הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

שלום, אני מרקוס מהמעבדה של סטיבן הלם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית. היום נראה לכם הליך לבניית ספריית סביבה עם מקטע הזרקה גדול. בסיוע לי בהליך היום היא סן לי, שתבצע אריזת פאג'ים והדבקה של מאכיל הספרייה e coli, וכן אליס הולי וצ'ין יאנג שיבצעו את בחירת המושבות.

פרוצדורה זו מיושמת במעבדתנו לצורך חקר מבנה הקהילה המיקרוביאלית והמטבוליזם בסביבות ימיות ויבשתיות. אז בואו נתחיל. פרוטוקול זה ליצירת ספריית DNA מסוג fosmid מתחיל לאחר בידוד וגזירה של DNA גנומי מדגימות ביומסה, הליכים שפירטנו במאמרים נלווים של JoVE.

השלבים הבאים מכינים את ה-SHE DNA לליגציה לתוך וקטור ה-SMID מסוג PCC one. השלב הראשון הוא תיקון הקצוות של מקטעי ה-SHE DNA ופוספורילציה של קצוות ה-5'. כל הריאגנטים הדרושים לשלב זה כלולים בערכה להפקת ספריית PCC one SMID מחברת epicenter. כדי להכין את תגובת תיקון הקצוות, הפשיר את כל הריאגנטים על קרח, ולאחר מכן ערבב את באפר תיקון הקצוות, dNTP, עד ל-20 µg של SHE insert DNA בריכוז של 0.5 µg/µL, תערובת אנזימים ומים כדי להגיע לנפח של 80 µL. סבב את המבחנה קצרה בצנטריפוגה כדי להוביל את כל הנוזל לתחתית.

דגרו את תגובת תיקון הקצוות בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות עד שעה. לאחר מכן, חממו כדי להשבית את האנזימים ב-70 °C למשך 10 דקות. במהלך דגירת תיקון הקצוות, ניתן להכין את הג'ל לשלב הבא.

באלקטרופורזה של ג'ל בשדה פועם (Pulsed field gel electrophoresis או PFGE), המטרה היא לבודד מולקולות DNA בטווח שבין 30 ל-60 Kilobases. PFGE היא שיטה אלקטרופורטית להפרדה של פרגמנטים גדולים אלו, אשר רצים יחד במהלך אלקטרופורזה סטנדרטית. לתחילת העבודה, הכינו ג'ל בריכוז 1% באמצעות agarose בעל נקודת התכה נמוכה ב-150 milliliters של באפר הרצה one XTAE.

בחרו מסרקי הרצה שיאפשרו לכם להעמיס את כל דגימת ה-DNA לאחר תיקון הקצוות (end repair), בנפח של 80 microliter, בתוספת בופר טעינה לתוך באר אחת או שתיים. היזהרו במיוחד בעת הטיפול בג'ל, שכן ג'לי agarose בעלי נקודת התכה נמוכה נשברים בקלות רבה בזמן שהג'ל מתמצק.

הכינו את תא האלקטרופורזה. הוסיפו לתא 2.2 liters של one XTAE והפעילו את המכשיר לסחרור של תמיסת הריצה. הגדירו את התקן לקירור ל-14 °C ואת המשאבה ל-70 RPM.

הוסיפו סמן PFG בטווח בינוני, גם הוא מבית NEB. כדי למנוע חיתוך גבוה מדי של הג'ל, דחפו aros ממזרק הג'ל וחתכו פלאג קטן מהקצה באמצעות סכיך. מקמו את הפלאג בחלקו הקדמי של הבאר ואטמו באמצעות aros מומס.

וודאו שתמיסת הריצה התקררה ל-14 °C לפני טעינת הג'ל. בבאר הראשונה טענו 5 µL של עיכול Lambda Hindi III מ-New England Biolabs. בבאר השנייה טענו 1 µL של סמן גודל Smid diluted ב-10 µL של מים סטריליים בתוספת תמיסת טעינה.

לאחר מכן, טענו את התערובת שעברה תיקון קצוות והשבתה תרמית בתוספת בופר טעינה. סגרו את המכסה ותכנתו את המכשיר. הג'ל ירוץ במהלך הלילה או למשך 12 שעות.

כאשר הרצת הג'ל מסתיימת, השתמשו בצבע cyber gold כדי להנמיח את ה-DNA; דללו את ה-cyber gold. ב-250 milliliters של one XTAE, הניחו את הג'ל בתוך התמיסה וצבעו במשך שעה אחת בחושך, שכן cyber gold רגיש לאור. בזמן צביעת הג'ל, הכינו מקבץ מים ב-70 degrees Celsius וב-45 degrees Celsius עבור שלב מיצוי הג'ל שיבוא לאחר מכן.

השלב הבא הוא חיתוך והוצאה מהג'ל. טהרו את ה-DNA בטווח הגדלים הרצוי של 30 עד 60 kilobases. קחו את הג'ל הצבוע יחד עם מבחנה מיקרוצנטריפוגית ריקה, קרועה ומסומנת, וסכין מנתחים סטרילית אל המכשיר להארה באור כחול (blue light transluminator).

כסו את הטרנסלומינטור (transluminator) בניילון נצמד כדי למנוע זיהום צולב של הג'ל. הרכיבו את משקפי הצפייה והדליקו את האור הכחול. כעת תוכלו לראות את ה-genomic DNA המתוקן ואת סממן הגודל (size marker) של ה-FO smid control. בעזרת סכין מנתחים, חתכו פרוסת ג'ל ברוחב של 5 עד 7 מילימטרים, אשר נדדה עם ומעט מעל סממן הגודל של ה-smid control.

השתמשו בסמן ה-PFG כגבול עליון עבור הפרוסה. העבירו את הפרוסה לשפרוre המיועד. ניתן לאחסן את הפרוסות במינוס 20 מעלות Celsius למשך עד שנה לפני ההמשך.

כעת הגיע הזמן להרצה בג'ל. טהרו את ה-DNA מהפס שלכם. שקלו את המבחנה המכילה את פס הג'ל וחשבו את משקל הפס על ידי הפחתת משקל הטארה.

בשלב הבא, המסו את פרוסת הג'ל במכשירי חימום (water bath) בטמפרטורה של 70 degrees Celsius למשך 10 עד 15 דקות. לאחר שפרוסת הג'ל נמסה לחלוטין, העבירו את המבחנה במהירות למכשירי חימום בטמפרטורה של 45 degrees Celsius. שימו לב כי מיליגרם אחד של ג'ל מוצק תופס נפח של מיקרוליטר אחד לאחר ההמסה.

הוסיפו יחידה אחת או מיקרוליטר אחד של תמיסתו של אנזים Jase לכל 100 מיקרוליטרים של aros מומס. דגרו בטמפרטורה של 45 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו שני עד ארבעה מיקרוליטרים נוספים של les ודגרו בטמפרטורה של 45 °C למשך שעה אחת נוספת של חימום.

שבב את הג'ל בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות לאחר החממה. לצורך השבתת האנזים, הנח את המבחנה על קרח למשך 10 דקות ולאחר מכן סבב בצנטריפוגה במהירות מקסימלית, 13,000 RPM, למשך 15 דקות כדי לשקעל חלקיקים בלתי ממיסים.

הקפידו שלא להפריע למשקע. הסירו את הנוזל העליון המכיל את ה-DNA המטוהר והעבירו אותו לפסולת (falcon tube) של 15 מיליליטר. לאחר מכן, דללו אותו עם שלושה מיליליטר של מים סטריליים כדי לשטוף ולרכז את ה-DNA.

העבירו את התמיסה מהמבחנה של Falcon בנפח 15 מיליליטר ליחידת סינון צנטריפוגית Ancon Ultra four עם ממבנה ultra cell 10. הניחו את יחידת הסינון ברוטור בעל דליים נעים (swinging bucket rotor) תוך שימוש במבחנת Falcon בנפח 50 מיליליטר כמתאם, וסובבו במהירות של 4,000 GS למשך שש עד שמונה דקות. בצעו צנטריפוגה עד שנותרו כ-100 עד 500 µL מהתמיסה.

השאירו את החומר על המסנן והשליכו את הנוזל שעבר דרכו. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטרים נוספים של מים סטריליים למבחנה הפלקון (falcon) הריקה. העבירו את התמיסה למבחנה האמון (Amon) וחזרו על שלב הצנטריפוגה.

שטפו את מבחנת הפלקון פעם שלישית והפחיתו את הנפח הסופי שנאסף על המסנן ל-50 עד 100 µL. אין צורך לחשוש מאובדן הדגימה. המסנן ישמור 50 µL של נוזל גם לאחר צנטריפוגציה ממושכת.

העבירו את תמיסת ה-DNA שנותרה משפופרת ה-AmCon ליחידת סינון צנטריפוגלית MicroCon YM 50 שנשטפה מראש, ושטפו את שפופרת ה-AmCon עם 50 µL נוספים של מים סטריליים כדי להחלץ את כל ה-DNA. צנטריפוגו את יחידת הסינון הצנטריפוגלית MicroCon YM 50 במיקרו-צנטריפוגה ב-10,000 ×g עד שהמסנן עדיין מכוסה קלות בנוזל. בדקו בכל דקה.

אם נותרה כמות קטנה בלבד של נוזל על המסנן, הפוך את המסנן והשג את תמיסת ה-DNA באמצעות שלב סנטריפוגציה שני ב-1000 GS למשך שלוש דקות לתוך מבחנת מיקרו-סנטריפוגה נקייה. הנפח שיתקבל לא יעלה על 10 עד 15 µL בסך הכל.

אחרת, ייתכן שה-DNA יהיה מדולל מדי עבור הליגציה. בדוק את ריכוז תמיסת ה-DNA שהתקבלה באמצעות NanoDrop או Pico Green Assay. שוחזר ותוקן.

ה-DNA מוכן כעת לליגציה אל וקטור השבט PCC one FO SMID; לצורך הליגציה, הפשיר את כל הריאגנטים על קרח. לאחר מכן, שלב אותם לפי הסדר המופיע כאן, תוך ערבוב לאחר כל הוספה. ראשית, הוסף מים סטריליים כדי להגיע לנפח תגובה של 10 µL.

לאחר מכן, הוסיפו 10x fast link ligation buffer, 10 millimolar A-T-P-P-C-C, וקטור one SMID וסרט DNA (insert) ביחס מולרי של 10 ל-1. לבסוף, הוסיפו fast link DNA Ligase. צנטריפוגו את המבחנה לזמן קצר כדי לרכז את כל הנוזל בתחתית.

הקישו על המבחנה וסובבו שנית. דגרו את תגובת הליגציה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים ובצעו אינאקטיבציה תרמית לאנזים למשך 10 דקות ב-70 °C. בנקודה זו, ניתן לאחסן את תגובת הליגציה ב-20°C- או להמשיך לשלב אריזת הפאגים.

השלב הבא הוא יצירת פאגים של חיידקים שישמשו להחדרת ספריית ה-FO SMID שלך לתוך e coli. יומיים או שלושה ימים לפני השלב המתוכנן של אריזת הפאגים, קוץ את זן הפריסה העמיד EPI 300 T1 המסופק על פלטת LB רגילה והדגר בן לילה בטמפרטורה של 37°C כדי לקבל מושבות בודדות. ניתן לאטום פלטה זו ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי. ביום שלפני תגובות האריזה, חדיל 50 ml של מצע LB נוזלי בתוספת 10 mM מגנזיום סולפט באמצעות מושבה בודדת מפלטת ה-Epi 300 שלך. נער ב-225 RPM ובטמפרטורה של 37°C בן לילה.

ביום תגובות האריזה, ניתן להוסיף חמישה מיליליטר של תרבית הלילה לחמישים מיליליטר של מצע LB טרי בתוספת 10 millimolar מגנזיום סולפט. יש לגדל את החיידקים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד להשגת OD 600 של 0.8 עד 1.0. אין לעבור OD 600 של 1.0.

דללו את הדגימה לפני המדידה בספקטרופוטומטר כדי לקבל תוצאה מדויקת. אחסנו על קרח או בטמפרטורה של 4 °C עד למועד ההמשך או למשך עד 72 שעות. כעת, כאשר החיידקים מוכנים להדבקה, הגיע הזמן להכין את הפשרת הפאג'ים.

הפשרת max plaques Lambda Packaging על קרח. השתמשו במבחנה אחת לכל תגובת ליגציה; ההפשרה תימשך כ-10 עד 15 דקות. בינתיים, קררו מראש מבחנה ריקה בנפח 1.5 מיליליטר על קרח שוב, תוך שימוש במבחנה אחת לכל תגובה.

לאחר שהתמציות לאריזה של Lambda הפשירה, העבירו מיד 25 µL מכל תמצית אריזה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL שקוללה מראש והניחו על קרח. החזירו את שארית תמצית האריזה למינוס 80 °C. השארה של תמציות האריזה המופשרות על קרח למשך זמן ממושך מדי תפחית את יעילות ההדבקה.

בשלב הבא, הוסיפו 10 µL מתגובת הליגציה לכל 25 µL של התמריות שהופשרו על קרח, וערבבו באמצעות פיפטינג של התמיסה מספר פעמים ללא הכנסת בועות אוויר. סובבו קלות בצנטריפוגה כדי לרכז את כל הנוזל בתחתית המבחנות, ודגרו את תגובות האריזה באמבט מים בטמפרטורה של 30 °C למשך 90 דקות. לאחר 80 דקות של דגירה, הפשירו על קרח את שארית תמרית האריזה.

לאחר השלמת תגובת האריזה שנמשכת 90 דקות, הוסיפו את 25 המיקרוליטרים הנותרים של תמצית האריזה לכל מבחנה של תגובה. הדגירו את התגובות למשך 90 דקות נוספות בטמפרטורה של 30 °C. לאחר הדגירה השנייה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חוצץ דילול הפאג'ים שהוכן לכל מבחנת אריזה וערבבו בעדינות, ולאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של כלורופורם לכל מבחנה.

כעת אמור להיות נפח כולל של 165 µL במבחנה. משקע צמיגי עשוי להיווצר לאחר הוספת הכלורופורם. יש להימנע מהמשקע הזה וכן מהפאזה האורגנית של הכלורופורם בעת שאיבת חלקיקי הפאג באמצעות פיפט.

בשלב זה, ניתן לאחסן את חלקיקי הפאג המארזים בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך מספר ימים במידת הצורך, אך מומלץ להשתמש בפאג שהוכן טרי כדי להשיג את התוצאות המיטביות. כעת ניתן להדביק את תאי המארח, שגודלו על протяжении שלבי האריזה של הפאג, באמצעות הפאג המארז. הוסף את הפאג המארז לתאי מארח EPI 300 T one עמידים בעלי OD 600 של 0.8 עד 1.0, ביחס של 400 µL של תאי EPI 300 T one עמידים לכל 10 µL של חלקיקי פאג.

כדי למנוע שאיבה של כלורופורם מתחתית המבחנה של הפאגים הארוזים, נשתמש ב-125 µL של חלקיקי הפאג הארוזים וב-5 mL של תאי מאכסן epi 300 T one עמידים שהוכנו, נערבב אותם בעדינות ולאחר מכן נדגרי בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. השלב הבא הוא קביעת הטיטר של הפאג הארוז. יש לבצע זאת על ידי פיזור החיידקים המודבקים על מצע לצורך בחירת התאים המודבקים.

לאחר מכן סופרים את המושבות שהתקבלו ומחלקים בנפח הפאג שהתווסף לחיידקים שנזרעו. ה-C one SMID מכיל גן לעמידות לכלורמפניקול. לכן, כדי לבחור שיבוטים נגועים, זורעים את החיידקים על מצעי LB המכילים כלורמפניקול.

פזרו פעמיים 50 µL ופעמיים 10 µL של תאי EPI 300 T one עמידים שהודבקו בפאג על ארבעה צלחות נפרדות, והניחו את הצלחות כשהן הפוכות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 עד 24 שעות, ולא יותר מ-48 שעות, עד להיווצרות מושבות. בינתיים, אספו את תאי ה-EPI 300 T one העמידים שנותרו מההדבקה בנפח של 5 mL באמצעות סבב צנטריפוגה במהירות 3,500 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. השליכו את עלון הנוזל (supernatant).

הוסיפו מיליליטר אחד של LB עם 20% glycerol למבחנת הריסוס. השעו את משקע התאים וחלקו לנפחים של 100 microliters כל אחד לשתי מבחנות קריו של שני מיליליטר, הקפיאו מיד ושמרו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. לצורך שימוש בהמשך בשלב בחירת המושבות למחרת, ספרו את מספר הכלונים בארבעה צלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וקבעו את התר של הפאג הארוז, שבו תשתמשו בשלב הבא.

מלאי הגליצריול הקפוא של EPI 300 T one resistant מכיל תאים שהועברו אליהם כל הפלסמידים השונים בספרייה שלך. לאחר מכן, פזר כמות מתאימה בהתבסס על הטיטר הויראלי וגודל הצלחת של כל smid. בצע שיבוט על ריבוע של 45 על 45 מילימטר.

צלחות ביו-אסאי (Bioassay) של LB עם כלורמפניקול תוך שימוש בחרוזי זכוכית. כמו כן, הוסיפו כמות קטנה של מצע LB נוזלי לצלחת כדי לפרוס את התאים באופן אחיד. שימו לב כי הכנת מלאי הגליצרול מרכזת את התאים שלכם בערך פי חמישה בנוסף.

דגרו ב-37 °C למשך 24 שעות. ביום בחירת המושבות, הכינו פלטות של 96 או 384 בארות מלאות ב-200 µL או 70 µL של מצע LB broth לכל בארה, בתוספת 12.5 µg/mL של chloramphenicol לבחירה אנטיביוטית ו-10% glycerol לצורך הקפאה. בשלב זה אנו משתמשים במערכת מילוי הפלטות האוטומטית qfi three.

השלב הבא הוא העברת מושבות מלוחות LB CHLORAMPHENICOL שהוכנו מראש ללוחות 96 או 384 בארות שהוכנו להקפאה. לשלב זה, אנו משתמשים ברובוט לבחירת שיבוטים qix two, בהתאם למדריך למשתמש, כדי ליצור סביבה סטרילית סביב אזור בחירת השיבוטים. הדליקו את נורת ה-UV למשך 30 דקות; בזמן שנורת ה-UV דולקת.

הכינו 500 milliliters של 1%bleach, 500 milliliters של מים דה-יוניים סטריליים ו-500 milliliters של 80%ethanol. כאשר אור ה-UV נכבה, מלאו את המגשים לפי הסימון מאחור לקדמה. מלאו 1%bleach, לאחר מכן מים דה-יוניים שעברו אוטוקלאב, ו-80%ethanol במגש הקדמי.

וודאו שהם מלאים, שכן לא ניתן לשטוף את מחטי הברירה כראוי ללא תמיסת שטיפה מספקת. לאחר הגדרת הפרמטרים לברירה אופטימלית, הסירו את המכסים מלוחיות החיידקים ומלוחיות ה-96 או 384 בארים הממולאות ב-LB, והניחו אותן בין העמודים ב-Q picks. יש להצמיץ את לוחות אזור העבודה לפינה הימנית הקדמית כדי שלא יזוזו במהלך הברירה.

לאחר מכן סגרו את הפאנל הקדמי. לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו, ניתן להתחיל בהליך הברירה. עם השלמת כל פעולות הברירה, שטפו את המברשות ואת התבניות במים דה-יוניים והניחו אותן על המדף לייבוש.

נקו שפיכות שייתכן והתרחשו ונגבו את פנים ה-CICS עם 80% ethanol. ודאו שכל צלחות המאגרי הגליצרול מסומנות והניחו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות כדי לגדל תרבית מכל מושבה שנבחרה. השאירו פתק על האינקובטור המכיל את התאריך, מספר הצלחות שהוכנסו לדגירה, זמן הדגירה, מועד ההוצאה ואת ראשי התיבות שלכם.

לאחר הדגירה, הספריה מוכנה. כל באר מכילה תרבית של שיבט חיידקי אחד, שבו ה-PCC one fo smid לוקח חלק בליגציה לחתיכת DNA גזוז מהדגימה הראשונית. הקפיאו את הפלטות במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך, וברכו את עצמכם על עבודה טובה.

הפרוטוקול המוצג מתאר את ההליך ליצירת ספריית smid סביבתית כדי לדגום את התוכן הגנטי של קהילה מיקרוביאלית בבית גידול נתון. פרוטוקול זה אמור ליצור ספריית SMID המייצגת את התוכן הגנטי של הסביבה שנדגמה, ומטרתו לאפשר לקורא להבטיח אופטימיזציה של שלבים קריטיים, במקרה שבו כמות שיבוטי ה-FO smid שהתקבלו בסיום התהליך כולו נמוכה מדי.

הראינו לכם כיצד לבנות את ספריית ה-FO SMID מ-DNA גנומי שהופק מדגימת מי מים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להתחיל עם DNA גנומי באיכות גבוהה. הכינו את כל הפלטות והריאגנטים לפני התחלת העבודה, ותכננו מספיק זמן עבור תהליך רב-שלבי זה.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.