Name: יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-17T16:04:00.000+00:00
Duration: 21 min 1 s
Description: למדו ליצור עוברים כימריים בדג הזברה (Danio rerio) על ידי השתלת תאים בשלבי הבלסטולה או הגסטרולה. שיטה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים ואינטראקציות תאיות בהתפתחות העוברית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תודה לחברי במעבדה Moens עבור קלט מועיל במהלך כתיבת מאמר זה. HK הוא פוסט דוקטורט נתמך על ידי NIH / NICHD מענק # 5R01HD037909-08. CBM הוא חוקר עם הווארד יוז רפואי במכון.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+developmental+potential+of+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo.</a> Trends Genet. 4, 68-74 (1988).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ-cell+development%3A+the+zebrafish+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective.</a> Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124, 3157-3165 (1997).</li>
<li>Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+nanos-related+gene+is+essential+for+the+development+of+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells.</a> Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).</li>
<li>Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissues+and+patterning+events+required+for+distinct+steps+in+early+migration+of+zebrafish+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells.</a> Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+by+attraction+towards+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target.</a> Development. 129 (1), 25-36 (2002).</li>
<li>Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).</li>
<li>Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+zebrafish+pbx+proteins+reveals+a+hindbrain+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state.</a> Dev Cell. 3, 723-733 (2002).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).</li>
<li>Blaser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
</ol>

הקלות שבה השתלה ניתן להשתמש כדי לייצר מפלצות ממוקד היא אחת המעצמות הגדולות של דג הזברה כמודל החולייתנים. שינוי של פרוטוקול זה לא שתואר לעיל מאפשר ניתוח של תפקוד הגן האימהי עבור הגנים עם תפקידים חיוניים להתפתחות zygotic. מאחר דגים מוטנטים לא יכולים לשרוד עד לבגרות, יש צורך להעביר את germline מוטציה לעובר wild-type אחרת המארח, יצירת &quot;שיבוטים germline&quot; של תאים מוטנטים. יצירת פסיפסים germline כולל השתלת בתאי הנבט בראשיתי מתורם מוטציה לעובר wild-type שורה. בניגוד לכל שושלות ת...

ריאגנטים: מתכונים רבים של חומרים כימיים המשמשים נהלים אלה נמצאים בספר דג הזברה, אשר זמין באינטרנט מלא <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> . מתכונים ניתנים לשם הכנת מים, דגים, בינוני העובר עם או בלי אנטיביוטיקה, עבור pronase, dextrans dechorionating ניאון, ו תאית מתיל.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

אחד הכלים החזקים ביותר בשימוש כדי לקבל תובנה תהליכים התפתחותיים מורכבים היא ניתוח של עוברים chimeric. הכימרה מוגדר אורגניזם המכיל תאים מבעל חיים אחד או יותר; פסיפסים הם סוג אחד של הכימרה, שבו תאים גנוטיפ יותר מעורבים, בדרך כלל wild-type ו מוטציה. בשנת דג הזברה, מפלצות יכול להתבצע בקלות על ידי השתלה של תאים מעובר לעובר התורם מארח בשלב העוברי המתאים. תאים התורם תווית מופקים על ידי הזרקת סמן השושלת, כגון פלורסנט לצבוע, לעובר אחד תא הבמה. תאים התורם תווית יוסרו מעוברים התורם הוכנס עוברים לארח ללא תווית באמצעות נפט שבשליטת פיפטה זכוכית רכוב על תרכובת מיקרוסקופ או לנתח. תאים התורם יכול במקרים מסוימים להיות ממוקד לאזור ספציפי או רקמות של העובר המתפתח blastula או gastrula מארח שלב על ידי בחירת האתר השתלת העובר מארח מבוסס על ומבוססת מפות גורל.

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

אחד הכלים העוצמתיים ביותר המשמשים להשגת תובנות לגבי תהליכי התפתחות מורכבים הוא ניתוח של עוברים כימריים. כימרה מוגדרת כ...

שלום, אני הילרי קמפ מהמעבדה של ססיליה אוונס. ואני ססיליה אוונס. הילרי ואני נמצאות בחטיבה למדעים בסיסיים במרכז לסרטן פרד האצ'ינסון בסיאטל.היום נדגים לכם טכניקה ליצירת עוברים כימריים של דגים זברופיש (zebrafish), המכונה גם פסיפס גנטי. הליך זה מאפשר לנו להעריך את הבסיס התאי של תפקוד גנים במהלך ההתפתחות. אנו יכולים לבחון האם גן מסוים פועל בתוך תאים בעלי פנוטיפ מוטנטי, תפקוד המכונה תפקוד אוטונומי לתא (cell autonomous function), או בתוך הסביבה של תאים אלו, תפקוד המכונה תפקוד שאינו אוטונומי לתא (cell non autonomy).אנו יוצרים פסיפסים אלו על ידי השתלת תאים בין עוברים מסוג בר (wild type) לעוברים מוטנטיים, בשלב הבלסטולה או בשלב מוקדם של הגסטולציה. לאחר מכן, אנו מעריכים את תפקוד הגן על ידי תצפית על הפנוטיפ והגנוטיפ של התאים שהגיעו מהתורם בתוך סביבת המאכסן שלהם. אז בואו נתחיל.בחלק זה של הפרוטוקול, מוזרק צבע שושלת (lineage dye) לעובר התורם, כדי שניתן יהיה לעקוב אחר גורלן של תאים שמקורם בתורם לאחר השתלה. ניתן להזריק בכל פעם סוגים שונים של חומצות גרעיניות באמצעות טכניקה זו; עם זאת, יש להשמיט את שלב הסימון (decoration) בעת הזרקת DNA. לפני העבודה עם העוברים, הכינו את צלחת ההזרקה על ידי החדרת שלב זכוכית בזווית של 45 מעלות בחלק הרחב ביותר של פטרי, מלאה עד לשלושה רבעים ב-1.2% aros in pen strep embryo me

generating-chimeric-zebrafish-embryos-by-transplantation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דג הזברה השתלת מאפשר שילוב של גנטיקה אמבריולוגיה ליצור מפלצות רקמות ספציפיות. וידאו זה מדגים gastrula מבוים השתלות תא אפשרו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקידים של אוכלוסיות astroglial ו רמזים הנחיות ספציפיות במהלך היווצרות השליכה בקידמתו.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. וידאו זה מציג צעד אחר צעד נהלים כיצד לתפעל עוברים medaka, כולל dechorionation, גובר agarose עבור הדמיה השתלת תאים לייצור מפלצות. נהלים אלה הם חיוניים כדי להשתמש medaka ו דג הזברה במעבדה כדי לנצל את מלוא היתרונות של התכונות המשלימות שלהם לנתיחה הגנטי של פונקציות הגנום החולייתנים.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב כיצד ליצור עוברי דג זברה פרביוטיים מרקע גנטי שונה. בשילוב עם יכולות ההדמיה שאין שני להן של עובר דג הזברה, שיטה זו מספקת אמצעי רב עוצמה ייחודי לחקור פונקציות אוטונומיות של תאים לעומת פונקציות לא אוטונומיות של תאים עבור גנים מועמדים מעניינים.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

למדו ליצור עוברים כימריים בדג הזברה (Danio rerio) על ידי השתלת תאים בשלבי הבלסטולה או הגסטרולה. שיטה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים ואינטראקציות תאיות בהתפתחות העוברית.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

גלה סרטונים נוספים