Name: מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: למדו הדמיית פלואורסצנט in vivo לניטור דינמיקת השתרשות תאי שריר GFP בעכברים. שיטה זו מאפשרת מחקר לוואי של תהליכי התחדשות שריר בבעלי חיים קטנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה של Z ו-Y וואנג יאנג התאפשרה על ידי מענק K02 AR051181 מ NIAMS / NIH, מענקי ניוון שרירים האגודה הארוורד לתאי גזע המכון Y וואנג. העבודה של Q ו-X זנג שו נתמכים על ידי מענק תוכנית הוענק מעבדת דימות אופטי מן בריגהאם ובית החולים לנשים. המחברים מבקשים להודות ליו וון מהמחלקה של הרדמה, BWH, עזרה טכנית בעבודה התא.

תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא הבידוד לווין <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הרדמה, שרירי הגפיים של העכברים הטרנסגניים GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) יוסרו. לאחר חיתוך לחתיכות קטנות, תאים הלוויין ניתק enzymatically הם דוגרים על ידי רקמת טחון עם פתרון 2% dispase collagenase שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את אנזים העיכול עם התקשורת גידול המכיל Ham-F-10 ו - 20% FBS, לנתק את השריר על ידי triturating חזר עם פיפטה פסטר. התאים מסוננים דרך מסננת תא (ø70-100μm) ו מצופה מכן על צלחת הלא מצופה שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את supernatant צלחת אותם על צלחת מצופה קולגן. חזור על צעד 1 שעה לאחר מכן לטהר את myoblasts. (טרום צלחת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת צלחת התאים בזמן. Myoblasts מטוהרים הסופי בתרבית בינוני המכיל Ham-F-10, 20% FBS, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין (מדיום גידול) בשעה 37 ° C עם CO2 5%, 95% אוויר. </li></ol> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולהרחיב את myoblasts העיקרי במדיום הגידול בתוספת של FGF הבסיסי של 10 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל בניסויים vivo, אנו מזריקים 5x10 5 תאים לכל שריר ת&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קצירת myoblasts, אנו לנתק את התאים באמצעות 0.25% טריפסין / EDTA לשטוף אותם עם PBS פעמיים. המספרים תא נספרים עם hemocytometer לבין תאים resuspended ב HBSS בריכוז של 5x10 4 תאים / μl. התאים מרוכזים HBSS ממוקמות על קרח מוזרק בתוך שעה 1 אחרי האוסף. </li></ol> In vivo הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכר עכברים MDX בגיל 4-6 שבועות הם שנרכשו ג&#39;קסון מעבדה ומתוחזק במתקן דיור בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כשבוע של התאמה לסביבה, העכברים הם מוכנים להיות מושתל עם תאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השתלת תאים, העכבר הוא מורדם באמצעות זריקה (IP) intraperitoneal תערובת של קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו Xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג). ואז השיער מסביב לאזור השריר ת&quot;א יוסר על ידי יישום נאיר ברגל ומחכים 30 שניות כדי למחוק אותו עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סמן העכבר נמצא עדיין תחת הרדמה, 5x10 5 תאים HBSS 10μl מוזרקים לאט 3 נקודות באמצעות מחט מד 30 לתוך כל שריר ת&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלב 4, העכבר ניתן הדמיה באופן קבוע על ידי in vivo פלואורסצנציה הדמיה. פלואורסצנציה הדמיה תחנת NightOwl LB981 (ברטולד Technologies, Inc), מצויד במצלמה גבוה תשלום מצמידים רגיש, משמש כדי להשיג תמונות מן לעכב את הרגליים של העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום in vivo הדמיה, אנחנו הראשונים לבדוק את לצמיחה מחודשת שיער על השריר ת&quot;א. אם יש צורך, אנחנו נאיר להחיל מחדש כדי להסיר את השיער כפי שתואר לעיל, לאחר הרדמה העכבר בתערובת של קטמין ו Xylazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סמן העכבר נמצא תחת הרדמה, אנחנו במקום העכבר אפרקדן על פיסת נייר לא פלורסנט שחור (שחור נייר Artagain מ Strathmore). כדי לחשוף באופן מלא את השריר ת&quot;א הדמיה טוב יותר, אנו הקלטת הכפות האחוריות אל הנייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו שמים את העכבר בתא הדמיה עמדת רגל אחורית להיות צילמו במרכז שדה הראייה של המצלמה. אנחנו הראשונים לעבור את מסנן הפליטה לצלם המסורתית אפורים בקנה מידה הצילום של הרגל עם זמן חשיפה של 5 שניות. להתקין מחדש את המיקום של העכבר למקד את המצלמה במידת הצורך. הפרמטרים הדמיה כולל זמן החשיפה (1,250 ms), גובה הדגימה (0.9 ס&quot;מ) וכו &#39;נשמרים קבוע בתהליך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מכן לעבור במסנן פליטה מתאים אורך הגל הירוק חלבון פלואורסצנטי. אנחנו לוקחים תמונה פלואורסצנציה עם זמן חשיפה של 1,250 ms ומספר binning של 1. לאחר הדמיה, עכבר נמחקת תא הדמיה לכלוב לחכות להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח, נעביר האזור של עניין (ROI) על אותות ניאון כדי למדוד את העוצמה שלהם במונחים של פוטונים בשנייה. אנחנו גם למדוד את גודל ההחזר על ההשקעה במונחים של מספר הפיקסלים כערך אחר כימות. הניסויים הדמיה ניתן לחזור כל שבוע או בתדירות גבוהה יותר על פני כמה חודשים, במידת הצורך, לרכוש נתונים האורך. </li></ol> בתום הניסויים, העכבר הוא להרדים את השריר ת&quot;א שנקטפו לניתוח היסטולוגיה.

<ol><li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li>
<li>Green, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li>
<li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li>
<li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li>
<li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 Forthcoming.</li>
<li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li>
<li>In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li>
<li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+I.+A+histological%2C+morphometric+and+biochemical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li>
<li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li>
<li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li>
<li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li>
<li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li>
<li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells%2C+bone+marrow+cells%2C+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li>
<li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient%2C+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li>
</ol>

אנו מקימים פלטפורמה אמינה ויציבה הדמיה למעקב אחר הקרינה על התאים המושתלים שכותרתו בשריר השלד מארח במחקר זה. GFP-שכותרתו myoblasts מ-GFP עכבר מהונדס מייצג סוג של בתאי גזע בוגרים שיהיו מועמדים טיפול בתא בעתיד. מניפולציה קבוע כולל מספר התאים, הזרקת תאים, רקע ברור, עמדה הדמיה פרמטר מכונת חשוב להשגת תמונה באיכות גבוהה במיוחד עבור ניתוח כמותי. פלואורסצנטי הדמיה יש יישומים רבים במחקר ביו כפי שהוא אינו פולשני, קל לשימוש, ויש לו קצב העברת נתונים גבוה. בנוסף דימות פלואורסצנטי יכול לספק מדידה כמותית המבוססת על ספירת פוטון, אם כי בשל הנחתה פיזור, קליטה, האור לא יכול לחדור מרחק גדול רקמות, המהווה חיסרון של השיטה. מאמצים כבר בעיצומן להשתמש כתב אדום או קרוב אינפרא אדום כדי להגדיל את עומק החדירה של האור. יתרון נוסף של דימות פלואורסצנטי היא שזה לתרגום למרפאות אם הכתב ניאון ספציפיים מאושר לשימוש האדם. לעומת MRI, CT, ו PET, פלואורסצנציה הדמיה יש גמישות גבוהה כפי שהוא אינו דורש חומרה יקרה וסוכני הדמיה. דוגמה אחת היא הקרינה מבוססי אנדוסקופ מיקרו אנדוסקופ שנוצלו במרפאות. על ידי שילוב של דימות פלואורסצנטי עם שיטות אחרות, אנו מצפים להשיג את היכולת לרכוש גם מידע אנטומי ותפקודי על התהליכים הביולוגיים הבסיסיים.

<table><tbody><tr><td>NightOwl LB981</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי in vivo פלורסנט הדמיה

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Dystrophies שרירים הן קבוצה של מחלות שרירים ניוונית המאופיינת אובדן הדרגתי של בתאי שריר התכווצות. נכון לעכשיו, אין טיפול מרפא זמין. התפתחויות אחרונות ביולוגיה של התא גזע יצרו תקוות חדשות לפיתוח טיפולים יעילים תא מבוסס לטיפול במחלות אלה. השתלה של סוגים שונים של בתאי גזע שכותרתו עם חלבוני ניאון לתוך שרירי במודלים של בעלי חיים dystrophic נעשה שימוש רחב בתחום. טכניקה לא פולשנית עם יכולת לעקוב אחר גורל התא המושתל longitudinally יכולים להמשיך ביכולת שלנו להעריך engraftment שריר על ידי התאים המושתלים באופן מדויק יותר וביעילות. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים כי in vivo פלואורסצנציה הדמיה היא שיטה רגישה ואמינה למעקב אחר המושתלים GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) שכותרתו תאים עכבר שרירי השלד. למרות החשש על רקע עקב השימוש של אור חיצוני הכרחי עירור של חלבון פלואורסצנטי, מצאנו כי באמצעות העכבר או עירום או ביטול השיער עם חומרים כימיים להסרת שיער רב של בעיה זו מתבטלת. שימוש במצלמת CCD, האות ניאון ניתן לאתר את השריר הקדמי (ת&quot;א) tibialis לאחר הזרקה של 5 x 10 5 תאים משני העכברים הטרנסגניים GFP או eGFP transduced תרבות myoblast. עבור השרירים השטחיים יותר כגון extensor digitorum longus (אדי), הזרקה של תאים פחות מייצר אות לזיהוי. עוצמת האות ניתן למדוד לכמת כמו מספר של פוטונים הנפלטים בשנייה באזור של עניין (ROI). מאז רכשה את התמונות להראות גבולות ברורים התוחם את האזור engrafted, בגודל של ההחזר על ההשקעה ניתן למדוד גם. אם הרגליים ממוקמות באופן עקבי כל הזמן, השינויים המספר הכולל של פוטונים לשנייה לכל שרירים בגודל של ההחזר על ההשקעה משקפים את השינויים במספר התאים engrafted ואת גודל השטח engrafted. לכן השינויים בשריר אותו לאורך זמן הם לכימות. In vivo טכניקת דימות פלואורסצנטי שימש בעיקר כדי לעקוב אחר הצמיחה של תאים tumorogenic, המחקר שלנו מראה כי זהו כלי רב עוצמה המאפשר לנו לעקוב אחר גורלם של בתאי גזע המושתלים.

אנו מתארים<em&gt; In vivo</em&gt; פלואורסצנציה הדמיה פרוטוקול לפקח התחדשות שריר על ידי ה-GFP שכותרתו myoblasts לאחר ההשתלה לתוך שרירי השלד של עכברים בריאים הן dystrophic. פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד התחדשות שריר על ידי השתלה של סוגים אחרים של תאים בתנאים שרירים אחרים גם כן.

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

דיסטרופיות שרירים הן קבוצה של מחלות שרירים ניווניות המאופיינות באובדן פרוגרסיבי של תאי שריר כיווץ. נכון להיום, אין...

שלום, אני Juwan Ma מהמחלקה להרדמה בבית החולים Bergham Women's בבוסטון. היום נדגים לכם טכניקה לרכישת תמונות פלואורסצנציה in vivo כדי לנטר את התקדמות התחדשות השרירים בעכברים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשתבצת של תאי גזע שריריים מושתלים.אם כך, נתחיל. תאים המסומנים ב-GFP להשתלה מבודלים ומגודלים מעכברי GFP טרנסגניים. לפני ההמשך, צביטה בבוהן מאשרת שהעכבר נמצא תחת הרדמה מלאה. לאחר מכן מסירים את שרירי הרגל האחורית. בתנאים אספטיים, השריר נמעך.תאים לווייניים מופרדים על ידי דגירה של הרקמה הגרוסה עם תמיסת collagenase בריכוז 2% בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, מתווסף מצע גידול המכיל ham F 10 ו-20%FBS כדי לעצור את העיכול האנזימטי. לאחר מכן, השרירים מופרדים באמצעות טריטורציה חוזרת עם פיפטה.בשלב הבא מסננים את התאים דרך מסננת תאים ולאחר מכן זורעים אותם בצלחת תרבית לא מצופה. את הצלחת מניחים באינקובטור סטנדרטי לתרבית תאים למשך שעה אחת. כדי להפריד תאי לוויין (satellite cells) מאוכלוסיות תאים אחרות בעלות תכונות היצמדות חזקות יותר, שופכים את הנוזל העליון (supernatant) לצלחת מצופה בקולגן, ומדגירים למשך שעה נוספת.לאחר אינקובציה זו, מסירים שוב את העלייה (supernatant) המועשרת בתאי לוויין ומעבירים אותה לצלחת חדשה מצופה בקולגן, שם היא תגודל עד להופעת מושבות של מיובלסטים. תהליך זה מכונה prepl. התאים מועברים (passaged) עם הגעה ל-60 עד 70% של התמזגות תאית (cellular confluence). חלק קטן מהתאים משמש לאימונו-ציטוכימיה, תוך צביעה במסמני תאים מיוגניים כדי לאמת את טוהר תאי השריר בתרבית.לאחר אישור טוהר התאים המיוגניים, התאים מורבים באותם תנאי תרבית. לקראת השתלה, התאים מופרדים באמצעות Trypsin-EDTA בריכוז 0.25%. התאים נשטפים פעמיים ומוסבסים מחדש ב-HBSS בריכוז של 5×10⁷ תאים למילליליטר, ולאחר מכן מוזרקים 10 µL מתמיסת התאים לכל שריר tibialis anterior (או TA).עבור דימות in vivo, מיובלסטים המסומנים ב-GFP מושתלים תחילה בעכברים זכרים בני ארבעה עד שישה שבועות. העכבר הרדמתו באמצעות קטמין וקסילזין, והפרוצדורה התחילה לאחר אישור מצב ההרדמה. כדי להפחית רעשי רקע, השיער בשתי הרגליים האחוריות הוסר על ידי מריחת nare על הרגליים והמתנה של 30 שניות לפני ניגובו.בשימוש במקלון צמר, נגב שוב את הרגליים באמצעות מקלון צמר חד טבול במים מזוקקים כדי להסיר שאריות של רירית האף ושיער לפני השתלת התאים בעכבר. ראשית, שאב למזרק המילטון חמש פעמים 10⁵ תאים ב-10 µL של HBSS. באמצעות מחט בכיול 30 gauge, הזרק מספר שווה של תאים לשלושה מיקומים לאורך הציר הארוך של שריר ה-TA: החלק העליון, המדיאלי והחלק התחתון.לאחר כל הזרקה, השאר את המחט במשך שתי דקות לפני שבירתה מהשריר כדי למנוע דליפה לאורך מסלול המחט. במהלך זמן ההמתנה, שאב את אותה כמות של תאים למזרק אחר והזרק אותם לשריר ה-TA בצד הנגדי באופן דומה. לאחר הזרקות התאים, הנח מיד את העכבר במצב שכיבה על הבטן על דף נייר שחור שאינו פלואורסצנטי, קבע את שתי הרגליים אל הנייר, כאשר כפות הרגליים פונות כלפי מטה והרגליים פרוסות בזווית של 90 מעלות זו מזו. לאחר מכן, הנח את העכבר בתא של תחנת דימוי פלואורסצנטי Night Owl, דגם LB 9 81.בעזרת מצלמת CCD רגישה במיוחד, ממוקמת רגל אחורית אחת במרכז שדה הראייה של המצלמה. ראשית, צלם תמונת גווני אפור מסורתית של הרגל. כדי להתחיל בדימות, נבחר מסנן פליטה מתאים באורך גל ספציפי עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק.צלמו תמונה אחת בחשיפה של 1,250 milliseconds ולאחריה תמונה נוספת בחשיפה של 500 milliseconds. ניתן לראות שזמן חשיפה ארוך יותר מאפשר גילוי של אות חלש, בעוד שחשיפה קצרה יותר חושפת פרטים רבים יותר. לאחר הצילום של רגל אחורית אחת, מקמו את הרגל האחורית השנייה במרכז שדה הראייה של המצלמה וצלמו רגל זו באופן דומה לזה שהודגם קודם לכן.על מנת להבטיח תוצאות ברי-השוואה, גובה הדגימה חייב להישאר ללא שינוי. לאחר הדמיה, העכבר מוחזר לכלוב ותהליך התאוששותו מההרדמה מנוטר. לצורך ניתוח, מסומן אזור עניין (ROI) מעל האותות הפלואורסצנטיים כדי למדוד פוטונים לשנייה.מדדנו גם את גודל אזור העניין (ROI) במספר פיקסלים כדי לקבל ערך כמותי נוסף עבור נתונים לאורך זמן; ניתן לחזור על ניסויי הדימוי בימים או בשבועות שונים לפי הצורך. בניסויים, תמונה פלואורסצנטית של רגל אחורית של עכבר שצולמה ביום שבו הוזרקו התאים המסומנים ב-GFP הראתה עוצמת אות גבוהה. עוצמת האות ירדה ביום השני ולאחר מכן עלתה לרמה יציבה עד היום השביעי, ה-14 וה-21. כאשר שינויים אלו בפלואורסצנציה כומתו על ידי מדידת עוצמת האות כפוטונים לשנייה, הבחנו בירידה ניכרת בעוצמת האות יום לאחר ההזרקה, מה שמשקף ירידה במספר התאים החיוביים ל-GFP.עם זאת, עד היום השביעי, ה-14 וה-21, עוצמת האות עלתה לרמה יציבה המעידה על כך שהתרחשה רגנרציה של השריר. הרגשנו להדגים לכם כיצד להשתמש בדימוי פלואורסצנציה in vivo כדי לנטר את התקדמות הרגנרציה של השריר לאחר הזרקת תאים מסומנים ב-GFP. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים לחקור את הדינמיקה של רגנרציה של השריר לאחר הזרקה של סוגים שונים של תאים מסומנים פלואורסצנטית.מכיוון שניתן לרכוש תמונות באופן לא פולשני במרווחי זמן קבועים, ניתן לאסוף נתונים לונגיטודינליים מדויקים יותר עם פחות בעלי חיים ועומס עבודה נמוך יותר. כאשר משתמשים בפרמטרי מדידה קבועים, תמונות מאותם בעלי חיים לאורך זמן צריכות להיות ניתנות להשוואה כמותית. כדי להפחית את הרעש ברקע, חשוב ביותר לשמור על פני עור נקי מעל השריר; חיוני לחלוטין להסיר את כל הפרווה המכסה את הרגליים ולניגוב יסודי של האזור באמצעות מקלוני צמר גפן או פדים.וזכרו, אל תשכחו להשתמש באותה קבוצת פרמטרים בכל פעם כדי להבטיח עקביות בין כל המדידות שלכם. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

tracking-dynamics-muscle-engraftment-small-animals-vivo-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal של שתלי הסלולר מכרסם במוח באמצעות: (i) ביולומינציה vivo ו הדמיה באמצעות תהודה מגנטית, ו (ב) הודעה מורטם ניתוח היסטולוגית. השילוב בין שיטות הדמיה על חיה אחת מאפשר הערכה שתל נייד עם רגישות גבוהה רזולוציה, וספציפיות.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול להשתלת תאי סרטן לבלב המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק באופן אורתוטופי בלבלב העכבר. מודל העכבר האורתוטופי מסייע בחקירת יעילותם של טיפולים חדשניים על גידולים ראשוניים וגרורתיים.

מודל עכבר אורתוטופי פלואורסצנטי: השתלת GFP המבטא תאים סרטניים בעכבר להערכת התקדמות הגידול ב- Vivo

אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש...

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות תא-stroma הגידול בתוך גרורות ריאה, ניצול כתבים ניאון בעכברים. באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאים חיים לפחות 4 שעות ויכול להיות מותאם ללמוד תנאים ריאות דלקתיות אחרות.

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

אנו מתארים פרוטוקול לצורך מעקב פרה ויוו של גרורות סרטן. הוא מבוסס על עיתונאי רדיונוקלידים-זריחה שילוב של סודיום יודיד symporter, זוהה על ידי פולשני [18נ] tetrafluoroborate-PET, חלבון פלואורסצנטי לאישור מפושטת ex-vivo . השיטה זו ישימה עבור פרה ויוו תא מעקב מעבר הגידול ביולוגיה.

רדיונוקלידים-זריחה מדווח הדמיה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול במודלים הגידול מכרסמים

כאן נשתמש זוהרים, רנטגן, והדמיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/שחושב טומוגרפיה ללמוד איך מעכבים פעילות mTOR משפיעה על engrafted-מח עצם מיאלומה גידולים במודל xenograft. דבר זה מאפשר ניתוחים פיזיולוגית הרלוונטיים, לא פולשנית, והן עם מודאלים מרובים של מיאלומה נגד ההשפעה של טיפולים מיקוד engrafted מח עצם מיאלומה גידולים ויוו.

הדמיה עם מודאלים מרובים זוהרים, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית טומוגרפיה של מיאלומה נפוצה מח עצם Xenografts בעכברים ליקר ביצים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור live-הדמיה של fluorescently שכותרתו קטעי רירית הרחם האנושי הושתל בעכברים. השיטה מאפשרת ללמוד את השפעות הסמים על גודל הנגע endometriotic באמצעות ניטור, כימות של זריחה הנפלטים על ידי הכתבת פלורסנט בזמן...

ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

מאמר זה מפרט כיצד לבצע in vivo (באמצעות מערכי אלקטרודות משטח ומחט) ו- ex vivo (באמצעות תא דיאלקטרי) מיופיוגרפיה של עכבה חשמלית על שריר גסטרוקנמיוס המכרסמים. הוא ידגים את הטכניקה הן בעכברים והן בחולדות ויפרט את השינויים הזמינים, (כלומר, בעלי חיים שמנים, גורים).

ביצוע מיוגרפיה של עכבה חשמלית In Vivo ו - Ex Vivo במכרסמים

למדו הדמיית פלואורסצנט in vivo לניטור דינמיקת השתרשות תאי שריר GFP בעכברים. שיטה זו מאפשרת מחקר לוואי של תהליכי התחדשות שריר בבעלי חיים קטנים.

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

גלה סרטונים נוספים