תמיסת ה-DNA שנותרה מצינור AmCon ליחידת מסנן צנטריפוגלית MicroCon YM 50 שטופה מראש ושטפו את צינור Amon ב-50 מיקרוליטר נוספים של מים סטריליים כדי לשחזר את כל צנטריפוגות ה-DNA. יחידת המסנן הצנטריפוגלי MicroCon YM 50 במיקרו צנטריפוגה ב-10,000 GS עד שהמסנן עדיין מכוסה מעט בנוזל. בדוק כל דקה.
אם נותרה רק כמות קטנה של נוזלים על המסנן. הפוך את המסנן ושחזר את תמיסת ה-DNA שלך על ידי שלב צנטריפוגה שני ב-1000 GS למשך שלוש דקות בצינור מיקרו צנטריפוגה טרי. הנפח המתקבל לא יעלה על 10 עד 15 מיקרוליטר בסך הכל.
אחרת, ה-DNA שלך עלול להיות מדולל מדי עבור הקשירה. בדוק את ריכוז תמיסת ה-DNA המתקבלת על ידי NanoDrop או Pico Green Assay. התאושש ותוקן.
ה- DNA מוכן כעת לקשירה ל- PCC וקטור שיבוט FO SMID אחד עבור הקשירה להפשיר את כל הריאגנטים על הקרח. לאחר מכן משולבים לפי הסדר המפורט כאן, מערבבים לאחר כל הוספה. ראשית, הוסף מים סטריליים כדי להגיע לנפח תגובה של 10 מיקרוליטר.
לאחר מכן 10 x מאגר קשירת קישור מהיר, 10 מילי-מולרי A-T-P-P-C-C וקטור SMID אחד והכנס ביחס מולארי של 10 לאחד. ולבסוף קישור מהיר DNA Ligase. צנטריפוגה קצרה את הצינור כדי להביא את כל הנוזל לתחתית.
הקש על הצינור וסובב שוב. דגרו את תגובת הקשירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים והשביתו את האנזים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס. בשלב זה, אתה יכול לאחסן את תגובת הקשירה במינוס 20 מעלות צלזיוס או להמשיך לשלב אריזת הפאג'ים.
השלב הבא הוא ליצור פאג'ים חיידקים שיתפקדו כדי להכניס את ספריית ה-FO SMID שלך ל-e coli יומיים או שלושה לפני שאתה מתכנן לבצע את שלב אריזת הפאג'ים, להוציא את זן הציפוי העמיד של EPI 300 T המסופק על צלחת LB רגילה ולדגור למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס כדי להשיג מושבות בודדות. אתה יכול לאטום את הצלחת הזו ולאחסן אותה בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. יום לפני תגובות האריזה יש לחסן 50 מיליליטר מרק אלבי בתוספת 10 מילי-מולרי מגנזיום גופרתי עם מושבה אחת מצלחת ה-Epi 300 שלך לנער ב-225 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
ביום תגובות האריזה יש לחסן מרק טרי של 50 מיליליטר בתוספת 10 מילי-מולרי מגנזיום גופרתי עם חמישה מיליליטר של תרבית הלילה. תרבית, החיידקים ב-37 מעלות צלזיוס עד OD 600 של 0.8 עד 1.0. אל תחרוג מ-OD 600 של 1.0.
יש לדלל את הדגימה לפני המדידה בספקטרופוטומטר כדי לקבל תוצאה מדויקת. יש לאחסן על קרח או בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שתהיו מוכנים להמשיך, או עד 72 שעות. כעת, כשהחיידקים מוכנים לזיהום, הגיע הזמן להכין את הפשרת הפאג'ים.
המקסימום פלאק תמציות אריזות למבדה על קרח. באמצעות צינור אחד לכל תגובת קשירה, ההפשרה תארך כ-10 עד 15 דקות. בינתיים, מצננים מראש צינור ריק של 1.5 מיליליטר על קרח שוב באמצעות צינור אחד לכל תגובה.
לאחר שתמציות אריזת הלמבדה הופשרו, העבירו מיד ל-25 מיקרוליטר מכל תמצית אריזה לצינור המיקרו-פוגה המצונן, בנפח 1.5 מיליליטר, והניחו על קרח. מחזירים את תמצית האריזה הנותרת למינוס 80 מעלות צלזיוס. השארת תמציות האריזה המופשרות על קרח זמן רב מדי תפחית את יעילות הזיהום.
לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תגובת הקשירה לכל 25 מיקרוליטר של התמציות המופשרות על קרח מעורבב על ידי פיפטינג התמיסה מספר פעמים מבלי להכניס בועות אוויר. צנטריפוגה קצרה כדי לאחד את כל הנוזל בתחתית הצינורות ולדגור את תגובות האריזה באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר 80 דקות של דגירה, יש להפשיר את תמצית האריזה שנותרה על קרח.
לאחר השלמת תגובת האריזה של 90 דקות, הוסף את 25 המיקרוליטרים הנותרים של תמצית האריזה לכל צינור תגובה. דגירה של תגובות למשך 90 דקות נוספות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה השנייה, הוסיפו 100 מיקרוליטר ממאגר דילול הפאג'ים המוכן בכל צינור אריזה וערבבו בעדינות והוסיפו חמישה מיקרוליטר כלורופורם לכל צינור.
עכשיו צריך להיות לך נפח כולל של 165 מיקרוליטר בצינור. משקעים צמיגים עלולים להיווצר לאחר מהדורת הכלורופורם. הימנע ממשקעים אלה כמו גם משלב הכלורופורם האורגני בעת פיפטינג חלקיקי הפאג'.
בשלב זה, אתה יכול לאחסן את חלקיקי הפאג'ים הארוזים בארבע מעלות למשך מספר ימים במידת הצורך, אך השתמש בפאג' טרי שהוכן לקבלת התוצאות הטובות ביותר. עכשיו אתה מוכן להדביק את תאי המארח, שגדלת לאורך שלבי האריזה של הפאג'ים עם הפאג' הארוז. הוסף פאג' ארוז לתאי מארח עמידים ל-EPI 300 T אחד OD 600.8 עד 1.0 ביחס של 400 מיקרוליטר של תאים עמידים ל-epi 300 T אחד לכל 10 מיקרוליטר של חלקיקי פאג'ים.
כדי להימנע מפיפטינג כלורופורם כלשהו מתחתית הצינור של פאג' ארוז, אנו משתמשים ב-125 מיקרוליטר של חלקיקי הפאג'ים הארוזים וחמישה מיליליטר של תאי מארח עמידים מוכנים של epi 300 T אחד מעורבבים בעדינות ואז דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השלב הבא הוא קביעת הטיטר של הפאג הארוז. אתה עושה זאת על ידי ציפוי החיידקים הנגועים על תווך כדי לבחור תאים נגועים.
לאחר מכן סופרים את המושבות המתקבלות ומחלקים בנפח הפאג'ים שנוספו לחיידקים שצילפתם. ה-C one SMID מכיל גן עמידות לכלורמפניקול. אז כדי לבחור שיבוטים נגועים לוחים את החיידקים על כלורמפניקול המכיל לוחות LB.
מורחים פעמיים 50 מיקרוליטר ופעמיים 10 מיקרוליטר של תאים עמידים EPI 300 T נגועים בפאג' על ארבע צלחות נפרדות ומניחים את הצלחות הפוכות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות, לא יותר מ-48 שעות עד להיווצרות מושבות. בינתיים, קצרו את שאריות התאים העמידים ל-EPI 300 T אחד מהזיהום של חמישה מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב-3,500 GS למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט.
הוסף מיליליטר אחד של LB עם 20% גליצרול לרסוס הצינור. השעו את כדור התא והשאירו עד 100 מיקרוליטר כל אחד בשני צינורות בקבוקון קריו של מיליליטר קפאו מיד ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס. לשימוש נוסף בשלב קטיף המושבה למחרת, ספרו את מספר השיבוטים על ארבע הלוחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס וקבעו את הטיטר של הפאג' הארוז, שבו תשתמשו בשלב הבא.
מלאי הגליצרול העמיד הקפוא EPI 300 T one מכיל תאים שהומרו עם כל הפלסמידים השונים בספרייה שלך. לאחר מכן, מורחים כמות מתאימה על סמך הטיטר הנגיפי וגודל הצלחת של כל סמיד. שיבוט על ריבוע 2 45 על 2 45 מילימטר.
לוחות בדיקה ביולוגית של LB עם כלורמפניקול באמצעות חרוזי זכוכית. הוסף גם כמות קטנה של מרק LB לצלחת כדי לפזר את התאים שלך באופן שווה. זכור כי הכנת ציר הגליצרול מרכזת בנוסף את התאים שלך בערך פי חמישה.
דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בימי קטיף המושבות, הכינו 96 או 3 84 צלחות באר מלאות ב -200 מיקרוליטר או 70 מיקרוליטר לבאר מרק LB. בתוספת 12.5 מיקרוגרם כלורמפניקול למיליליטר מרק לבחירת אנטיביוטיקה ו-10% גליצרול להקפאה. אנו משתמשים במערכת מילוי שלוש הצלחות האוטומטית qfi לשלב זה.
השלב הבא הוא לבחור מושבות מצלחות LB CHLORAMPHENICOL המוכנות שלך לתוך צלחות 96 או 3 84 בארות מוכנות להקפאה. עבור שלב זה, אנו משתמשים ברובוט איסוף השיבוטים qix two, על פי המדריך למשתמש, כדי ליצור סביבה סטרילית סביב אזור איסוף השיבוטים. הדליקו את נורת ה-UV למשך 30 דקות בזמן שנורית ה-UV דולקת.
הכינו 500 מיליליטר של 1% אקונומיקה, 500 מיליליטר מים סטריליים דה-יונים ו -500 מיליליטר של 80% אתנול. כאשר נורית ה-UV נכבית, מלא את המגשים כפי שמסומן מאחור לחזית. מלאו 1% אקונומיקה, ואז מים נטולי יונים ו-80% אתנול במגש הקדמי.
ודא שהם מלאים מכיוון שלא ניתן לשטוף מחטי קטיף כראוי ללא תמיסת כביסה מספקת. לאחר הגדרת הפרמטרים לקטיף, הסר את המכסים מצלחות החיידקים שלך וה- LB שלך מלא 96 או 3 84 צלחות באר ומקם אותם בין העמודים בפיקי Q. צלחות אזור העבודה צריכות להיות הדוקות כנגד הפינה הימנית הקדמית כדי שלא יוכלו לזוז במהלך הקטיף.
ואז סגור את הלוח הקדמי. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, הליך הליקוט יכול להתחיל. בסיום כל הקטיף, שטפו את המברשות והמגשים במים נטולי יונים והניחו על הספסל לייבוש.
נקה את כל הדליפות שעלולות להתרחש ונגב את החלק הפנימי של ה-CICS עם 80% אתנול. ודא שכל צלחות מלאי הגליצרול מסומנות והניח אותן בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לגדל תרבית מכל מושבה שנבחרה. השאירו פתק על החממה המכיל את התאריך, מספר הצלחות שהודגרו, זמן הדגירה, זמן ההסרה וראשי התיבות שלכם.
לאחר הדגירה, יש לך את הספרייה שלך. כל באר מכילה תרבית של שיבוט חיידקי אחד המכיל את ה-PCC אחד fo smid הקשור לחתיכה אחת של DNA טהור מהדגימה ההתחלתית שלך. הקפיאו את הצלחות במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח הארוך וברכו את עצמכם על עבודה שנעשתה היטב.
הפרוטוקול המוצג מתאר את ההליך כיצד ליצור ספריית smid סביבתית כדי ללכוד את התוכן הגנטי של קהילה מיקרוביאלית בבית גידול נתון. פרוטוקול זה אמור ליצור ספריית SMID, המייצגת את התוכן הגנטי של הסביבה הנדגמת, ואמורה לאפשר לקורא לייעל שלבים קריטיים. אם כמות שיבוטי ה-FO smid המתקבלת בסוף כל ההליך נמוכה מדי.
זה עתה הראינו לכם כיצד לבנות את ספריית FO SMID מ-DNA גנומי שמקורו בדגימת מים ימיים. כאשר מבצעים הליך זה, חשוב להתחיל עם DNA גנומי באיכות גבוהה. הכינו את כל הצלחות והריאגנטים שלכם לפני שתתחילו ותכננו מספיק זמן לתהליך רב-שלבי זה.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר את בניית ספריית פוסמיד באמצעות DNA גנומי סביבתי מפיורד היפוקסי עונתי. הספרייה מאוחסנת בצלחות של 384 באריות לצורך רצף עתידי ובדיקה פונקציונלית.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- גנומיקה סביבתית
- ביולוגיה ימית
רקע
- בידוד וגזירה של DNA גנומי מדגימות ביו-מסה.
- חקר מבנה ומטבוליזם של קהילות מיקרוביאליות.
- יישום מערכות אוטומטיות לאיסוף מושבות.
- התמקדות בסביבות עם רמות חמצן משתנות.
מטרת המחקר
- ליצור ספרייה סביבתית עם תוספת גדולה.
- להקל על רצף ובדיקה פונקציונלית במורד הזרם.
- לשפר את ההבנה של המגוון המיקרוביאלי בסביבות מסוימות.
שיטות בשימוש
- בידוד של DNA גנומי מדגימות סביבתיות.
- גזירת DNA ליצירת שברים מתאימים לשיבוט.
- אריזת פאג'ים וזיהום מארחי E. coli.
- איסוף אוטומטי של מושבות לבניית הספרייה.
תוצאות עיקריות
- בנייה מוצלחת של ספריית פוסמיד.
- ארכוב של שיבוטים בצלחות של 384 באריות.
- הכנה לרצף ובדיקה פונקציונלית.
- הקמת משאב לחקר קהילות מיקרוביאליות.
מסקנות
- השיטה מאפשרת בנייה יעילה של ספרייה מדגימות סביבתיות.
- מקלה על מחקר עתידי על מגוון ותפקוד מיקרוביאלי.
- תורמת להבנת מערכות אקולוגיות המושפעות מהיפוקסיה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Large insert environmental genomic library production enables direct access to uncultivable microbial genetic diversity, supporting early-stage target discovery and functional screening in biopharma R&D. This approach expands the repertoire of novel genes and pathways available for therapeutic and biotechnological innovation, reducing reliance on traditional cultivation and increasing predictive confidence in environmental gene mining. Integration of automated archiving and high-throughput workflows positions these libraries as reusable assets for portfolio-wide discovery initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of environmental gene pools for novel target identification.
- Facilitates functional validation of genes and pathways inaccessible by cultivation.
- Supports mechanistic de-risking by capturing native genetic context.
- Provides a foundation for predictive confidence in target selection from complex microbiomes.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, size-selected DNA libraries for downstream functional assays.
- Standardizes library construction and archiving for reproducible screening campaigns.
- Enables scalable, automated colony picking and high-throughput screening readiness.
- Supports reliable evaluation of gene function and compound interactions in environmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns environmental gene discovery with translational biomarker exploration when disease-relevant pathways are identified.
- Maintains continuity from environmental sampling through preclinical validation of microbial functions.
- De-risks advancement decisions by providing comprehensive genetic resources for functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges environmental sampling and high-throughput screening, supporting workflows from early discovery through lead identification and functional validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway elucidation by capturing native microbial genes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs via archived clone libraries and automated picking.
- Analytics: Facilitates comparative analysis of gene content and function across environmental gradients.
- Translational Research: Supports biomarker alignment when environmental genes map to disease-relevant pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a renewable resource for ongoing target mining and functional genomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates library production for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient exploration of novel targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and broadens the scope of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental genomics, molecular cloning, and high-throughput automation.
- Demands access to pulsed-field gel electrophoresis, automated colony pickers, and robust archiving infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of protocols and quality control checkpoints.
- Adaptation may be needed for different environmental sources or target size ranges.
- Process duration and incubation steps require careful planning and resource allocation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:07
Introduction
0:43
End Repair of Sheared Genomic DNA
4:48
DNA-recovery by Gel Extraction and Ligation of Recovered DNA to the Fosmid Cloning Vector
20:32
Conclusion
2:10
Size-Selection of Genomic DNA by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
10:18
Phage-packaging of Vector-insert Ligation Product and Infection of Phage-Resistant Bacteria
17:46
Colony Picking, Culturing, and Long-Term Storage
14:30
Plating and Titering
16:34
Preparation for Colony Picking
