Name: שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: למד פרוטוקול קריופרזרבציה לזרע דג זברה בשיטת תפוקה גבוהה המשיג 25% פוריות בהפריה חוץ-גופית. השיטה מאפשרת שימור זרע ליותר משבע שנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 HG002995 &quot;עיבדו את הגנום דג הזברה: גישה הפוכה גנטיקה&quot; כדי CBM.

חלק א &#39;: פתרונות הקפאת זרע 1. גינסברג דגים האצבעות (לעשות טרי כל 3 ימים; גינזבורג, 1963) הערה: הזמנה של תוספת IS חשוב למנוע רטיבות בשנת 450 מ&quot;ל סטרילי ddH2O לפזר: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NaCl 3.25 גרם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.125 גרם KCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CaCl2 • 2 H2O 0.175 גרם ואז להוסיף: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NaHCO3 0.10 גרם </li></ul> תביאו נפח סופי 500 מ&quot;ל עם ddH2O חנות סטרילית ב 4 ° C. 2. בינוני הקפאה (בצע יומי טרי) <ol style="list-style-type:lower-roman;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא מתנול <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גינזבורג אצבעות דגים 10 מ&quot;ל (טמפ החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבקת חלב רזה 1.5 גרם </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מתנול הערה: הזמנה של תוספת IS חשוב למנוע רטיבות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים גינזבורג אצבעות 9 מ&quot;ל (טמפ &#39;חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנול 1 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבקת חלב רזה 1.5 גרם </li></ul> לאחר הרכבת התקשורת מקפיא, ומערבבים היטב במשך 20 דקות. על ההקפה שייקר או נדנדה. לפני השימוש, aliquot לתוך צינורות 1 מ&quot;ל Eppendorf, הימנעות בועות על פני השטח. </li></ol> חלק ב &#39;: חומרים הדרושים הקפאת זרע חומרים הדרושים הקפאת זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 pipettes הפנויה μl (חתול Fisherbrand # 22-358697) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוסות 250 מ&quot;ל מים דגים המכיל MESAB / Tricaine </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפות כוסות (חתול פיירקס # 9985-75) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P20 pipetman (או שווה ערך) טיפים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג בעל דגים (להחזיק זכר תוך סחיטה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביתור מיקרוסקופ עם תאורה מעל הבמה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שטוחים (למשל סוג Millipore) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.0ml קריוגני בקבוקונים (קורנינג חתול # 430488) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10X10 cryoboxes (Nalgene חתול # 03-337-7AA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלקר מיכל מלא ~ 15 ס&quot;מ של ice1 יבש כתוש דק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 מ&quot;ל חרוטי צינורות (פלקון # 352099) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיואר בקבוקון המכיל חנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לונג מלקחיים (למשל CMS פישר חתול בריאות # 10-316B) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryogloves </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור טנק לגברים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת צינור Eppendorf מלא עם התקשורת ללא הקפאה מתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת צינור Eppendorf מלא עם התקשורת הקפאה עם מתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryofreezer (למשל טיילור Warton-K-series) </li></ol> 1 שיטה פשוטה להכנת קרח יבש כתוש דק הוא לעטוף אותו במגבת לכתוש אותו עם פטיש. שיטה יעילה יותר היא להשתמש במטחנת קרח יבש, למשל מודל קלוסון RE-2. חלק ג&#39;: שיטת הקפאת זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרק צינורות נימי: לפני ההתחלה, לסמן את צינורות נימי 10μl עם עט במעבדה ברמה של μl 3.33 (כלומר 16.7 מ&quot;מ מלמטה; איור 1.1).. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים זכר: זכר מקום (ות) בכוס המכילה MESAB / tricaine מדולל במים דגים (מתכון של &quot;ספר דג הזברה&quot;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים מיובשים: הרדים פעם, להרים דג מחוץ הרדמה בעזרת כף פלסטיק בעדינות כתם דג יבש על מגבת נייר, תשומת לב מיוחדת ייבוש בצד הגחון. מי מפעיל זרע כך חשוב ביסודיות יבש סביב הביב. מיקום דגים מחזיק ספוג, למעלה בצד הגחון (איור 1.2). אם האזור מסביב סנפיר אנאלי עדיין לח, יבש בעדינות עם kimwipe. יש להיזהר שלא לסחוט זרע בטרם עת! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מסומן צינור נימי מתאם הפה גומי פיפטה הכלול צינורות נימי. המתאם הוא צינור גומי בעל שופר בצד אחד בעל נימי מאידך. לחילופין, צינור נימי ניתן לחבר מזרק המילטון 50μl באמצעות פיסת קצר tygon צינורות בקוטר המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום זכר תחת היקף ולחשוף את פתיחת ואברי המין בקפידה על ידי הפצת סנפירי גחון בנפרד באמצעות קצה צינור נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים זרע: לגרש זרע ידי מלטפים בעדינות את צידי הדג עם מלקחיים חלקה (למשל Millipore), או על ידי לוחץ בעדינות את צידי הדג בין האצבע המורה והאגודל. איסוף הזרע בתוך צינור נימי כפי שהוא גירש באמצעות שאיבה עדינה (איור 1.2). הימנע צואה שעשויים להיות מגורש עם הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את נפח הזרע 3.3 μl: אם את נפח מגיע ל זרע, או עולה סימן עט על צינור נימי (כלומר 16.7 מ&quot;מ או יותר), ולאחר מכן המשך לשלב 8. אם נפח הזרע אינו מגיע בנפח היעד, ואז לנרמל נפח לסמן באמצעות עט בינוני להקפיא ללא מתנול (איור 1.3). הסכום המינימלי של זרע כי מקובל משתנה עם איכות הזרע. הזרע הטוב הוא לבן אטום. זרע ירודה נראית מימית. באופן כללי, אנחנו מקבלים כמו מינימום: 1 זרע טוב μl (או 1 / 3 יעד) ו 2 הזרע עני μl (או 2 / 3 היעד). נפח הוא מנורמל כעת μl 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ADD CRYOPROTECTANT לזרע: להתחנף בינוני מקפיא עם מאתנול את סימן כתום (נפח כ הכולל הוא עתה 20 μl;. איור 1.4). לגרש תערובת זרע cryoprotectant על שטח נקי של זכוכית שעון, תשומת לב מיוחדת לא להכניס בועות. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ~ 4 פעמים (למנוע החדרת בועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 10μl הזרע אל כל אחד 2 CRYOVIALS: פיפטה 10 μl של הזרע: פתרון cryoprotectant לתוך התחתון של שני cryovials נפרד סומנו בתווית עם מידע רלוונטי (איור 1.5). נע במהירות, מבחנות כובע ושחרר אותם בתחתית בטמפרטורת החדר 15 מ&quot;ל פלקון צינורות אחד cryovial / צינור. שווי פלקון צינור והכנס את זוג cryovial המכילים צינורות פלקון לתוך קרח יבש כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת זרע 20 דקות. על קרח יבש: קרח יבש צריכים להיות בצורת אבקה דקה, לא כדורי. צינורות צריך להיות מוכנס לתוך הקרח היבש עמוק מספיק שרק כמוסות שלהם להראות (איור 1.6). כדי לעקוב אחר צינורות קרח יבש, לתת לכל זוג צינורות פלקון מספר 1-20 (שנכתב על כמוסות) ולהקליט את הזמן הם נכנסים קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CRYOVIALS המקום לבית חנקן נוזלי:. אחרי הזרע הוקפאה על קרח יבש במשך 20 דקות, ולהעבירם המכילים חנקן נוזלי בקבוק ויסקי. הזרע מאוחסן כאן עד למקום למקפיא חנקן נוזלי. כאשר הנחת בתיבות במקפיא, המקפיא מקום בתיבה בתוך אמבט של חנקן נוזלי, כך דגימות לא לחמם. שימוש במלקחיים מתכת ארוכה כדי להתאושש צלוחיות מבקבוקון ויסקי ולהתמודד עם cryogloves. לחלופין, cryovials ניתן להעביר ישירות לתוך תיבת במקפיא של קרח יבש אם תיבת במקפיא נשמר שקוע חנקן נוזלי במיכל קלקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryovials חנות ארוך טווח הקפאה בחנקן נוזלי קריוגני. כדי לשמור על יכולת הקיום של זרע, חשוב צלוחיות מאוחסנים שקוע חנקן נוזלי. מניסיוננו, צלוחיות מאוחסן בשלב אדי לאבד את יכולת הקיום לאורך זמן. מהירות חשוב! הזמן בין הוספת cryoprotectant ומיקום מבחנות הזרע קרח יבש (כלומר צעדים 60-10) צריך להיות לא יותר מ 30 שניות. </li></ol> חלק ד &#39;: שיטה הפריה במבחנה באמצעות זרע Cryopreserved אנו מוצאים כי זה עובד הכי טוב עם שני אנשים. אדם אחד סוחטת ביצים מן הנקבות, ואילו אדם אחר מפשירה את הזרע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט אמבטיה מים 33 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר cryovial מהמקפיא חנקן נוזלי כדי להעביר חנקן נוזלי המכיל עד בקבוק ויסקי מוכן להפשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסחוט מן הנקבות ביצים לתוך צלחת פטרי 35mm פלסטיק. אם אפשר, לנסות להשיג 3 מצמדים של ביצים לשלב לתוך צלחת אחת. אם אתה לא יכול לקבל שלוש הטלות טוב בתוך דקות 1 של המצמד הראשון שלך, ואז להמשיך לשלב 4 (אחד מצמד טוב מספיק). הגדרה של המצמד טוב:&gt; 150 ביצים נחמד להסתכל אחיד (צהבהב, כלומר בפסולת לא לבן מעיד על השפלה). שמור על צלחת מכוסה בעוד הזרע מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של חנקן נוזלי ולהסיר הכובע. בקבוקון לטבול במהירות ~ 1 / 2 הדרך אל 33 ° C אמבט מים במשך 8-10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות 70 μl בטמפרטורת החדר הנקס על הבקבוקון ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. מיד מוסיפים ביצים ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא דיחוי, להפעיל זרע וביצים על ידי הוספת 750 μl מים ודגים. מערבולת לערבב. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות, למלא צלחת עם מים דגים צלחת לדגור על 28 ° C. לאחר 2-3 שעות, ספירה והעברת עוברים פורייה למנות 100mm (50/dish). הרוזן ביצים פוריות, כך תדירות הפריה ניתן לקבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשמרי על עצמך טוב של הזחלים! במשך 5 הימים הראשונים, שינוי יומי מים ולהסיר עוברים מתים. שים הזחלים רק כי יש שלפוחיות לשחות לחדר הילדים ביום 5. </li></ol> חלק ה: נציג תוצאות השתמשנו במתודולוגיה זו crypreservation לעשות ספריה של 8600 דגימות זרע קפוא לעבד בין השנים 2001 ו - 2003. יש לנו מופשר 106 דגימות אלה וקבע הפוריות שלהם. פריון הוא היחס בין העוברים קיימא המיוצרים הפריה חוץ גופית ב מחולק במספר הכולל של ביצים שהיו מופרות עם הזרע הקפוא. טרי (לא cryporeserved) זרע בדרך כלל יש&gt; פוריות 95%; זרע cryopreserved יש פוריות נמוכה הרבה יותר: ממוצע של 29% (n = 106 בקבוקונים). השתנות הבקבוקון אל הבקבוקון בפריון הוא גדול, החל פחות מ -1% ל גבוה ככל 62%. השתנות זו מיוצגת על ידי הסורגים שגיאה גדולה המייצג סטיית תקן באיור. 2. עם זאת ב 106 דגימות זרע מופשר עד כה חווינו רק פעם אחת 0% פוריות הן דגימות הזרע הצליחו לשחזר את המוטציה לעבד המקביל. לפי הפשרה מבחנות הזרע מהספרייה שלנו במשך מספר שנים (2001-2008) מצאנו כי הפריון הממוצע של דגימות זרע קפוא בשיטה זו נותרתלאורך זמן יציבה (איור 2). הפריון הממוצע של דגימות זרע קפוא מופשר בשנת 2001 היה 23.5% (בהתבסס על 11 דגימות זרע) ובשנת 2008 היה 25% (בהתבסס על 21 דגימות זרע). מספר חוקרים אחרים כיום באמצעות פרוטוקול זה הקפאת זרע במעבדות שלהם. אחדים דיווחו על הצלחה טובה עם שיעורי פריון המדגם ל-מדגם השתנות דומה למה צפינו. אחרים נכשלו הדיווחים לבצע פרוטוקול עבודה זה בידיהם. אנו מאמינים כי מקורות סביר של בעיות הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אי להשתמש cryovials המדויק או צינורות חרוטי שהצענו בפרוטוקול, המוביל שיעור שונה של קירור כאשר בקרח יבש; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אי להשתמש בקרח יבש אבקת, המוביל שיעור תת אופטימלית קירור; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגים זכרים עם עניים פוריות: אתה צריך לקבל לפחות 1 μl של זרע גברי אחד. ניתן גם לבדוק את פוריות הגבר על ידי ביצוע הפריה חוץ גופית עם זרע טרי, אולם זה יכול להיות מטעה כי זה לוקח זרע טרי מעט מאוד להתקרב פוריות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תת תקן איכות הביציות בהפריה חוץ גופית בבית. באמצעות כל דבר אבל מצמדים מושלמת תמיד מוביל ליד פוריות 0%, אפילו דגימות זרע כי למעשה יש פריון טוב (מבוסס על הפוריות של הבקבוקון כפולות). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי של מתודולוגיה הקפאת זרע. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Cryopreserved פוריות הזרע נשאר יציב לאורך זמן. פוריות אחוז הוא מספר עוברי קיימא המיוצרים הפריה חוץ גופית ב מחולק במספר הכולל של ביצים שהיו מופרית עם זרע קפוא. &quot;N&quot; מתייחס למספר צלוחיות של זרע cryopreserved אשר פוריות נבדק בשנה המקבילה. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן. מאז כל בקבוקון זרע הוא מן זכר אחר, בקבוקון ל-בקבוקון השתנות הוא ציין.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

מספר חוקרים אחרים כיום באמצעות פרוטוקול זה הקפאת זרע במעבדות שלהם. אחדים דיווחו על הפוריות דומה ואת השתנות מדגם זהה ל-לדוגמה ראינו. אחרים נכשלו הדיווחים לבצע פרוטוקול עבודה זה בידיהם. אנו מאמינים כי מקורות סביר של בעיות הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אי להשתמש cryovials המדויק או צינורות חרוטי שהצענו בפרוטוקול, המוביל שיעור שונה של קירור כאשר בקרח יבש; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אי להשתמש בקרח יבש אבקת, המוביל שיעור תת אופטימלית קירור; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגים זכרים עם עניים פוריות: אתה צריך לקבל לפחות 1 μl של זרע גברי אחד. ניתן גם לבדוק את פוריות הגבר על ידי ביצוע הפריה חוץ גופית עם זרע טרי, אולם זה יכול להיות מטעה כי זה לוקח זרע טרי מעט מאוד להתקרב פוריות 100%. גדולה יותר, הזכרים צבעוניים יותר וחסונה בדרך כלל לתת זרע באיכות גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תת תקן איכות הביציות בהפריה חוץ גופית בבית. באמצעות כל דבר אבל מצמדים מושלמת תמיד מוביל ליד פוריות 0%, אפילו דגימות זרע כי למעשה יש פריון טוב (מבוסס על הפוריות של הבקבוקון כפולות). </li></ol>

<table><tbody><tr><td>פיפטים חד-פעמיים של 10 &amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>זכוכיות שעון</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות קריוגניות של 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>קריובוקסים 10 x 10</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות קוניות של 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא קריוגני</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>לדוגמה</td></tr></tbody></table>

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

זוהי שיטה cryopreservation זרע דג הזברה כי הוא עיבוד של שיטת הארווי (הארווי et al., 1982). יש לנו הציג שני שינויים בפרוטוקול המקורי הן לייעל את ההליך מדגם אחידות להגדיל. ראשית, עלינו לנרמל את כל אמצעי האחסון באמצעות מדיה הקפאת זרע כי אינו מכיל את cryoprotectant. זרע שנית, cryopreserved מאוחסנים cryovials במקום צינורות נימי. שיעורי זרע קפוא מפשיר (δ ° C / שעה) הם ככל הנראה שני המשתנים הקריטיים ביותר לשלוט בהליך זה. מסיבה זו, אין תחליף צינורות שונים לאלה שצוינו. עבודה בצוותים של 2 אפשר להקפיא את הזרע של 100 גברים לכל צוות ~ 2 שעות. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% בפריון (כפי שנמדד במספר העוברים קיימא שנוצר הפריה חוץ גופית מחולק במספר הכולל של ביציות מופרות) וזה פוריות אחוז יציב לאורך שנים רבות.

זהו תפוקה גבוהה cryopreservation זרע פרוטוקול דג הזברה. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% פוריות הפריה חוץ גופית לאחר מכן והוא יציב לאורך שנים רבות.

זוהי שיטה להקפאה ושימור (cryopreservation) של זרע דגי זברה, המהווה התאמה של שיטת Harvey ‏(Harvey et al., 1982). הכנסנו שני שינויים ל...

שלום, אני ברוס דרייפר מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס, ואני ססיליה מואנס מהחטיבה למדעים בסיסיים במרכז לסרטן פרד האצ'ינסון בסיאטל. היום, ססיליה ואני נדגים את הפרוטוקול לשימור בהקפאה (קריו-שימור) של זרע דג זברה, המהווה שינוי של הפרוטוקול המקורי של בריאן הארווי. נראה לכם כי בעבודה בצוותים של שניים, ניתן לבצע קריו-שימור לזרע מ-100 זכרים בודדים בפחות משעתיים.בעוד שקיים טווח רחב של פוריות לאחר ההפשרה, בממוצע אנו מקבלים פוריות של 25%, וזאת מספרייה שנשמרה בהקפאה למשך למעלה משבע שנים. לכן, בואו נתחיל. לפני ביצוע הליך זה, הכינו תחילה את תמיסות הקפאת הזרע.מכינים תמיסת Ginsburg Fish ringer טרייה מדי שלושה ימים, ואת תמיסת ההקפאה מכינים מדי יום, עם ובלי מתנול. את הרכבן של תמיסות אלו ניתן למצוא במידע המשלים המקוון המצורף לפרוטוקול זה. החומרים המשמשים בהליך זה עשויים להשפיע על קצב ההקפאה וההפשרה, אשר בתורם עשויים להשפיע על פוריות הזרע שהוקפא.מסיבה זו, רשימה של חומרים מומלצים מסופקת גם כמידע מקוון משלים. מומלץ להקפיא את הזרע על קרח יבש גרוס דק, בניגוד לגרגרי קרח יבש. דרך פשוטה אחת לגרס קרח יבש היא לעטוף אותו במגבת ולרסק אותו בעזרת פטיש.שיטה יעילה יותר היא שימוש במטחנה של קרח יבש, כגון דגם Claws RE two, להקפאת זרע של דגי זברה. ראשית, סמנו צינוריות נימיות של 10 µL באמצעות טוש למעבדה בגובה של 3.33 µL, או כ-16.7 mm מהתחתית. כדי להרדימ את הזכרים, מקמו שני עד ארבעה זכרים בכלי כימי המכיל תמיסת Tricaine מדוללת במי דגים. את המתכון ניתן למצוא בספר דג הזברה.לאחר ההרדמה, הסירו את הדגים מהחומר המרדים בעזרת כף פלסטיק וייבשו אותם בעדינות בעזרת נייר סופג. שימו דגש מיוחד על ייבוש הצד הוונטרלי. מים מפעילים את תאי הזרה, ולכן קריטי לייבש היטב את האזור שסביב ה-ika.הניחו את הדג על מחזיק הספוג כאשר הצד הגחוני (ventral side) פונה כלפי מעלה. אם האזור שסביב הסנפירים הבטניים עדיין לח, ייבשו אותו בעדינות בעזרת נייר ניגוב מסוג Kim wipe. הכניסו את צינור הנימי המסומן למתאם פיית גומי למשאבה, המצורף לצינורות הנימיים.המתאם הוא צינור גומי שקציו האחד כולל פיה והקצה השני כולל מחזיק לקפילריה. לחלופין, ניתן לחבר את צינור הקפילריה למזרק המילטון של 50 µL. בעזרת קטע קצר של צינור טיגון (tigon tubing) בקוטר המתאים, מקמו את הזכר תחת המיקרוסקופ וחשפו את פתח המערכת השתןית-מין על ידי הרחקה זהירה של סנפירי האגן.בעזרת קצה צינור הנימי, הוצא את הזרע על ידי החלקות עדינות של דפנות הדג באמצעות פינצטה חלקה, או על ידי לחיצה עדינה על דפנות הדג עם האגודל והאצבע; אסוף את הזרע לתוך צינור נימי בעת פליטתו באמצעות שאיבה עדינה. הימנע מצואה שעלולה להיפלט יחד עם הזרע. נפח הזרע המיועד הוא 3.3 µL.הכמות המינימלית המקובלה של זרע משתנה בהתאם לאיכותו של הזרע. זרע איכותי הוא לבן ואטום, בעוד שזרע דליל נראה מימי. באופן כללי, הכמות המינימלית המקובלה של זרע היא 1 µL של זרע איכותי או שליש מהיעד, ו-2 µL של זרע דליל או שני שלישים מהיעד.אם נפח הזרע אינו מגיע לנפח המטרה של 3.3 microliters, יש לנרמל את הנפח עד לסימון העט באמצעות מדיום הקפאה ללא methanol. אם נפח הזרע כבר מגיע לסימון העט על צינור הנימי או עולה ממנו, עברו לשלב הבא. כעת הוסיפו את הקריו-פרוטקטור לזרע.שאבו את מדיום ההקפאה עם המתנול עד לסימון הכתום. הנפח הכולל המשוער הוא כעת 20 microliters. העבירו את תערובת הזרע והקריו-פרוטקטור לאזור נקי של זכוכית שעון, וערבבו בעדינות על ידי שאיבה והנפקה עם הפספט כארבע פעמים, תוך הימנעות מהכנסת בועות.חלק את הזרע לשתי מבחנות קריו באמצעות פפיטציה של 10 µL של תמיסת הגנה לקריו-שימור של זרע לתחתית כל מבחנה מסומנת. סגור במהירות את מכסי המבחנות והנח כל מבחנת קריו בתוך מבחנת פלקון של 15 mL נפרדת. בטמפרטורת החדר, סגור את מכסי מבחנות הפלקון והכנס אותן לתוך קרח יבש דק.יש להחדיר את המבחנות לעומק מספיק כדי שרק הפקקים יבלטו, לצורך מעקב אחר מבחנות הפלקון. יש למספר אותן ולתעד את השעה שבה כל מבחנה הוכנסה למקרר הקרח היבש. יש להמתין 20 דקות להקפאת הזרע בקרח היבש.לאחר הקפאת הזרע, העבירו את שני מבחנות הקריו (cryo vials) אל בקבוק דואר (doer flask) המכיל חנקן נוזלי. לאחסון זמני. הניחו את קופסת ההקפאה באמבט חנקן נוזלי כדי למנוע מהדגימות להתחמם.השתמשו במלקחי מתכת ארוכים כדי להוציא את המבחנות מבקבוק הדואר וטפלו בהן באמצעות כפפות קריוגניות. לחלופין, ניתן להעביר את מבחנות הקריו ישירות מהקרח היבש למקפיא. אם קופסת המקפיא נשמרת טבולה בחנקן נוזלי בתוך מיכל פוליסטירן לאחסון לטווח ארוך, הניחו את מבחנות הקריו במקפיא חנקן נוזלי קריוגני.על מנת לשמור על חיוניותם של תאי הזרע, חיוני שהמבחנות יאוחסנו כשהן טבולות בחנקן נוזלי; מבחנות המאוחסנות בשלב האדים עלולות לאבד מחיוניותן עם הזמן. מהירות הפעולה היא קריטית אף היא לשמירה על חיוניות הזרע. הזמן שחולף בין הוספת חומר ההגנה מהקפאה (cryoprotectant) לבין הנחת מבחנות הזרע על קרח יבש לא יעלה על 30 שניות בהפריה חוץ גופית (In vitro fertilization).שימוש בזרע המשומר בהקפאה עובד בצורה הטובה ביותר עם שני אנשים. אדם אחד סוחט ביצים מהנקבות בעוד שהשני מפשיר את הזרע. הגדירו אמבט מים ל-33 °C.הוציאו מבחנה קריוגנית ממקפיא החנקן הנוזלי והעבירו אותה למכל או לבקבוק המכיל חנקן נוזלי עד למועד ההפשרה. סגננו ביצים מנקבות שהורדמו לתוך פטריה מפלסטיק בקוטר 35 מילימטר. תהליך זה מתואר בפירוט בפרוטוקול JoVE שכותרתו Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, המספק תיאור מפורט של דגי זברפיש.בהפריה חוץ גופית (In vitro fertilization), מקבץ ביצים טוב מכיל יותר מ-150 ביצים שהן אחידות ובעלות גוון צהבהב. כל שיירי פספת לבנים מעידים על דגרדציה. במידת האפשר, נסו להשיג שלושה מקבצי ביצים ולאחד אותם לכלי אחד.אם לא התקבלו שלוש קבוצות תאים איכותיות תוך דקה מרגע קבלת הקבוצה הראשונה, יש להמשיך לשלב הבא. יש להשאיר את הצלחת מכוסה בזמן הפשרת הזרע. בינתיים, הוצא את המבחנה מהחנקן הנוזלי והסר את הפקק.טבלו במהירות את המבחנה עד מחציתה במקלח מים בטמפרטורה של 33 °C למשך שמונה עד 10 שניות. הוסיפו במהירות 70 µL של תמיסת מלח buffered של Hank's בטמפרטורת החדר למבחנה וערבבו באמצעות פיפוט מעלה ומטה; הוסיפו מיד לביצים בצלחת הפטרי וערבבו בעדינות עם קצה הפיפטה. לאחר מכן, הפעילו מיד את תאי הזרע והביצים על ידי הוספת 750 µL של מי דגים, סובבו לערבוב והדגרירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר חמש דקות, מלאו את הצלחת בדגים ובמים, והדגירו בטמפרטורה של 28 °C. לאחר שעתיים עד שלוש שעות, ספרו והעבירו עוברים חיוניים לצלחות של 100 millimeter, בקצב של 50 עוברים לצלחת. כמו כן, ספרו את הביצים המופרות כדי שניתן יהיה לקבוע את פוריות דגימת הזרע.פוריות זרעים היא היחס בין מספר העוברים החיוניים למספר הכולל של הביצים ששימשו להפריה חוץ גופית. ניתן למיין את הביצים בכל זמן בין שעתיים לשש שעות לאחר ההפריה חוץ הגופית. כאשר ניתן להבחין בקלות בין ביצים לא פוריות לעוברים חיוניים, הביצים הלא פוריות נראות שקופות ולא מחולקות.בבדיקה באמצעות תאורה שבירה (trans illumination) במיקרוסקופ סטריאו, הפוריות הממוצעת של זרע שהקפא בטמפרטורות נמוכות (cryopreserved) משתנה במידה רבה. עם זאת, ניתן להגיע לממוצע פוריות של 25% שנותר יציב לאורך מספר שנים. גרף זה מציג את אחוז הפוריות הממוצע של זרע שהוקפא בין השנים 2001 ל-2003 ונבדק עד לשנת 2008.הרגע הדגמנו שיטה בעלת תפוקה גבוהה לשימור בהקפאה של זרע דגי Zebrafish. בביצוע פרוטוקול זה, חשוב להשתמש בכל כלי הפלסטיק והציוד המומלצים, וכן להשתמש בקרח יבש דק וטחון במקום בכדורי קרח יבש. קריטי להשתמש בזרע וביצים באיכות גבוהה מאוד, ובמקרה של הביצים בעת ביצוע ההפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization), לאחר הפשרת הזרע, חשוב להשתמש במספר רב ככל האפשר של ביצים כדי לשפר את מספר העוברים הפורים שתקבלו בסיום התהליך, מה שעשוי לדרוש שלוש עד ארבע נקבות, נכון?מרכיב מפתח נוסף בפרוטוקול הוא המהירות. השלב מרגע הוצאת הזרע מהזכר ועד להצבתו בקרח היבש לא צריך לארוך יותר מדקה אחת בקירוב. ובכן, אני חושב שזה הכל.בהצלחה בניסויים שלכם.

a-high-throughput-method-for-zebrafish-sperm-cryopreservation-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור כל הר באתרו הכלאה של RNA ניתוח ב-דג זברה והיווצרות שפופרת שיטת החולה-נגזר המושרה תא גזע מתאים הנגזר ללמוד את התפקיד של אנגלין במערך כלי הדם.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ אור בעלות נמוכה להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה, המאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של רעילות לב התפתחותית ללא צורך במערכות הדמיה מתקדמות.

הדמיית לב תפקודית בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית וניתוח וידאו: יישומים במחקר סביבתי וביו-רפואי

למד פרוטוקול קריופרזרבציה לזרע דג זברה בשיטת תפוקה גבוהה המשיג 25% פוריות בהפריה חוץ-גופית. השיטה מאפשרת שימור זרע ליותר משבע שנים.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

גלה סרטונים נוספים