יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

היי, אני הילרי קמפ מהמעבדה של ססיליה אוונס. ואני ססיליה אוונס. הילרי ואני במחלקה למדע בסיסי במרכז לחקר הסרטן ע"ש פרד האצ'ינסון בסיאטל.

היום אנו הולכים להראות לכם טכניקה להכנת עוברי דג זברה כימריים, הידועים גם בשם פסיפסים גנטיים. הליך זה מאפשר לנו להעריך את הבסיס התאי של תפקוד הגנים במהלך ההתפתחות. אנו יכולים לשאול אם גן נתון מתפקד בתוך התאים עם פנוטיפ מוטנטי המכונה פונקציה אוטונומית של התא, או בתוך סביבת התאים הידועה כאי-אוטונומיה של התא

אנו מייצרים פסיפסים אלה על ידי השתלת תאים בין עוברים מוטנטיים מסוג בר בשלב בלסטולה או בשלב גסטרו מוקדם. לאחר מכן אנו מעריכים את תפקוד הגנים על ידי התבוננות בפנוטיפ ובגנוטיפ של תאים שמקורם בתורם בסביבת המארח שלהם. אז בואו נתחיל.

בחלק זה של הפרוטוקול, מוזרק צבע שושלת לעובר התורם כך שניתן יהיה לעקוב אחר גורלם של תאים שמקורם בתורם לאחר ההשתלה. ניתן להזריק כל מגוון של חומצות גרעין גם בטכניקה זו, עם זאת, השמיט את שלב הקישוט בעת הזרקת DNA לפני העבודה עם העוברים, הכין צלחת הזרקה על ידי הכנסת שקופית זכוכית בזווית של 45 מעלות על פני החלק הרחב ביותר של צלחת פטרי. שלושה רבעים מלאים ב-1.2% במדיום עוברי של עט סטרפטוק.

הסר את השקופית לאחר שהאגרו מתייצב ליצירת שוקת משופעת. מלאו את השוקת במדיום עובר של עט סטרפטוקוקוק. כעת המשך עם הקישוט האנזימטי של עוברים בשלב תא אחד.

דגרו על העוברים בשלב התא האחד למשך דקה עד חמש דקות ב-0.5 מיליגרם למיליליטר. תמיסת פרונאז. עקוב אחר הקישוט מקרוב.

ברגע שהקוריון מתחיל לקרוס באופן גלוי, טבלו את העוברים במי המערכת וזה שופך את כל הקוריום והעוברים נשארים מאחור בתחתית עקומת המקור. וזה באמת חשוב שהעוברים לא יפגעו לפני המים רק פעם אחת נוספת, ורובם יכרו את הקוריון שלהם. יש כמה מסתחררים מבחוץ שלא.

אם משהו עדיין נמצא בקוריון שלו, אז פעולת הפיפטינג שלהם כך תוציא אותם החוצה ואז תשחרר את העוברים כך שהם לעולם לא יפגעו לפני המים. חשוב לטפל בעוברים מצופים עם פיפטה מלוטשת באש כדי להחליק את קצוותיה. העבירו בעדינות את העוברים המצופים דק השברירי לתוך שוקת צלחת ההזרקה באמצעות פיפטת זכוכית מלוטשת באש רחבה.

ואז אנחנו טוענים קובץ בודד לתוך שוקת זו. כעת העוברים מוכנים להזרקה עם סמן שושלת באמצעות אש מכוילת במדויק, פיפטת הזרקת זכוכית משוכה ומתקן הזרקת לחץ. אנחנו הולכים להשתמש בצלחת מלאה במדיום עוברי כדי לשבור את המחט ובצלחת מלאה בשמן כדי לכייל את המחט.

זהו רק שמן מינרלי רגיל בדרגת מעבדה. אנו לוקחים זוג מלקחיים מושחזים של שענים ולאחר מכן תוך כדי הסתכלות דרך חלקי העיניים כדי לקבוע מה יהיה הגודל הנכון, אנו שמים את המלקחיים משני צידי המחט ואז אנו מנתקים בעדינות את השבב, מה שאני לא יכול לעשות בלי להסתכל כדי לקבוע את נפח הצבע או הריבונוקלאוטיד המועבר. לפני שמתחילים.

מדוד את גודל הבולוס בצלחת שמן מינרלי. יש לנתק את המחט כך שיועבר, בולוס של ננוליטר אחד, עם פולס אחד או שניים של מזרק המיקרו. ניתן לחשב את נפח הבולוס מקוטרו כפי שנמדד על ידי מיקרומטר עינית.

הזריק ננוליטר אחד של תמיסה של 1 עד 3% של דקסטרן פלואורסצנטי ישירות לתוך העוברים המצופים בין שלב התא האחד לארבעה. מה שאני הולך לעשות זה למקם את העובר ממש מתחת למחט. אני הולך לדחוף את המחט בעדינות למרכז החלמון וללחוץ על דוושת הרגל.

לאחר ההזרקה, חשוב להזריק לזרמי החלמון כך שהצבע יועבר לתאים. זריקה זו תספיק כדי לעקוב אחר תאים בעוברים כימריים במשך מספר ימים של התפתחות. באופן אידיאלי, אנו עושים זאת לפני שהתאים מגיעים לשלב ארבעת התאים, מגדלים את העוברים המוזרקים בצפיפות נמוכה בצלחת פטרי מצופה מלאה בעובר עט טרי. בינוני.

שימו לב שעוברים מוזרקים נוטים להיות בעלי קצב התפתחות מואט מעט, לדגור על עוברים בטמפרטורות שונות, 25, 28 ו-31 מעלות צלזיוס כדי לזעזע את התפתחותם ולמקסם את חלון הזמן שבו ניתן לבצע השתלות. המנגנון המשמש להשתלת תאים בבלסטולה של דג הזברה מורכב ממזרק המילטון מבוקר כונן המחובר על ידי זין עצירה תלת-כיווני למאגר שמן מינרלי ולמחזיק מיקרו פיפטה דרך אורך צינור גמיש. הסר את כל בועות האוויר מהמערכת מכיוון שהן יהרסו את היכולת שלך לשלוט על היניקה והלחץ.

השתמש במיקרוסקופ סטריאו בעל אופטיקה באיכות גבוהה של הגדלה DX לפחות. כדי לשלוט במיקום של מחזיק המיקרו פיפטה והמחט, אנו מציעים מניפולטור מיקרו ידני של NARA. ודא שהוא מקובע לספסל באמצעות בסיס מגנטי כדי למנוע העברת רעידות להשתלה.

מחטי השתלת מחט עשויות מפיפטות נימי זכוכית הנמשכות להתחדדות עדינה על קוטב אלקטרודה. ראה את פרוטוקול JoVE מהמעבדה של מרים גודמן לפרטים על משיכת פיפטות תחת מיקרוסקופ ניתוח, שבור קצה המחט שנשלפה. עבור השתלות שלב בלסטולה, הקוטר החיצוני של המחט צריך למדוד כ-50 עד 60 מיקרון או 30 עד 40 מיקרון להעברה בשלב גסטרו.

להעברת שלב גסטרו כדי לשפר את החדירה, יש למשוך תחילה דוקרן חד בקצה המחט באמצעות מיקרו מספוא, להחליק את קצה המחט על ידי קירוב לחוט המיקרו. לאחר מכן סובב את המחט כך שהקצה המוביל של השיפוע יוכל ליצור מגע עם הנימה. ברגע שהקצה המוביל של המחט נוגע בחוט, משוך אותו במהירות כדי ליצור דוקרן.

כדי למנוע פגיעה בתאים, הדוקרן צריך להיות ישר וקצה המחט לא צריך להתעקל עם הכנת האסדה ומחטי ההשתלה, אתה מוכן ליצור עוברים כימריים. השתלות בלסטולה משמשות להשתלת תאים בין עוברים כאשר אין צורך במידע על מפת גורל עדין. למעט תאי נבט קדמוניים, רוב התאים בדרך כלל אינם מחויבים לגורל בשלב זה.

מפת הגורל של הבלסטולה היא כזו שנוכל להבחין בין תאים שהולכים להוליד אקטודרם לבין תאים שהולכים להוליד מזודרם. המזודרמלי והאנדודרמלי שוכנים ליד שולי העובר בשלב הבלסטולה, ואילו אבות עוריים, שהולכים להוליד את מערכת העצבים ואת העור פני השטח, נמצאים רחוק יותר משולי העובר. לכן כאשר אנו משתילים תאים בעוברים בשלב הבלסטולה, אנו יכולים למקד את התאים הללו למזודרם המשוער או לאקטודרם המשוער.

אבל אנחנו לא יכולים לכוון תאים לאזור מסוים של האקטודרם או של המזודרם כי אנחנו לא יודעים. בשלב הבלסטולה שבו נמצא הצד הגבי של העובר, הכינו מראש כלי הזרקה על ידי הצפת תבנית פלסטיק עם שורות זוגיות של בליטות בצורת טריז בצלחת פטרי, חצי ממולאת ב-1.2% מותך במדיום עוברי. לאחר שהארוס התמצק, הסר את התבנית והשאיר שורות של בארות בצורת משולש שכל אחת מהן גדולה מספיק כדי להכיל עובר אחד.

מלאו את תבנית ההשתלה במדיום עובר עט, והעמיסו עוברים בשלב הבלסטולה בנפרד לכל באר בעזרת פיפטת זכוכית מלוטשת באש. כעת העבירו את העוברים לבארות ההשתלה בתחילה אפשרו להם לשכב על צדם. סדרו את העוברים כך שהעוברים התורמים יונחו בעמודה אחת והעוברים המארחים יונחו במורד העמודה הסמוכה.

מקם את המנה על הבמה כך שכאשר מחט ההשתלה נכנסת לעובר, המחט דוחפת את העובר אל הקיר האחורי של הבאר שלו. בעזרת המניפולטור המיקרו, הורד את מחט ההשתלה לתוך הכלי בזווית תלולה למדי. באופן אידיאלי, מחט ההשתלה צריכה להיכנס לעובר בזווית של כ-45 מעלות.

ברגע שקצה המחט נמצא מתחת לפני השטח של המדיום העוברי, משוך כמות קטנה של מדיום עוברי לתוך המחט על ידי סיבוב כונן המיקרומטר השולט במזרק המילטון. לבקרה המדויקת ביותר, הממשק בין השמן המינרלי למדיום העוברי צריך להישאר בחלק המחודד הדק של המחט, לא קרוב מדי לקצה. מקם בעדינות את העובר התורם עם המחט ולאחר מכן משוך את המחט לאחור והיכנס למכסה הבלסטולה של העובר במיקום הרצוי.

מכה חזקה ומהירה תחדור לעובר מבלי לגרום לו להתגלגל. שאב תאים תורמים לאט ובזהירות לתוך המחט כדי למנוע גזירה של התאים. הימנע מהכנסת חלמון למחט לאחר קליטת מספר התאים הרצוי.

הפוך מעט את הלחץ כדי לעצור את היניקה והסר את המחט מהביא את העובר המארח למקומו. על ידי הזזת צלחת ההשתלה, ניתן לבצע התאמות קטנות למיקום העובר המארח על ידי סיבובו בעדינות באמצעות מחט ההשתלה כל עוד מקפידים לא לגעת בחלמון. בעת הוצאת תאי התורם לעובר המארח, הימנע מלקיחת אילק לעובר מכיוון שהדבר יפגע ויהרוג את תאי התורם מעובר תורם יחיד שניתן להשתיל למספר מארחים לאחר השלמת העברות התאים.

העבירו את זוגות המארחים התורמים לבארות המצופות של צלחת 24 בארות כדי להמשיך להתפתח. היוצא מן הכלל היחיד לכלל של תאים שאינם מחויבים לגורל מסוים בשלב הבלסטולה הוא תאי הנבט הקדמוניים. תאי תאי נבט קדמוניים מוגדרים בשלב מוקדם מאוד בהתפתחות ומחויבים לגורל מצב תאי הנבט הקדמוניים שלהם.

משלב מוקדם מאוד, תאי הנבט הקדמוניים שוכנים ליד השוליים של בלסטולה ועובר בשלב הקיבה. אז אם המטרה של ניסוי ההשתלה היא להשתיל תאי נבט קדמוניים, אז חשוב מאוד מהיכן מגיעים התאים בעובר התורם ולא חשוב לאן הם הולכים לעובר המארח. אז הכלל הוא שעבור תאים סומטיים, חשוב לאן הם הולכים בעובר המארח שיקבע את גורלם.

כאשר במקרה של תאי נבט קדמוניים, חשוב מהיכן הם מגיעים בעובר התורם מכיוון שגורלם כבר נקבע. אם המטרה היא להשתיל תאי נבט קדמוניים, אז זה, התאים צריכים להיאסף משולי התקווה של העובר התורם, והם ממוקמים ממש ליד שולי העובר בארבעה אשכולות קטנים של כל אחד משלושה או ארבעה תאים בגיליון זה, שלב החנית הזה או שלב ההתפתחות הגבוה. ואתה צריך להרים אותם בזהירות רבה כדי לא להתחיל בטעות למצוץ את החלמון.

אוקיי, וזה מה שעשיתי שם, ועכשיו אני עובר לעובר מארח. כעת תאי הנבט הקדמוניים יתחדדו לאזור רכס איברי המין של כל עובר שבו הם נמצאים. אז אין צורך להשתיל את תאי הנבט הקדמוניים האלה לשוליים שהם יגיעו לשם בעצמם.

אז אני פשוט משתיל אותם ומחזיר אותם לכל מקום ישן לתוך העובר שלאחר העובר. המפתח להשתלת תאי נבט, שהוא ההפך הגמור מכל סוג אחר של השתלה, הוא שחשוב מהיכן מגיעים התאים התורמים. השתלת תאים למארח בשלב גסטרו מאפשרת לנסיין לנצל את מפת הגורל של דג הזברה שמתגלה כאשר המגן העוברי הופך לגלוי.

ניתן להבחין בין סוגי רקמות שונים כמו גם בין התחומים בתוך מערכת העצבים המרכזית המשוערת. כאשר מעבירים תאים בין עוברים בשלב רשימת הגסטרו, ישנן כמה וריאציות בפרוטוקול, אך ההליך הכללי דומה לעבודה עם בלסטוס להרכבה של גסטרו. תחילה יש למרוח פס אנכי של מתיל צלולוז בשקע של מגלשת שקע זכוכית, ואז להציף בכמות נדיבה של מדיית עובר של עט באמצעות העברת פיפטה מלוטשת באש.

תורם אחד ושלושה מארחי שלב מגן למגלשת הדיכאון. בחר עוברים תורמים מעט צעירים יותר מהמארחים. נדרש כלי חדש כדי לתפעל את דבק הגסטרוס, קצות חוט דיג באורך קצר של שני קילו לקצה צינור נימי.

וכך נוצר לולאה קטנה. השתמש בלולאה כדי לגלגל בעדינות את העוברים התורמים והמארחים כלפי מעלה על החלק העליון של רצועת המתיל צלולוז ודחף אותם לתוך המתיל צלולוז עד שהם בטוחים. גלגל אותם למקומם כך שהאזור הממוקד יהיה העליון.

מכיוון שבמהלך ההשתלה, המחט תיכנס לעובר באופן משיק כדי להעביר את התאים התורמים מבלי לפגוע באילק. השתלות בשלב גסטרו מבוצעות בצורה הטובה ביותר במיקרוסקופ מורכב בשלב קבוע. השתמש בפקדים של המניפולטור המיקרו כדי להביא את קצה מחט ההשתלה למיקוד.

מקם את מחזיק המיקרו פיפטה והמחט בזווית רדודה למדי כך שהמחט תהיה קרובה לאופקית ככל שקצה השקע במגלשה יאפשר. לאחר מכן, חודרים את העובר התורם. אם הוא מותקן כראוי, הוא לא יתגלגל עם כניסת מחט ההשתלה אלא אם כן העובר מבוגר מכדי לאפשר למחט לחדור בקלות.

כדי להימנע מניקוב האילק, המחט צריכה להיכנס לעובר במישור מוקד שהוא מעט עמוק יותר מזה של ה-EDL. לאחר הפירסינג, ניתן להסיר מספר רב של תאים מהתורם עבור עד שלוש זריקות של תא מארח. בעת ציור תאים, הימנע ממציצת החלמון על ידי הזזת המחט בזמן שהתאים נלקחים אם תרצה.

ניתן לקצור עוברים נוספים לתאים נוספים באמצעות אותה מחט לפני פליטת התאים למארח, במהלך פליטת התאים לעובר המארח להוציא את התאים בזמן שהמחט נמשכת דרך אזור המטרה בניגוד להפקדת התאים בגוש יחיד. זה יגדיל את הסבירות שתאי התורם יתרמו לרקמה הרצויה. לאחר השלמת העברות התאים, הניחו את כל המגלשה בצלחת פטרי והציפו אותה בזהירות בעובר עט. בינוני.

במהלך השעות הקרובות, המתיל צלולוז יתמוסס וישחרר את העוברים. מספר התאים המועברים תלוי במטרה הספציפית של הניסוי. ניתן להשתיל תאים מתורם יחיד לשלושה או ארבעה מארחים בבוקר שלאחר ההשתלה.

ניתן לבחון מארחים כדי לקבוע אם מיקוד תאי התורם היה מוצלח. השתלה מוצלחת של תאי נבט קדמוניים מגיל הבלסטולה מביאה לתאים בעלי תווית פלואורסצנטית, הממוקמים בגחון ליד הצומת בין ה-ylk להרחבת ה-ylk. אז זה עתה הראינו לכם כיצד לבצע השתלות גסטרולה ובלסטולה.

בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב לבחור את סוג ההשתלה הנכון עבור רקמת המטרה שאתה מקווה למקד עם התאים שלך. אז השתלת שלב בלסטולה מספיקה כדי לקבוע שהתאים הולכים לדרם לעומת האקטודרם. ואתה יכול גם להשתמש בטכניקה זו כדי למקד לתאי נבט קדמוניים.

אם תרצו לבצע מיפוי עדין יותר, עדיף להשתמש בהשתלת גיל גסטרוס שבה הצד הגבי כבר נקבע. וכך בטכניקה זו, אתה יכול למקד תאים לחלקים שונים של מערכת העצבים, בפרט, המוח הקדמי, המוח האמצעי, המוח האחורי וחוט השדרה. אז זהו.

תודה רבה על הצפייה ובהצלחה עם כל הניסויים שלך.