ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת
30 ביוני 2009
זוהי שיטה להפקת דיפלואידי gynogenetic עוברי דג הזברה (אשר עוברים רק תרומה גנטית מגיע מהאם) על ידי חסימת חלוקת meiotic מחרה מחזיק אחריה מיד לאחר ההפריה עם זרע אור אולטרה סגול מומת. עוברים EP אינם הומוזיגוטים במלואה עקב רקומבינציה במהלך החלוקה meiotic הראשון, אולם הם הומוזיגוטים בכלל לוקוסים שלא היה מופרד centromere שלהם על ידי רקומבינציה.
שלום, אני שארלין ווקר מהמעבדה של צ'ארלס קימל באוניברסיטת אורגון, המכון למדעי העצבים. ואני גרגורי וולש. אני עובד במעבדה של ססיליה מונס במחלקה למדעי הבסיס במרכז פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן.
היום נדגים בפניכם פרוצדורה ליצירת דגי זברה דיפלואידים באמצעות שיטת הלחץ המוקדם. שיטה זו משתמשת בלחץ הידרוסטטי כדי לדה-פולימריז את המיקרוטובולים בביצה שהופריה בזרע שהוקרן ב-UV, כאשר הפעולה מבוצעת בתזמון הנכון.
פעולה זו מונעת את פליטת הגוף הקוטבי השני, ובכך נוצר עובר דיפלואידי שהכרומוזומים ההומולוגיים שלו הם שני התוצרים של המיוזה הראשונה. טכניקה זו פותחה בתחילת שנות ה-70, כאשר עבדתי במעבדתו של George Reisinger באוניברסיטת אורגון. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בהליך זה במסכים גנטיים של שני דורות.
ניתן לסנן את הגמטות של דגי מוטגנים מדור F1 ישירות כדי לאתר מוטציות רצסיביות הגורמות לפנוטיפים התפתחותיים בצאצאים גיינו-דיפלואידיים הומוזיגוטים. מכיוון שדגי זברה מפגינים הפרעה גנטית גבוהה, אנו משתמשים בשיטה זו גם כדי למפות מוטציות לכרומוזומים ולהעריך את מרחקן מהצנטרומר. אם כן, נתחיל. בשעות אחר הצהריים המאוחרות, ביום שלפני הניסוי, הכינו את התנאים לאיסוף זרע על ידי הפרדת הזכרים והנקבות שיועמדו לסחיטה; ניתן להשתמש בזכרים מבוגרים שכן הם לא יתרמו חומר גנטי.
הנקבות צריכות להיראות גדולות ושמנות באזור הבטן, בעוד הזכרים צריכים להיראות צהובים ונמרצים. החזיקו את הזכרים והנקבות למשך הלילה במכלי אחסון נפרדים, כך שניתן יהיה להגיע אליהם בקלות בבוקר. בבוקר הניסוי, הכינו תמיסת Hank's והוסיפו נתרן ביקרבונט.
העבירו למתקן הדגים בתוך דלי קרח. תמיסת ה-Hank's תכלול trica, טיימר ומבחנות לאיסוף הזרע. לבסוף, לאחר ההגעה למתקן הדגים, דללו את ה-trica במי דגים.
זה ישמש להרדמת הדגים בשלב הבא. כדי להתחיל באיסוף הזרע, הכינו מבחנה נקייה של תמיסת Hank's על קרח. הכינו מספיק תמיסת hanks קרה, בערך 50 µL לכל זכר שיסחט, והרדימו זכר אחד או שניים בכל פעם.
באמצעות טבילה ותנידה, ניתן להוציא אותם מהחומר המרדים בעזרת כף פלסטיק. שטפו את הזכרים במים של דגים וייבשו אותם בטפיחות על נייר סופג. שלב זה קריטי ביותר כיוון שמים מפעילים את תאי הזרע.
לאחר שהם יבשים, מקבעו את הדגים במחזיק ספוג תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה עם תאורה עליונה (epi illumination). הפרידו את סנפירי הבטן בעזרת פינצטה ומקמו מיקרו-קפילרה בפתח הקלואקה כדי להתחיל באיסוף הזרע. לשו את צידי הדג בעדינות אך בנחישות באמצעות פינצטת mill Pour, וכאשר הזרע החלבי יוצא מנקב המין, אספו אותו לתוך המיקרו-קפילרה באמצעות שאיבה עדינה. שלפו את הזרע ממספר זכרים ושמרו אותו בקרח.
זרע של חמישה עד 10 זכרים בתמיסת Hank saline קרה מספיק להפריה של ביצים מ-20 עד 30 נקבות. זרע שנשמר ב-Hanks קר ימשיך להפריות ביצים ביעילות במשך מספר שעות.
אסוף מספיק זרע כדי להכין תרחיף עכור לצורך השבתת הזרע באמצעות UV. התחל במילוי תחתיתו של Petri dish מזכוכית בקרח. הנח זכוכית שעון מעל הקרח בתוך ה-dish.
בשלב הבא, השתמשו בפפיטה כדי להעביר את הזרע מהמבחנה אל זכוכית השעון. הקפידו לשאוב לפפיטה כמה שיותר מהזרע, ללא בועות אוויר. חשוב מאוד להימנע מיצירת בועות בזרע; פלטו את הזרע בשכבה דקה ואחידה על זכוכית השעון והשליכו את הפפיטה.
לאחר העברת הזרע, הניחו את צלחת הפטרי בתוך מכשיר UV crosslinker. הפעילו את ה-Crosslinker והגדירו את רמת האנרגיה למסירת 900 JUULs. לאחר הצלבת הקרינה, השתמשו בפיפטה נקייה כדי להוציא את הזרע מזכוכית השעון ולהעבירו לשפופרת פנדור המסומנת UV sperm והניחו אותה על קרח.
כדי להתחיל באיסוף ביצים, הרדימו תחילה שתי נקבות בכל פעם. ב-Trica, קריטי לא להשאיר את הדגים ב-trica זמן רב מדי, כיוון שהרדמה ממושכת עלולה להרוג את הדגים. לאחר מכן, שטפו את הדגים במי דגים וייבשו אותם בעזרת נייר סופג.
דבר זה הוא קריטי מכיוון שעודף מים יגרום לנפיחות של הביצים וימנע הפריה. מקמו את הנקבה בצלחת פטרי פלסטית בקוטר 35 מילימטר בעזרת אצבעות לחות אך לא רטובות. לחצו בעדינות אך בנחישות על הבטן.
אם הנקבה מוכנה להטיל ביצים, הן יצאו בקלות; אספו את הביצים בעזרת שפכטל והחזירו את הנקבה למים. ביצים תקינות הן בצבע צהבהב ושקוף למחצה, בעוד שביצים שנותרו בתוך הנקבה זמן רב מדי הן לבנות ומימיות. כדי להבטיח קבלת ביצים תקינות, אספו אותן במהלך השעתיים הראשונות לאחר הדלקת האורות במתקן הדגים, והשאירו את הביצים מכוסות כדי למנוע התייבשות.
לאחר איסוף הביצים, הוסיפו 30 עד 50 µL של תרחיף הזרע שעבר הקרנת UV לביצים וערבבו בעדינות בעזרת טיפ של פיפטה. הוסיפו מיד כ-1 mL של מי דגים והפעילו את הטיימר. ביצים שיושארו להתפתח בשלב זה יהיו haploids.
יש לבצע את השלבים הבאים בתוך 90 שניות מההפריה. הפעילו את הטיימר ברגע שהביצים מופעלות על ידי הוספת מים.
התזמון המדויק של המטפאזה במיוזה הראשונה תלוי בטמפרטורה. תזמון הפעלת והפסקת הלחץ מותאם ל-28.5 °C. לאחר הפעלת הטיימר, המתינו מספר רגעים, ולאחר מכן הוסיפו מים ושחלו את הביציות למרכז הצלחת.
באמצעות פסטור-פיפט (pasture pipette) קטום ומלוטש, העבירו את הביצים המופיות לבקבוקוני הלחץ במידת הצורך. הוסיפו מים לביצים לבקבוקון עד שהם כמעט גולשים, כך שתישאר טיפת מים בחלק העליון של הבקבוקונים. לאחר מכן, הניחו פקק גומי מעל טיפת המים ואבטחו את המכסה הפלסטי מעל הגומי.
הניחו את המבחנות הפוכות בתוך גליל הלחץ והוסיפו מי ביצים. כדי למלא מחדש את הגליל, סגרו את המכסה על הגליל בצורה מאובטחת. לאחר הסגירה, הניחו את הגליל במכבש כאשר הבוכנה פונה למעלה והפעילו לחץ של 8,000 pounds per square inch.
השאירו את הגליל במכבש עד שש דקות לאחר זמן ההפעלה, למשך זמן לחץ כולל של 4.5 דקות. שש דקות לאחר ההפעלה, הוציאו את הגליל מהמכבש. הוציאו את המבחנות מהגליל ויבשו אותן בזהירות כדי למנוע קירור של העוברים.
אפס את המבחנה ומלא אותה שוב במי ביצים. הכן את המבחנות הבאות על ידי מילוי חלקי במי ביצים לפי הצורך. חזור על שלבים אלו עבור כל סדרות הביצים.
השלינדר יכול להכיל עד שני מבחנות בו-זמנית, לכן ייתכן שתרצו לעכב את הפריה של הביצים בדקה עד שתי דקות כדי לבדוק אם נקבות אחרות שכבר נמצאות ב-trica נותנות ביצים. פעולה זו תסייע להאיץ את התהליך על ידי טיפול ביותר סדרות בבת אחת. כמו כן, אם תלחצו על הדגים בזמן שהמכבש נמצא בשימוש, הביצים עלולות להיות יבשות מדי מכדי להיות חיות עד שהמכבש יהיה שמיש שוב; 24 שעות לאחר הפריה, לעובר zebrafish הפלואידי יהיה גוף קצר וחסון, זנב קצר ומוח פחות מגובש.
עם זאת, לכולם יהיו אותם חלקי גוף, כגון סומיטים, חבל שדרה, עיניים ואוזניים. כמרכיבים דיפלואידיים, גם ההפלואידים והדיפלואידים מפגינים תנועות כפיפה ללא עיכוב סביב 24 שעות. לאחר ההפריה, לאחים דיפלואידים של EP יש זנבות ארוכים, מוחות מעוצבים היטב, והם אמורים להיות בעלי סיכויי הישרדות של כ-60% עד 70%.
אלה נראים דומים מאוד לביקורות הפרוסות שלא טופלו. בדרך כלל, סדרה של עוברי haplo תכיל תערובת של עוברים בעלי מראה תקין, עוברים מתים, וכל מצב שביניהם. היחס בין העוברים בעלי המראה התקין לאלו הפגומים משקף את הגנים המזיקים הנמצאים בגנום של הנקבה.
מוטציות קלות יחסית לזיהוי גם על רקע זה, מכיוון שיהיו מספר פרטים, עד 50%, בעלי אותה פנוטיפ מאפיין. חשוב לוודא שהעוברים המופקים בשיטה זו הם אכן OIDs אמיתיים; כביקורות, צרו מקבץ של ביצים דיפלואידיות נורמליות על ידי הפרשה של חלק מהזרע ללא השבתת UV, ומקבץ של עוברים הפלואידיים על ידי הפרשה של מקבץ ביצים שהופרו בזרע שעבר UV ללא ביצוע הליך ה-EP. הפלואידים אינם ברי-הישרדות לאחר יומיים עד שלושה ימים. עוברים שעברו EP אמורים להיראות כמו דיפלואידים נורמליים.
למרות שעלולים להופיע מספר מפלצות EP לא סדירות, שאיריות של דיפלואידים EP צריכות להיות חיוניות ברובם בשיעור של כ-70% עד 90%. נוכחותם של הפלואידים בשאירית ה-EP המיושמת מעידה על כשל בתהליך ה-EP, למשל, כשל במכבש בשמירה על הלחץ. נוכחותם של דיפלואידים בשאירית ההפלואידים מעידה על ביטול פעילות לא מלא של הזרע, למשל, כשל בחומר מקשר (crosslinker).
הרגע הדגמנו בפניכם כמה פשוט לבצע הפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization) בדגי זהב, וכיצד ליצור עוברים של דגי זהב דיפלואידים ממקור גנו-נקב על ידי עיכוב החלוקה המיוטית השנייה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי תזמון הלחץ הראשוני הוא מדויק וכי המכבש שומר על לחץ של 8,000 pounds per square inch לאורך כל הטיפול. ודאו כי המכבש שלכם מכויל.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירת עוברי דג זברה דיפלואידיים גינוגנטיים באמצעות לחץ הידרוסטטי לדפולימריזציה של מיקרוטובוליים בביציות שהופרו בזרע שהוקרן ב-UV. טכניקה זו מאפשרת יצירת עוברים שהם הומוזיגוטים בכל הלוקוסים שלא הופרדו מהצנטרומר שלהם על ידי רקומבינציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- גנטיקה
רקע
- עוברי זברופיש דיפלואידיים גינוגנטיים מופקים עם תרומה גנטית אימהית בלבד.
- השיטה כוללת חסימה של חלוקת המיוזה השנייה מיד לאחר ההפריה.
- זרע שהוקרן ב-UV משמש להפריה של הביציות.
- רקומינציה במהלך חלוקת המיוזה הראשונה משפיעה על ההומוזיגוסיות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה ליצירת דגי זברה דיפלואידים גינוגנטיים.
- בחינת ההשלכות של שיטה זו עבור מחקרים גנטיים.
- אספקת פרוטוקול שניתן לשחזר במעבדות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפעלת לחץ הידרוסטטי כדי לדפולימריז את המיקרוטובוליים.
- הפריה של ביציות באמצעות זרע שהוקרן ב-UV.
- עיתוי הפעלת הלחץ הוא קריטי להצלחת התהליך.
- תצפית על התפתחות העובר לאחר ההפריה.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של עוברים דיפלואידיים גינוגנטיים.
- העוברים מראים הומוזיגוזיות بلوקוסים שאינם מושפעים מרקומינציה.
- השיטה מדגימה הדירות לאורך סדרת ניסיונות.
- נדונות יישומים פוטנציאליים במחקר גנטי.
מסקנות
- שיטת הלחץ ההידרוסטטי יעילה ליצירת דגי זברה דיפלואידיים גינוגנטיים.
- טכניקה זו יכולה לשפר מחקרים גנטיים במודלים של דגי זברה.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את ההשלכות המלאות של שיטה זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
יצירת עוברים הומוזיגוטים דיפלואידיים של דגי זברה ישירות מנקבות הטרוזיגוטיות מאפשרת האצה של סריקת גנטיקה קדימה (forward genetic screening), בכך שהיא מאפשרת לסרוק נקבות F1 שעברו מוטגנזה לאיתור מוטציות רססיביות ללא צורך בהכלאה חיצונית. גישה זו מפחיתה את השקעת הזמן והמשאבים בתהליכי תיקוף מטרות על ידי הפקת עוברים שהם הומוזיגוטים ברוב הלוקוסים, מה שמקל על סריקה פנוטיפית מהירה והפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות חדשות. השיטה תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על השפעותיהן של מוטציות הומוזיגוטיות במערכת מודל של חולייתנים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות סריקה ישירה של נקבות F1 שעברו מוטגנזה, לצורך זיהוי פנוטיפים התפתחותיים רצסיביים בצאצאים דיפלואידיים הומוזיגוטים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בדורות של הצלבה חיצונית (outcrossing), ובכך מאיץ את זיהוי מוטציות מזיקות בגנים המטרה.
- ערך ניבוי: הומוזיגוטיות בלוכוסים קרובים לצנטרומר מאפשרת זיהוי מוטציות בתדירות של כ-50%, דבר התומך בזיהוי יעיל של מובילים (leads) ותיעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: ייצור עוברים אחידים גנטית המתאימים לבדיקות פנוטיפיות סטנדרטיות במסכי גנטיקה קדימה (forward genetic screens).
- ערך תפעולי: חיוניות גבוהה (60-90%) של עוברים דיפלואידיים של EP תומכת במערכי סריקה רחבי היקף עם תוצאות עקביות.
- מוכנות לבדיקה: העוברים מפתחים מורפולוגיה ותנועתיות נורמליות, מה שמאפשר כימות מהימן של פנוטיפים התפתחותיים בסריקות גנטיות או סריקות של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דגי זברה דיפלואידיים הומוזיגוטים מספקים מערכת רלוונטית למחלה לצורך תיקוף מטרות שזוהו בסריקות ראשוניות באמצעות שימור פנוטיפי.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת הערכה של מרחק המוטציה מהצנטרומר, נתון המשפיע על עוצמת האלל וההשפעה על המסלול לצורך תיקוף המטרה.
- מודל פרה-קליני: דגי EP דיפלואידיים בוגרים ופורים מאפשרים מחקרים רב-דוריים להערכת השפעות של מודולציית המטרה על ההתפתחות והפיזיולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת הלחץ המוקדם משתלבת ברצף הגילוי מהמוטגנזה ועד לסריקה פנוטיפית, ומאפשרת מעבר מהיר מזיהוי מוטנטים בדור F1 להערכת פנוטיפ הומוזיגוטית ללא עיכובים בין-דוריים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי יצירת עוברים הומוזיגוטים בלוקוסים שלא הופרדו על ידי רקומינציה, ובכך מבהיר את תפקוד הגן ומעורבותו במסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספק עוברים מוכנים לבדיקה עם חיוניות גבוהה וחדירות פנוטיפית, המאפשרים סריקות אמינות של תרכובות או של מדכאים/מעצבים גנטיים.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה כמותית של פנוטיפים התפתחותיים, כאשר שיעורי זיהוי המוטציות מספקים מידע על רמת הביטחון במטרה ועל גודל ההשפעה של האלל.
- מחקר תרגומי: דיפלואידים הומוזיגוטים מספקים מערכת רציפה משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, ובכך מפחיתים את שיעור הנשירה הנובע מאי-ודאות לגבי מנגנון המטרה.
- שימוש חוזר ארגוני: השיטה מהווה פלטפורמה הניתנת לשחזור ליצירת מודלים של חולייתנים הומוזיגוטים, והיא ישימה במגוון קמפיינים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת ההטרוגניות הגנטית ואפשרות לתצפית ישירה על השפעות של מוטציה הומוזיגוטית.
- ערך תפעולי: פרוטוקול סטנדרטי עם פרמטרים מוגדרים של לחץ (8,000 psi) ותזמון מבטיח שחזוריות בין מעבדות ומנות שונות.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של מטרות מזיקות באמצעות סריקה מואצת של מוטציות רצסיביות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים כמותיים על מודולציה של המטרה במערכת של חולייתנים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, מיקרו-הזרקה ותפעול תא לחה.
- תלוי בציוד לחץ הידרוסטטי מכויל המסוגל להגיע ל-8,000 psi ובמכשיר UV crosslinker לשבוב תאי זרה.
- מחייב בקרת תזמון קפדנית (הפעלת לחץ תוך 90 שניות לאחר ההפריה, ושמירה עליו למשך 4.5 דקות) כדי להבטיח דה-פולימריזציה של מיקרוטובוליים וחסימה של המיוזה II.
- ההתאמה למערכות מודל אחרות מוגבלת בשל תזמוני הרבייה ורגישות הלחץ הספציפיים ל-zebrafish.
- מגבלות מעשיות כוללות יעילות משתנה בהתבסס על תדירות הרקומינציה, כאשר לוקוסים טלומריים מראים הומוזיגוזיות של פחות מ-1%, דבר הדורש גישות מיפוי משלימות.
