שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

היי, אני ברוס דרייפר מאוניברסיטת קליפורניה דייוויס, המחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית, ואני ססיליה מואנס מהמחלקה למדע בסיסי במרכז לחקר הסרטן ע"ש פרד האצ'ינסון בסיאטל. היום, ססיליה ואני הולכים להדגים את פרוטוקול שימור הזרע של דג הזברה, שהוא שינוי של הפרוטוקול המקורי של בריאן הארווי. אנו נראה לכם שבעבודה בצוותים של שניים, ניתן לשמר בהקפאה זרע מ-100 זכרים בודדים תוך פחות משעתיים.

אמנם יש טווח רחב של פוריות בהפשרה, אך בממוצע אנו מקבלים 25% פוריות, וזה מספרייה שנשמרה בהקפאה במשך למעלה משבע שנים. אז בואו נתחיל. לפני ביצוע הליך זה, ראשית, הכינו את תמיסות הקפאת הזרע.

תמיסת רינגר הדגים של גינסבורג נעשית טרייה כל שלושה ימים, ומדיום ההקפאה נעשה טרי מדי יום עם ובלי מתנול. ניתן למצוא את הרכב הפתרונות הללו במידע המשלים המקוון הנלווה לפרוטוקול זה. החומרים המשמשים בהליך זה יכולים להשפיע על קצב ההקפאה וההפשרה, מה שבתורו יכול להשפיע על פוריות הזרע הקפוא.

מסיבה זו, רשימה של חומרים מומלצים מסופקת גם כמידע מקוון משלים. עדיף להקפיא את הזרע על קרח יבש כתוש דק בניגוד לכדורי קרח יבש. אחת הדרכים הפשוטות לרסק קרח יבש היא לעטוף אותו במגבת ולכתוש אותו בפטיש.

שיטה יעילה יותר היא להשתמש במטחנת קרח יבש כגון טפרים ודגם RE 2 כדי להקפיא זרע של דג הזברה. ראשית, סמנו צינורות נימיים של 10 מיקרוליטר עם עט מעבדה ברמה של 3.33 מיקרוליטר, או כ-16.7 מילימטרים מהקרקעית, כדי להרדים את הזכרים, הניחו שניים עד ארבעה זכרים בכוס המכילה טריקה, מדולל ומי דגים. את המתכון ניתן למצוא בספר דג הזברה.

לאחר ההרדמה, מרימים את הדגים מחומר ההרדמה בעזרת כף פלסטיק ומייבשים אותם בעדינות על מגבת נייר. שימו לב במיוחד לציור הצד הגחוני. מים מפעילים זרע ולכן קריטי לייבש היטב סביב האיקה.

מקם את הדג על הצד הגחוני של מחזיק הספוג כלפי מעלה. אם האזור סביב סנפירי האגן עדיין לח, יבשי אותו בעדינות עם מגבון קים. הנח צינור נימי מסומן במתאם פיפטה פה מגומי המצורף לצינורות הנימים.

המתאם הוא צינור גומי שיש לו פיה בקצה אחד ומחזיק נימי בקצה השני. לחלופין, ניתן לחבר את צינור הנימים למזרק המילטון בנפח 50 מיקרוליטר. בעזרת חתיכה קצרה של צינור טיגון בקוטר המתאים, הניחו את הזכר מתחת לסקופ וחשפו את הפתח האורוגניטלי על ידי פיזור זהיר של סנפירי האגן.

בעזרת קצה צינור הנימים, הביעו את הזרע על ידי ליטוף עדין של דפנות הדג במלקחיים חלקים או על ידי לחיצה עדינה על דפנות הדג באצבע מורה ואגודל, אספו את הזרע בצינור נימי כשהוא נפלט באמצעות יניקה עדינה. הימנע מצואה שעלולה להיפלט עם הזרע. נפח היעד של הזרע הוא 3.3 מיקרוליטר.

כמות הזרע המינימלית המקובלת משתנה בהתאם לאיכות הזרע. זרע טוב הוא לבן ואטום בעוד שזרע נקבוביות נראה מימי. באופן כללי, כמות הזרע המינימלית המקובלת היא מיקרוליטר אחד של זרע טוב או שליש מהמטרה, ושני מיקרוליטרים של זרע נקבובי או שני שליש מהמטרה.

אם נפח הזרע אינו מגיע לנפח היעד של 3.3 מיקרוליטר, יש צורך לנרמל את הנפח לסימן העט באמצעות מדיום הקפאה ללא מתנול. אם נפח הזרע כבר מגיע או עולה על סימן העט על צינור הנימים, המשך לשלב הבא. כעת הוסף את חומר ההקפאה לזרע.

מוצצים מדיום מקפיא עם מתנול עד לסימון הכתום. הנפח הכולל המשוער הוא כעת 20 מיקרוליטר. הוציאו את תערובת הזרע והקריופרוטקטנט לאזור נקי של זכוכית שעון מעורבבת בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כארבע פעמים והימנעו מהכנסת בועות.

הכניסו את הזרע לשני בקבוקוני קריו על ידי הזרמת 10 מיקרוליטר מתמיסת הקפאת הזרע לתחתית כל בקבוקון מסומן. בתנועה מהירה מכסים את הבקבוקונים וזורקים כל בקבוקון קריו לתוך שפופרת בז נפרדת של 15 מיליליטר. בטמפרטורת החדר, מכסים את צינורות הבז ומכניסים אותם לאבקת קרח יבש דקה.

יש להכניס את הצינורות עמוק מספיק כך שרק המכסים יראו כדי לעקוב אחר צינורות הבז. מספרו אותם ורשמו את הזמן שבו כל צינור נכנס לקרח היבש. הניחו לזרע לקפוא בקרח היבש למשך 20 דקות.

לאחר הקפאת הזרע, העבירו את שני בקבוקוני הקריו לתוך חנקן נוזלי המכיל בקבוק עושה. לאחסון זמני. הנח את קופסת ההקפאה באמבט של חנקן נוזלי כדי שהדגימות לא יתחממו.

השתמש במלקחיים ארוכים ממתכת כדי לשחזר את הבקבוקונים מבקבוק העושה ולטפל בהם בכפפות קריו. לחלופין, ניתן להעביר בקבוקוני קריו ישירות מהקרח היבש למקפיא. אם קופסת ההקפאה נשמרת שקועה בחנקן נוזלי במיכל קלקר לאחסון לטווח הארוך, הנח את בקבוקוני הקריו במקפיא חנקן נוזלי קריוגני.

כדי לשמור על כדאיות הזרע, חיוני שהבקבוקונים יאוחסנו שקועים בבקבוקוני חנקן נוזלי המאוחסנים בשלב האדים עלולים לאבד את הכדאיות עם הזמן. מהירות היא גם קריטית בשמירה על כדאיות הזרע. הזמן בין הוספת חומר ההקפאה לבין הנחת בקבוקוני הזרע על קרח יבש צריך להיות לא יותר מ-30 שניות הפריה חוץ גופית.

שימוש בזרע משומר בהקפאה עובד בצורה הטובה ביותר עם שני אנשים. אדם אחד סוחט ביציות מהנקבות ואילו האדם השני מפשיר את הזרע. הגדר אמבט מים ל-33 מעלות צלזיוס.

הוציאו בקבוקון קריו ממקפיא החנקן הנוזלי והעבירו אותו לחנקן נוזלי המכיל D או בקבוק עד שהוא מוכן להפשרה. סוחטים ביצים מנקבות מורדמות לתוך צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 35 מילימטר. זה מתואר בפירוט בפרוטוקול JoVE שכותרתו Making Gyno Genetic Deployed Zebrafish by Early Pressure, המספק תיאור מפורט של דג הזברה.

הפריה חוץ גופית, מצמד טוב מכיל יותר מ -150 ביצים אחידות וצהבהבות. כל פסולת לבנה מעידה על השפלה. במידת האפשר, נסו להשיג שלושה מצמדים של ביצים ולשלב אותם למנה אחת.

אם לא מתקבלים שלושה מצמדים טובים תוך דקה אחת מהמצמד הראשון, המשך לשלב הבא. שמור את הכלי מכוסה בזמן שהזרע מופשר. בינתיים מוציאים את הבקבוקון מהחנקן הנוזלי ומסירים את המכסה.

טבלו במהירות את הבקבוקון באמצע הדרך באמבט מים של 33 מעלות למשך שמונה עד 10 שניות. מוסיפים במהירות 70 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר, תמיסת המלח של האנק לבקבוקון ומערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מוסיפים מיד לביצים בצלחת הפטרי ומערבבים בעדינות עם קצה הפיפטה. לאחר מכן הפעל מיד את הזרע והביצים על ידי הוספת 750 מיקרוליטר של מערבולת מי דגים כדי לערבב ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר חמש דקות ממלאים את התבשיל בדגים, מים ודוגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים-שלוש, ספור והעביר עוברים ברי קיימא לצלחות של 100 מילימטר ב-50 עוברים למנה. סמוך גם על ביציות מופרות כדי שניתן יהיה לקבוע את פוריות דגימת הזרע.

פוריות זרע היא היחס בין עוברים ברי קיימא למספר הביציות הכולל ששימש להפריה חוץ גופית. ניתן למיין ביציות בכל עת בין שעתיים לשש שעות לאחר הפריה חוץ גופית. כאשר ניתן להבחין בקלות בין ביציות עקרות לעוברים ברי קיימא, ביציות עקרות הן צלולות ולא מחולקות.

כאשר מסתכלים עם תאורת טרנס במיקרוסקופ סטריאו, הפוריות הממוצעת של זרע שמור בהקפאה משתנה מאוד. עם זאת, אמור להיות אפשרי לקבל ממוצע של 25% פוריות יציבה למספר שנים. גרף זה מציג את אחוז הפוריות הממוצע של זרע שהוקפא בין 2001 ל-2003 וחשב לאחרונה עד 2008.

זה עתה הדגמנו שיטה בעלת תפוקה גבוהה לשימור אפס זרע של דגים. בביצוע פרוטוקול זה, חשוב להשתמש בכל בלאי הפלסטיק והציוד המומלצים וכן להשתמש בקרח יבש כתוש כתוש ולא בכדורי קרח יבש. זה קריטי להשתמש בזרע וביציות באיכות גבוהה באמת, ובמקרה של הביציות בעת ביצוע ההפריה החוץ גופית, לאחר גידול הזרע, חשוב להשתמש במספר גדול ככל האפשר של ביציות כדי לשפר את מספר העוברים הפוריים שאתה מקבל בקצה השני, מה שיכול לקחת שלוש עד ארבע נקבות, ימין?

מרכיב מרכזי נוסף בפרוטוקול הוא מהירות. לעולם לא ייקח יותר מדקה לעבור משאיבת הזרע מהזכר להכנסתו לקרח היבש. ובכן, אני חושב שזהו.

בהצלחה בניסויים שלך.